玉米青貯瘤胃降解特性與蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系

王曉帆　張幸怡　郝小燕　高　紅　丁　雪　張永根　辛杭書

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，哈爾濱150030)

玉米青貯瘤胃降解特性與蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系

王曉帆張幸怡郝小燕高紅丁雪張永根*辛杭書*

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，哈爾濱150030)

摘要：本試驗旨在探索玉米青貯瘤胃降解特性與其蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的相關(guān)性，并建立擬合方程。試驗采用尼龍袋法測定11種玉米青貯的干物質(zhì)、蛋白質(zhì)以及中性洗滌纖維的瘤胃降解率，并對其降解特性進行計算，利用傅里葉變換紅外光譜(Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR)技術(shù)對玉米青貯樣品的蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)(酰胺Ⅰ帶、酰胺Ⅱ帶、α-螺旋、β-折疊)進行分析。結(jié)果表明，酰胺Ⅱ帶的峰高分別與干物質(zhì)有效降解率(DMED)極顯著相關(guān)(r=-0.71，P<0.01)，與中性洗滌纖維慢速降解部分的降解速率(NDFc)(r=-0.52，P<0.05)、不可降解部分(NDFu)(r=-0.46，P<0.05)顯著相關(guān)；酰胺Ⅰ帶、Ⅱ帶的峰高比分別與干物質(zhì)快速降解部分(DMa)(r=0.57，P<0.01)、慢速降解部分(DMb)(r=-0.55，P<0.01)極顯著相關(guān)，與蛋白質(zhì)不可降解部分(CPu)顯著相關(guān)(r=-0.50，P<0.05)，與蛋白質(zhì)有效降解率(CPED)趨于相關(guān)(r=0.38，P<0.10)；α-螺旋的峰高分別與干物質(zhì)不可降解部分(DMu)極顯著相關(guān)(r=0.59，P<0.01)，與蛋白質(zhì)快速降解部分(CPa)顯著相關(guān)(r=0.45，P<0.05)；α-螺旋和β-折疊的峰高比與干物質(zhì)慢速降解部分的降解速率(DMc)極顯著相關(guān)(r=0.59，P<0.01)，與蛋白質(zhì)慢速降解部分的降解速率(CPc)顯著相關(guān)(r=0.57，P<0.05)，與CPED顯著相關(guān)(r=0.43，P<0.05)；蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)與蛋白質(zhì)慢速降解部分(CPb)、中性洗滌纖維快速降解部分(NDFa)、慢速降解部分(NDFb)并無相關(guān)(P>0.10)。玉米青貯蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)對DMED(R2=0.50)、CPED(R2=0.48)擬合最好。初步證明，可以利用FTIR技術(shù)分析玉米青貯瘤胃降解特性與其蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的相關(guān)性，并建立回歸方程，同時利用二者的數(shù)量關(guān)系對玉米青貯的營養(yǎng)價值進行快速、非破壞分析，從而減少傳統(tǒng)化學(xué)分析耗時、費力、環(huán)境污染等缺點。

關(guān)鍵詞：瘤胃降解特性；傅里葉紅外光譜技術(shù)；蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)；相關(guān)性；多元回歸

反芻動物的飼養(yǎng)及營養(yǎng)需要要求對反芻動物采食的飼料進行養(yǎng)分利用率的優(yōu)化，即需要一個簡單、快速、精準的方法估測動物飼糧中飼料的營養(yǎng)價值[1-2]。目前主要是對反芻動物采食的飼料進行化學(xué)成分、瘤胃降解特性和消化特性的測定。瘤胃降解特性可以影響飼料的營養(yǎng)價值，也可以作為飼糧配方依據(jù)以滿足動物的能、氮平衡，從而同步瘤胃營養(yǎng)，提高微生物蛋白質(zhì)的合成和飼料利用率[3]。

Yu等[4]通過對具有相似化學(xué)組成的2種類型的大麥(麥芽型大麥和飼用型大麥)進行比較，發(fā)現(xiàn)二者瘤胃降解程度卻不同，麥芽型大麥的降解程度強于飼用型大麥。Liu等[5]在研究中發(fā)現(xiàn)不同品種的大麥雖然化學(xué)組成相近，但降解特性卻差異顯著。由此可見，傳統(tǒng)的化學(xué)分析方法在處理過程或測定過程中破壞了分子內(nèi)在結(jié)構(gòu)和理化特性，僅能測定出化學(xué)組分的相關(guān)信息，無法揭示蛋白質(zhì)內(nèi)在分子結(jié)構(gòu)與營養(yǎng)價值以及利用率的關(guān)系[6-7]。盧雁等[8]指出，傅里葉變換紅外光譜(Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR)技術(shù)是對蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)定量計算的強有力手段。FTIR分析技術(shù)是一種可以揭示飼料生物學(xué)分子結(jié)構(gòu)特點的快速、直接、破壞程度小的分析技術(shù)[7,9-13]。由于每個生物組分都有其特定的分子結(jié)構(gòu)信息，所以也存在獨特的光譜信息與之對應(yīng)。例如，蛋白質(zhì)分子光譜區(qū)域分為酰胺Ⅰ帶(主要由80%的C=O和20%的C—N伸縮振動組成)和酰胺Ⅱ帶(主要由60%N—H彎曲振動和40%的C—N伸縮振動組成)[14]。酰胺Ⅰ帶中蛋白質(zhì)分子的二級結(jié)構(gòu)主要包含α-螺旋、β-折疊和少量的β-轉(zhuǎn)角、無規(guī)則卷曲[15-18]。每一個官能團都與樣本的營養(yǎng)組分及生物學(xué)特性緊密相關(guān)。

所以，本文旨在利用FTIR技術(shù)對玉米青貯進行光譜掃描，在蛋白質(zhì)區(qū)域取得光譜特性，進而與其瘤胃降解特性進行相關(guān)及回歸分析，并構(gòu)建預(yù)測方程，以探索玉米青貯的蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)特性是否與其瘤胃降解特性存在一定的相關(guān)關(guān)系。

1材料與方法

1.1試驗材料

本試驗所選用的玉米青貯(n=11)采集于2014年5月至9月，采集地點為位于黑龍江省哈爾濱市、齊齊哈爾市、大慶市等地的奶牛養(yǎng)殖場，玉米種類見表1。

采集后的樣品經(jīng)過65 ℃烘干48 h，粉碎過100目網(wǎng)篩，用于光譜分析；粉碎過1 mm網(wǎng)篩，用于化學(xué)分析；粉碎過2 mm網(wǎng)篩用于瘤胃降解試驗。

表1　試驗樣品基本信息

1.2試驗動物與飼糧

試驗選用3頭裝有永久性瘤胃瘺管的健康荷斯坦奶牛，于東北農(nóng)業(yè)大學(xué)香坊實驗基地進行瘤胃降解試驗。試驗牛的飼糧參照我國奶牛飼養(yǎng)標準配制，試驗飼糧組成及營養(yǎng)水平見表2。試驗期間每日于08：00和16：00飼喂飼糧，自由飲水，單槽飼養(yǎng)。

1.3試驗方法

1.3.1常規(guī)養(yǎng)分的測定指標及方法

干物質(zhì)(dry matter，DM)、粗蛋白質(zhì)(crude protein，CP)的測定參照AOAC(1950)[20]的方法，中性洗滌纖維(neutral-detergent fiber，NDF)的測定參照Van Soest等[21]的方法。

1.3.2瘤胃尼龍袋法

根據(jù)Peng等[22]的瘤胃降解試驗方法，稱取7 g左右粉碎后的試驗樣品分別放入孔徑為50 μm、大小為10 cm×20 cm的已知重量的尼龍袋中，用尼龍繩距袋口2 cm處系好，使得每個袋子內(nèi)的樣品占袋子表面積的比例約為19 mg/cm2。每種樣品稱3個重復(fù)。在飼喂前按照“依次投入，同時取出”的原則，將稱好的尼龍袋隨機放入規(guī)格為45 cm×45 cm的瘤胃網(wǎng)兜中，并用90 cm長的繩子固定在瘤胃瘺管上，分別培養(yǎng)72、48、36、24、16、12、8、4、0 h。每頭牛、每個時間點瘤胃中尼龍袋的數(shù)目不超過28個。取出后的尼龍袋(包括0 h)放在自來水下沖洗，直至水澄清，并在65 ℃的條件下烘干48 h至恒重，記錄殘渣與尼龍袋的總重，然后粉碎過1 mm網(wǎng)篩，于封口袋中保存待測。

表2　試驗飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

1)每千克預(yù)混料中含有Contained the following per kg of the premix：VA 800 000 IU，VD 700 000 IU，VE 10 000 IU，F(xiàn)e 1 600 mg，Cu 1 500 mg，Zn 10 000 mg，Mn 3 500 mg，Se 80 mg，I 120 mg，Co 50 mg。

2)產(chǎn)奶凈能為參照文獻[19]方法所得計算值，其余為實測值。NELwas a calculated value according to the method of reference [19], while the other nutrient levels were measured values.

1.3.3中紅外光譜的檢測

試驗采用的儀器為BRUKER ALPHA中紅外光譜儀(德國布魯克光譜儀器公司)。

試驗參照焦培鑫等[23]的方法，在紅外烤燈照射的干燥條件下，以溴化鉀(光譜純)作為背景，將2 mg樣品與200 mg溴化鉀在瑪瑙研缽中充分研磨、混勻并進行壓片，放入光譜儀中進行讀取分析。光譜采集時儀器的設(shè)定參數(shù)參照Kim等[24]的報道。掃描范圍為700～4 000 cm-1(圖1)，掃描次數(shù)為128次，分辨率為4 cm-1，每個樣品重復(fù)裝樣5次(圖2)，重復(fù)2遍。

1.4數(shù)據(jù)分析與計算

1.4.1降解特性相關(guān)參數(shù)的計算

某成分瘤胃消失率(%)=100×(某成分質(zhì)量-

殘留物中某成分質(zhì)量)/某成分質(zhì)量。

根據(jù)?rskov等[25]提出的瘤胃動力學(xué)數(shù)學(xué)指數(shù)模型進行計算：

Y=a+b(1-e-ct)。

式中：Y為尼龍袋在瘤胃中滯留時間t后營養(yǎng)成分的瘤胃消失率(%)，a為快速降解部分(%)，b為慢速降解部分(%)，c為慢速降解部分的降解速率(%/h)，t為瘤胃滯留時間(h)，下式同。

不可降解部分(u，%)的計算公式為：

u=1-(a+b)。

飼料有效降解率(ED，%)的計算公式為：

ED=a+[(b×c)/(c+k)]。

式中：k為瘤胃外流速率，為0.031/h[26]。

1.4.2中紅外光譜分析

利用光譜處理軟件Ominic 8.2(Spectra tech，Madison，WI，USA)對光譜中蛋白質(zhì)區(qū)域酰胺區(qū)段(1 720～1 480 cm-1)進行分析，并分別對酰胺Ⅰ帶與酰胺Ⅱ帶進行基線校正。對酰胺Ⅰ帶區(qū)段進行二階導(dǎo)處理，并對二階導(dǎo)圖譜進行平滑，然后找到原光譜對應(yīng)的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)位置[27]：α-螺旋出現(xiàn)在1 658～1 648 cm-1波段；β-折疊出現(xiàn)在1 640～1 620 cm-1波段。本試驗分別對酰胺Ⅰ帶、酰胺Ⅱ帶的峰高、峰面積、峰高比、峰面積比，以及蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)α-螺旋、β-折疊的峰高、峰高比進行分析計算，探索玉米青貯蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)與其干物質(zhì)、粗蛋白質(zhì)以及中性洗滌纖維瘤胃降解特性是否存在相關(guān)關(guān)系。

1.4.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

用Excel 2010進行數(shù)據(jù)的初步整理，用SAS 9.2軟件中的PROC MIXED程序?qū)τ衩浊噘A瘤胃降解特性中的參數(shù)(快速降解部分、慢速降解部分、慢速降解部分的降解速率、不可降解部分、有效降解率)和蛋白質(zhì)分子光譜的數(shù)據(jù)(酰胺Ⅰ帶、酰胺Ⅱ帶的峰面積、峰高、峰面積比和峰高比，二級結(jié)構(gòu)α-螺旋、β-折疊的峰高、峰高比)進行分析，用PROC CORR 程序分析瘤胃降解特性與蛋白質(zhì)光譜數(shù)據(jù)的Pearson相關(guān)性(P<0.01、P<0.05、P<0.10和P≥0.10分別為極顯著相關(guān)、顯著相關(guān)、趨于相關(guān)和不相關(guān))，并用PROC REG程序進行多元回歸分析(R2<0.2、R2<0.4、R2<0.6和R2>0.6分別為弱擬合、中等擬合、中高度擬合和強擬合)。

圖1　11種玉米青貯蛋白質(zhì)光譜酰胺Ⅰ帶與酰胺Ⅱ帶的區(qū)域劃分

2結(jié)果與分析

2.1瘤胃降解特性與蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的總體信息

2.1.1瘤胃降解特性降解參數(shù)的信息

11種玉米青貯瘤胃降解參數(shù)的信息見表3。其中，干物質(zhì)瘤胃降解特性快速降解部分(DMa)為14.86%～32.80%，干物質(zhì)慢速降解部分(DMb)為43.58%～67.36%，干物質(zhì)慢速降解部分的降解速率(DMc)為1.46%～4.93%，干物質(zhì)不可降解部分(DMu)為11.75%～31.16%，干物質(zhì)有效降解率(DMED)為40.99%～54.58%。蛋白質(zhì)瘤胃降解特性快速降解部分(CPa)為35.80%～61.02%，蛋白質(zhì)慢速降解部分(CPb)為12.24%～46.09%，蛋白質(zhì)慢速降解部分的降解速率(CPc)為0.85%～7.07%，蛋白質(zhì)不可降解部分(CPu)為10.41%～44.66%，蛋白質(zhì)有效降解率(CPED)為45.85%～69.35%。中性洗滌纖維瘤胃降解特性快速降解部分(NDFa)為1.03%～22.70%，中性洗滌纖維慢速降解部分(NDFb)為46.34%～88.05%，中性洗滌纖維慢速降解部分的降解速率(NDFc)為1.23%～4.12%，中性洗滌纖維不可降解部分(NDFu)為8.81%～35.39%，中性洗滌纖維有效降解率(NDFED)為32.98%～47.59%。其中不同地區(qū)的玉米青貯瘤胃降解參數(shù)變異較大，為后續(xù)與蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的相關(guān)分析以及回歸擬合提供了良好的數(shù)據(jù)支持。

表3　玉米青貯瘤胃降解特性的數(shù)據(jù)匯總

續(xù)表3項目Items平均值Mean范圍Range最小值Minimum最大值Maximum標準差SDu/%32.8110.4144.669.73ED/%54.3445.8569.356.84中性洗滌纖維NDFa/%11.621.0322.707.39b/%64.8346.3488.0511.11c/(%/h)2.491.234.120.94u/%23.558.8135.399.43ED/%38.8632.9847.594.85

a為快速降解部分，b為慢速降解部分，c為b的降解速率，u為不可降解部分，ED為有效降解率。下表同。

a, rapidly degraded part; b, slowly degraded part; c, degradation rate of b; u, none degraded part; ED, effective degradability rate. The same as below.

2.1.2蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)參數(shù)的信息

11種玉米青貯蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的信息見表4。酰胺Ⅰ帶的峰面積(A_Ⅰ)范圍為4.66～11.68，酰胺Ⅱ帶的峰面積(A_Ⅱ)范圍為0.39～1.00，酰胺Ⅰ帶的峰高(H_Ⅰ)范圍為0.06～0.14，酰胺Ⅱ帶的峰高(H_Ⅱ)范圍為0.02～0.05，α-螺旋的峰高(α)范圍為0.05～0.10，β-折疊的峰高

(β)范圍為0.06～0.14，酰胺Ⅰ帶、Ⅱ帶的峰面積比(A_Ⅰ_Ⅱ)范圍為5.53～22.02，酰胺Ⅰ帶、Ⅱ帶的峰高比(H_Ⅰ_Ⅱ)范圍為1.72～4.34，α-螺旋和β-折疊的峰高比(α_β)范圍為0.58～1.00。其中不同地區(qū)的11種玉米青貯蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)參數(shù)變異較大。

表4　玉米青貯蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)光譜特性的數(shù)據(jù)匯總

A_Ⅰ為酰胺Ⅰ帶的峰面積；A_Ⅱ為酰胺Ⅱ帶的峰面積；A_Ⅰ_Ⅱ為酰胺Ⅰ帶、Ⅱ帶的峰面積比；H_Ⅰ為酰胺Ⅰ帶的峰高；H_Ⅱ為酰胺Ⅱ帶的峰高；H_Ⅰ_Ⅱ為酰胺Ⅰ帶、Ⅱ帶的峰高比；α為α-螺旋的峰高；β為β-折疊的峰高；α_β為α-螺旋與β-折疊的峰高比。下表同。

A_Ⅰ, peak area of amide Ⅰ; A_Ⅱ, peak area of amide Ⅱ; A_Ⅰ_Ⅱ, the ratio of amide Ⅰpeak area to amide Ⅱ; H_Ⅰ, peak height of amide Ⅰ; H_Ⅱ, peak height of amide Ⅱ; H_Ⅰ_Ⅱ, the ratio of amide Ⅰ peak height to amide Ⅱ; α, peak height of α-helix; β, peak height of β-sheet; α_β, the ratio of α-helix peak height to β-sheet. The same as below.

2.2瘤胃降解特性與蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的相關(guān)性分析

2.2.1干物質(zhì)瘤胃降解特性與蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的相關(guān)性

由表5可知，DMa分別與A_Ⅱ呈顯著負相關(guān)(r=-0.47，P=0.03)，與A_Ⅰ_Ⅱ呈顯著正相關(guān)(r=0.45，P=0.03)，與H_Ⅰ_Ⅱ呈極顯著正相關(guān)(r=0.57，P=0.006)。DMb分別與A_Ⅰ_Ⅱ趨于負相關(guān)(r=-0.37，P=0.09)，與H_Ⅰ_Ⅱ極呈極顯著負相關(guān)(r=-0.55，P=0.008)。DMc與H_Ⅱ趨于負相關(guān)(r=-0.37，P=0.09)，與α趨于正相關(guān)(r=0.37，P=0.09)，與α_β呈極顯著正相關(guān)(r=0.59，P=0.004)。DMu分別與α呈極顯著正相關(guān)(r=0.59，P=0.004)，與β呈趨于正相關(guān)(r=0.43，P=0.05)。DMED分別與A_Ⅱ、H_Ⅱ呈極顯著負相關(guān)(r=-0.61，P=0.003；r=-0.71，P=0.000 2)，與A_Ⅰ_Ⅱ呈顯著正相關(guān)(r=0.44，P=0.04)，與H_Ⅰ_Ⅱ呈極顯著正相關(guān)(r=0.61，P=0.003)。

2.2.2蛋白質(zhì)瘤胃降解特性與蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的相關(guān)性

由表6可知，CPa與α呈顯著正相關(guān)(r=0.45，P=0.04)，與H_Ⅰ_Ⅱ、α_β趨于正相關(guān)(r=0.37，P=0.09；r=0.39，P=0.07)。CPc分別與A_Ⅰ、β趨于負相關(guān)(r=-0.38，P=0.08；r=-0.38，P=0.08)，與A_Ⅰ_Ⅱ呈顯著負相關(guān)(r=-0.46，P=0.03)，與α_β呈顯著正相關(guān)(r=0.57，P=0.01)。CPu分別與A_Ⅱ呈顯著正相關(guān)(r=0.50，P=0.02)，與A_Ⅰ_Ⅱ呈顯著負相關(guān)(r=-0.48，P=0.03)，與H_Ⅰ_Ⅱ呈顯著正相關(guān)(r=0.50，P=0.02)。CPED分別與A_Ⅱ趨于負相關(guān)(r=-0.40，P=0.06)，與α、H_Ⅰ_Ⅱ趨于正相關(guān)(r=0.38，P=0.09；r=0.38，P=0.08)，與α_β呈顯著正相關(guān)(r=0.43，P=0.04)。

2.2.3中性洗滌纖維瘤胃降解特性與蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的相關(guān)性

從表7可知，NDFa與蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)無相關(guān)性(P>0.10)。NDFb與H_Ⅱ趨于正相關(guān)(r=0.39，P=0.08)。NDFc與H_Ⅱ呈顯著負相關(guān)(r=-0.52，P=0.01)，與α_β趨于正相關(guān)(r=0.39，P=0.08)。NDFu與H_Ⅱ呈顯著負相關(guān)(r=-0.46，P=0.03)。NDFED與α_β呈趨于正相關(guān)(r=0.42，P=0.05)。

2.3瘤胃降解特性與蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的回歸分析

2.3.1干物質(zhì)瘤胃降解特性與蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的回歸分析

由表8可知，H_Ⅰ_Ⅱ分別是擬合DMa和DMb回歸方程的最佳自變量，決定系數(shù)R2分別為0.32和0.30，屬中等擬合；α是擬合DMu的最佳自變量，R2=0.34，屬中等擬合；α_β是擬合DMc的最佳自變量，R2=0.35，屬中等擬合；H_Ⅱ與DMED擬合度較好，R2=0.50。

2.3.2蛋白質(zhì)瘤胃降解特性與蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的回歸分析

由表8可知，α可對CPa進行擬合，R2=0.20；未得到CPb與蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的擬合方程；α_β可中等擬合CPc，R2=0.33；H_Ⅰ_Ⅱ分別是擬合CPu與CPED的最佳自變量，R2分別為0.25和0.48，對CPED的擬合度最好。

2.3.3中性洗滌纖維瘤胃降解特性與蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的的回歸分析

由表8可知，蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)與NDFa、NDFb的相關(guān)性不強，故未得到擬合方程；H_Ⅱ可分別擬合NDFc與NDFu，R2分別為0.27和0.21；α_β可擬合NDFED，但擬合效果較弱，R2=0.18。

3討論

3.1干物質(zhì)瘤胃降解特性與蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系

蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)對DMb的擬合度好于DMa，這可能是由于DMa與蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的聯(lián)系相對于DMb更為密切。DMc與蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的相關(guān)性與Zhang等[27]的結(jié)論不完全相符，該試驗以空氣為背景，對樣品直接進行檢測的原理與本文一致，其結(jié)果的差異可能是由于研究的對象不同，該文獻研究的是玉米酒精糟及可溶物(DDGS)與無殼大麥組成的5種不同比例混合飼料與瘤胃降解特性的關(guān)系，由于飼料種類的不同，其營養(yǎng)價值也不一樣，故所反映的蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)與瘤胃降解特性的相關(guān)性也可能存在差異。

表5　玉米青貯干物質(zhì)瘤胃降解特性與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)光譜的相關(guān)性

r：相關(guān)系數(shù) correlation coefficient；P：P值P-value。

下表同。The same as below.

表6　玉米青貯蛋白質(zhì)瘤胃降解特性與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)光譜的相關(guān)性

表7　玉米青貯中性洗滌纖維瘤胃降解特性與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)光譜的相關(guān)性

表8　玉米青貯瘤胃降解特性與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)光譜的回歸關(guān)系

干物質(zhì)降解特性能與蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)建立聯(lián)系，且部分降解特性擬合度較好的原因可能是因為其與纖維中芳香族化合物振動有關(guān)，光譜范圍集中于1 498～1 587 cm-1[28]，存在于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)光譜區(qū)域內(nèi)，故二者存在一定的聯(lián)系。

3.2粗蛋白質(zhì)瘤胃降解特性與蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系

蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)光譜特性(酰胺Ⅰ帶、Ⅱ帶光譜強度、二級結(jié)構(gòu)的強度以及它們的比例)會影響粗蛋白質(zhì)的品質(zhì)和利用率[7,29-31]。這主要是因為蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)會影響與粗蛋白質(zhì)品質(zhì)和利用率有關(guān)的微生物和胃腸道消化酶的接觸。所以研究蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)，對粗蛋白質(zhì)的組成、品質(zhì)、以及瘤胃降解特性極其重要。飼料的粗蛋白質(zhì)瘤胃降解特性與其分子結(jié)構(gòu)聯(lián)系緊密[9]。

Liu等[5]在利用漫反射紅外光譜技術(shù)對6種大麥的外殼與籽粒之間不同降解特性研究時發(fā)現(xiàn)CPa與α-螺旋和β-折疊的峰高比呈顯著正相關(guān)，與本文結(jié)論一致，但未發(fā)現(xiàn)本文中提及的CPa與α-螺旋峰高顯著正相關(guān)，這可能由于蛋白質(zhì)來源不同、加工處理的方式不同帶來的差異。Zhang等[27]在研究中并未發(fā)現(xiàn)CPc與α-螺旋的峰高存在聯(lián)系，與本文一致，但本文CPc與β-折疊的峰高負相關(guān)、與α-螺旋與β-折疊的峰高比呈顯著正相關(guān)，與報道中的無相關(guān)不符。本研究中蛋白質(zhì)α-螺旋與β-折疊的峰高比與CPu無相關(guān)，與CPED顯著正相關(guān)的結(jié)論與焦培鑫等[23]、吳鵬華等[32]、Liu等[5]、Yari等[33]報道的一致，說明飼料蛋白質(zhì)α-螺旋與β-折疊的峰高比值越高，其有效降解率越高，且二者的擬合度較好。Zhang等[34]指出α-螺旋與β-折疊的峰高比與蛋白質(zhì)營養(yǎng)價值和利用率密切相關(guān)，但酰胺Ⅰ帶、Ⅱ帶的峰面積比并不完全與之相關(guān)，本研究中未見CPED與酰胺Ⅰ帶、Ⅱ帶的峰面積比的相關(guān)性，結(jié)論與Liu等[5]一致。

相對于大麥、燕麥、小麥來說，羽毛中含有高達84%的β-折疊，但蛋白質(zhì)的利用率卻最低，這與其β-折疊、角蛋白含量、二硫鍵含量等結(jié)構(gòu)特點密切相關(guān)[35]。證明植物性飼料蛋白的營養(yǎng)價值，不僅與蛋白質(zhì)種類、總蛋白質(zhì)和氨基酸的含量密切相關(guān)，也與瘤胃中蛋白質(zhì)對水解酶的敏感度有關(guān)，更與蛋白質(zhì)分子的自身結(jié)構(gòu)關(guān)系密切，其中β-折疊所占比例的高低通常和飼料與胃腸道消化酶接觸的多少有關(guān)。Yu[14]曾在研究不同加工方式對金黃色亞麻籽影響時發(fā)現(xiàn)，加熱處理會使蛋白質(zhì)與木質(zhì)素的連接增多，增加蛋白質(zhì)美拉德反應(yīng)的數(shù)目，同時隨蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)β-折疊的比例增加，蛋白質(zhì)的吸收利用也受到了影響。所以相似的蛋白質(zhì)含量，若其二級結(jié)構(gòu)α-螺旋、β-折疊的比例不同，也會使飼料的降解特性有所不同[12]，其中β-折疊的比例高通常導(dǎo)致飼料的營養(yǎng)價值低[4,7,11]。

3.3中性洗滌纖維瘤胃降解特性與蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系

中性洗滌纖維的瘤胃降解特性與碳水化合物光譜區(qū)域關(guān)系較為密切[36-37]，前人對于其與蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系研究較少。本研究的結(jié)果也表明，蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)與中性洗滌纖維瘤胃降解特性關(guān)聯(lián)較差，NDFa和NDFb均未得出擬合方程，對NDFED的擬合度也較低，其微弱的關(guān)系可能同樣是由于中性洗滌纖維中不被微生物利用的木質(zhì)素中芳香化合物的存在，而部分與芳香化合物分子振動相關(guān)的結(jié)構(gòu)受蛋白質(zhì)酰胺帶的干擾[38]。

4結(jié)論

① 利用FTIR技術(shù)可以獲得玉米青貯蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的光譜信息，并根據(jù)其與瘤胃降解特性的相關(guān)性，建立回歸方程。其中，玉米青貯蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)中酰胺Ⅱ帶的峰高與其干物質(zhì)瘤胃有效降解率極顯著相關(guān)，擬合度最好；酰胺Ⅰ帶、Ⅱ帶的峰高比和蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)(α-螺旋、β-折疊)的峰高比對蛋白質(zhì)瘤胃有效降解率擬合度最好；玉米青貯蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)對中性洗滌纖維瘤胃有效降解率擬合度較弱。

② 利用FTIR技術(shù)可同時分析飼料的多個瘤胃降解特性，分析速度快，具有常規(guī)試驗方法所不具有的優(yōu)點。玉米青貯蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)評定部分瘤胃降解特性可行，其對干物質(zhì)和蛋白質(zhì)瘤胃有效降解率評定效果最好。

參考文獻：

[1]ALDERMAN G,COTTRILL B R.Energy and protein requirements of ruminants:an advisory manual prepared by the AFRC technical committee on responses to nutrients[M].Wallingford,CAB International,1993.

[2]NRC.Nutrient requirements of dairy cattle[S].7th ed.Washington,D.C.:National Academy of Sciences,2001.

[3]CASPER D P,MAIGA H A,BROUK M J,et al.Synchronization of carbohydrate and protein sources on fermentation and passage rates in dairy cows[J].Journal of Dairy Science,1999,82(8):1779-1790.

[4]YU P,CHRISTENSEN D A,CHRISTENSEN C R,et al.Use of synchrotron FTIR microspectroscopy to identify chemical differences in barley endosperm tissue in relation to rumen degradation characteristics[J].Canadian Journal of Animal Science,2004,84(3):523-527.

[5]LIU N,YU P Q.Molecular clustering,interrelationships and carbohydrate conformation in hull and seeds among barley cultivars[J].Journal of Cereal Science,2011,53(3):379-383.

[6]YU P Q,JONKER A,GRUBER M.Molecular basis of protein structure in proanthocyanidin and anthocyanin-enhancedLc-transgenic alfalfa in relation to nutritive value using synchrotron-radiation FTIR microspectroscopy:a novel approach[J].Spectrochimica Acta Part A,2009,73(5):846-853.

[7]YU P.Application of advanced synchrotron radiation-based Fourier transform infrared (SR-FTIR) microspectroscopy to animal nutrition and feed science:a novel approach[J].British Journal of Nutrition,2004,92(6):869-885.

[8]盧雁,張瑋瑋,王公軻.FTIR用于變性蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的研究進展[J].光譜學(xué)與光譜分析,2008,28(1):88-93.

[9]YU P Q,MCKINNON J J,CHRISTENSEN C R,et al.Using synchrotron-based FTIR microspectroscopy to reveal chemical features of feather protein secondary structure:comparison with other feed protein sources[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,2004,52(24):7353-7361.

[10]YU P,MCKINNON J J,SOITA H W,et al.Use of synchrotron-based FTIR microspectroscopy to determine protein secondary structures of raw and heat-treated brown and golden flaxseeds:a novel approach[J].Canadian Journal of Animal Science,2005,85(4):437-448.

[11]DOIRON K,YU P,MCKINNON J J,et al.Heat-induced protein structure and subfractions in relation to protein degradation kinetics and intestinal availability in dairy cattle[J].Journal of Dairy Science,2009,92(7):3319-3330.

[12]SAMADI,YU P.Dry and moist heating-induced changes in protein molecular structure,protein subfraction,and nutrient profiles in soybeans[J].Journal of Dairy Science,2011,94(12):6092-6102.

[13]YU P Q.Protein molecular structures,protein subfractions,and protein availability affected by heat processing:a review[J].American Journal of Biochemistry and Biotechnology,2007,3(2):66-86.

[14]YU P Q.Protein secondary structures (α-helix and β-sheet) at a cellular level and protein fractions in relation to rumen degradation behaviors of protein:a novel approach[J].British Journal of Nutrition,2005,94(4):655-665.

[15]DYSON H J,WRIGHT P E.Peptide conformation and protein folding[J].Current Opinion in Structural Biology,1993,3(1):60-65.

[16]KEMP W.Organic spectroscopy[M].Edinburgh:W H Freeman & Co.:1991.

[17]JACKSON M,MANTSCH H H.The use and misuse of FTIR spectroscopy in the determination of protein structure[J].Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology,1995,30(2):95-120.

[18]JACKSON M,MANTSCH H.Biomedical infrared spectroscopy[M]//MANTSCH H H,CHAPMAN D.Infrared Spectroscopy of Biomolecules.New York:Wiley-Liss Inc.,1996.

[19](美)國家科學(xué)研究委員會.奶牛營養(yǎng)需要[M].孟慶翔,譯.北京:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社,2002.

[20]AOAC.Official methods of analysis of the Association of Official Analytical Chemists[S].7th ed.[S.l.]:Association of Official Analytical Chemists,1950.

[21]VAN SOEST P J,ROBERTSON B R,LEWIS B A.Methods for dietary fiber,neutral detergent fiber,and nonstarch polysaccharides in relation to animal nutrition[J].Journal of Dairy Science,1991,74(10):3583-3597.

[22]PENG Q H,KHAN N A,WANG Z S,et al.Moist and dry heating-induced changes in protein molecular structure,protein subfractions,and nutrient profiles in camelina seeds[J].Journal of Dairy Science,2013,97(1):446-457.

[23]焦培鑫,劉大森,鄭帥,等.飼料原料蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)對奶牛瘤胃降解特性的影響[J].飼料工業(yè),2012,33(13):48-51.

[24]KIM S,KIM H,REUHS H,et al.Differentiation of outer membrane proteins fromSalmonellaentericaserotypes using Fourier transform infrared spectroscopy and chemometrics[J].Letters in Applied Microbiology,2006,42(3):229-234.

[25]?RSKOV E R,MCDONALD I.The estimation of protein degradability in the rumen from incubation measurements weighted according to rate of passage[J].Journal of Agricultural Science,1979,92(2):499-503.

[26]莫放,馮仰廉.常用飼料蛋白質(zhì)在瘤胃的降解率[J].中國畜牧雜志,1995(3):23-26.

[27]ZHANG X W,YU P Q.Using ATR-FT/IR molecular spectroscopy to detect effects of blend DDGS inclusion level on the molecular structure spectral and metabolic characteristics of the proteins in hulless barley[J].Spectrochimica Acta Part A:Molecular and Biomolecular Spectroscopy,2012,95:53-63.

[28]BELANCHE A,WEISBJERG M R,ALLISON G G,et al.Measurement of rumen dry matter and neutral detergent fiber degradability of feeds by Fourier-transform infrared spectroscopy[J].Journal of Dairy Science,2014,97(4):2361-2375.

[29]WETZEL D L,SRIVARIN P,FINNEY J R.Revealing protein infrared spectral detail in a heterogeneous matrix dominated by starch[J].Vibrational Spectroscopy,2003,31(1):109-114.

[30]SEGUCHI M,TAKEMOTO M,MIZUTANI U,et al.Effects of secondary structures of heated egg white protein on the binding between prime starch and tailings fractions in fresh wheat flour[J].Cereal Chemistry,2004,81(5):633-636.

[31]YU P.Molecular chemistry imaging to reveal structural features of various plant feed tissues[J].Journal of Structural Biology,2005,150(1):81-89.

[32]吳鵬華,劉大森,仝泳,等.干酒糟及其可溶物和豆粕混合飼料蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)與瘤胃降解特性的關(guān)系[J].動物營養(yǎng)學(xué)報,2013,25(11):2763-2769.

[33]YARI M,VALIZADEH R,NASERIAN A A,et al.Protein molecular structures in alfalfa hay cut at three stages of maturity and in the afternoon and morning and relationship with nutrient availability in ruminants[J].Journal of the Science of Food and Agriculture,2013,93(12):3072-3080.

[34]ZHANG X,YU P.Molecular basis of protein structure in combined feeds (hulless barley with bioethanol coproduct of wheat dried distillers grains with solubles) in relation to protein rumen degradation kinetics and intestinal availability in dairy cattle[J].Journal of Dairy Science,2012,95(6):3363-3379.

[35]WARD W H,LUNDGREN H P.The formation,composition,and properties of the keratins[J].Advances in Protein Chemistry,1954,9:243-297.

[36]LAMMERS K,ARBUCKLE-KEIL G,DIGHTON J.FT-IR study of the changes in carbohydrate chemistry of three New Jersey pine barrens leaf litters during simulated control burning[J].Soil Biology and Biochemistry,2009,41(2):340-347.

[37]STEWART D.Fourier transform infrared microspectroscopy of plant tissues[J].Applied Spectroscopy,1996,50(3):357-365.

[38]HIMMELSBACH D S,KHALILI S,AKIN D E.FT-IR microspectroscopic imaging of flax (LinumusitatissimumL.) stems[J].Cellular and Molecular Biology,1998,44(1):99-108.

(責(zé)任編輯田艷明)

Relationship between Rumen Degradation Characteristics of Corn Silages with Protein Molecular Structures

WANG XiaofanZHANG XingyiHAO XiaoyanGAO HongDING Xue ZHANG Yonggen*XIN Hangshu*

(College of Animal Science and Technology of Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China)

Abstract:The objective of this present research was to investigate the correlation between rumen degradation characteristics of corn silages with protein molecular structures, and the fitting equation was established. Rumen degradation rates of dry matter, crude protein and neutral detergent fiber of 11 kinds of corn silages were determined by nylon bag technique in order to calculated their degradation characteristics, and protein molecular structures (amide Ⅰ, amide Ⅱ, α-helix and β-sheet) were analyzed by Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR). The results showed that: the peak height of amide Ⅱ had a very significant correlation with effective degradable rate of dry matter (r=-0.71, P<0.01), had a extremely significant correlation with degradation rate of slowly degraded part (r=-0.52, P<0.01) and none degraded part (r=-0.46, P<0.01) of neutral detergent fiber; the ratio of amide Ⅰ peak height to amide Ⅱ had a very significant correlation with rapidly degraded part (r=0.57, P<0.01) and slowly degraded part (r=-0.55, P<0.01) of dry matter, had a significant correlation with none degraded part of crude protein (r=-0.55, P<0.05) and tended to have a significant correlation with effective degradable rate of crude protein (r=0.38, P<0.10); the peak height of α-helix had a very significant correlation with none degraded part of dry matter (r=0.59, P<0.01), and a significant correlation with rapidly degraded part of crude protein (r=0.45, P<0.05); the ratio of α-helix peak height to β-sheet had a very significant correlation with degradation rate of slowly degraded part of dry matter (r=0.59, P<0.01) and a significant correlation with degradation rate of slowly degraded part of crude protein (r=0.57, P<0.05), had a significant correlation with effective degradable rate of crude protein (r=0.43, P<0.05), but no correlation had been found between protein molecular structures with slowly degraded part of crude protein, rapidly degraded part and slowly degraded part of neutral detergent fiber (P>0.10). The equations between protein molecular structures with effective degradable rate of dry matter (R2=0.50) and crude protein (R2=0.48) were the best. These results preliminary indicate that, FTIR can be used to analysis the relationship between rumen degradation characteristics of corn silages with protein molecular structures and establish regression equations. With the quantitative relations, analyzing nutritional values of corn silages will be rapidly and non-destructively, thus reducing the disadvantages of environmental pollution, time-consuming and laborious in traditional chemical analysis methods.[Chinese Journal of Animal Nutrition, 2016, 28(6)：1924-1934]

Key words:rumen degradation characteristics; FTIR; protein molecular structures; correlation; multi-regression

doi：10.3969/j.issn.1006-267x.2016.06.036

收稿日期：2015-12-21

基金項目：國家奶牛產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項目(CARS-37)；寒區(qū)規(guī)?；膛瞿膛＞氾曫B(yǎng)與粗飼料高效利用關(guān)鍵技術(shù)集成與示范(2012BAD12B05-1)；東北農(nóng)業(yè)大學(xué)青年才俊項目(14QC14)

作者簡介：王曉帆(1990—)，女，黑龍江佳木斯人，碩士研究生，從事反芻動物營養(yǎng)與飼料科學(xué)研究。E-mail: wangxiaofan0220@163.com *通信作者：張永根，教授，博士生導(dǎo)師，E-mail: zhangyonggen@sina.com；辛杭書，副教授，碩士生導(dǎo)師，E-mail：xinhangshu@163.com

中圖分類號：S816

文獻標識碼：A

文章編號：1006-267X(2016)06-1924-11

*Corresponding authors: ZHANG Yonggen, professor, E-mail: zhangyonggen@sina.com; XIN Hangshu, associate professor, E-mail: xinhangshu@163.com