骨髓間充質(zhì)干細胞對大鼠肺纖維化的抑制作用

陽成成，吳曉梅

骨髓間充質(zhì)干細胞對大鼠肺纖維化的抑制作用

陽成成，吳曉梅

哈爾濱醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院(哈爾濱 150086)，E-mail：344643928@qq.com

摘要：目的分析大鼠氣管內(nèi)注入博來霉素(BLMS)后，觀察不同時間點移入骨髓間充質(zhì)干細胞(MSC)的分化行為，分析細胞因子表達規(guī)律及其與病理變化的相關(guān)性，確定MSC移植治療實驗性肺纖維化大鼠的最佳時間窗及標準，旨在為臨床上干細胞移植治療肺纖維化的時機提供可靠參考依據(jù)。方法體外分離和培養(yǎng)雄性Wistar大鼠的MSC。將60只雌性Wistar 大鼠隨機分為4組：A組為生理鹽水對照組，氣管內(nèi)注入PBS50 μL；B組為博來霉素模型組，向氣管內(nèi)注入BLMS 5 mg/kg；C組氣管內(nèi)注入BLMS后立即尾靜脈注射移植MSC 1×107/mL，200 μL；D組氣管內(nèi)注入BLMS 14 d后移植MSC 1×107/mL，200 μL。于實驗7 d、14 d、28 d(D組于28 d)分別處死大鼠5只，取肺組織病理切片行HE及Masson染色，觀察肺部炎癥和纖維化情況及羥脯氨酸(HYP)含量測定；提取肺組織通過聚合酶鏈反應(yīng)( PCR ) 檢測雄性鼠的性別決定基因(SRY)；提取肺組織免疫組織化學法檢測轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)蛋白表達。結(jié)果病理切片觀察：B組第7天肺泡炎最明顯，28 d時肺纖維化最嚴重，與其他3組比較有統(tǒng)計學意義(P<0．05或P<0．01)；C組、D組肺泡炎及肺纖維化程度均較B組顯著減輕(P<0．05)，但仍較A組嚴重(P<0．05或P<0．01)，其中D組較C組嚴重(P<0．05)。Y染色體性別決定區(qū)SRY基因的檢測：A組及B組檢測不到SRY基因，但C組和D組各時間點均能檢測到SRY基因。 HYP含量：B組第7天HYP含量開始升高，28 d達到最高峰，高于其他3組(P<0．05或P<0.01)，與A組相比各時間點HYP含量的差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；C組與D組大鼠HYP含量均呈低水平升高趨勢，造模后7 d、14 d、28 d HYP含量均顯著低于B組(P<0.05)。TGF-β1：B組TGF-β1在14 d時表達最高，28 d時逐漸下降，各組之間比較均有統(tǒng)計學意義(P<0．05)。結(jié)論氣管內(nèi)注入博來霉素可成功復制大鼠肺纖維化模型；MSC可減輕肺泡炎、肺纖維化的程度；MSC到達損傷肺后可能抑制TGF-β1的表達，從而抑制博來霉素誘導肺纖維化的形成。

關(guān)鍵詞：特發(fā)性肺纖維化；骨髓間充質(zhì)干細胞；博來霉素；轉(zhuǎn)化生長因子β1；抑制作用；大鼠

特發(fā)性肺纖維化(IPF)是特發(fā)性間質(zhì)性肺炎(IIP)中病理表現(xiàn)為普通型間質(zhì)性肺炎(UIP)的一種類型，是一種進展的、慢性纖維性肺間質(zhì)性疾病，主要發(fā)生在老年人和肺功能受限的人群中[1]。IPF的特點是進行性呼吸困難和干咳，周邊或基底部網(wǎng)格狀和蜂窩狀為主的影像學表現(xiàn)和病理組織學結(jié)果為UIP模式。IPF目前的發(fā)病率為(6～14.6)/10萬，在我國尚無確切流行病學資料，但其年發(fā)病率呈上升趨勢，男性的發(fā)病率和患病率高于女性(1.5∶1～1.7∶1)，且隨著年齡的增加更加顯著[2]。雖然目前IPF的病因仍然不明確，它的發(fā)病機制有可能與病毒、真菌、環(huán)境因素和有毒因子等有關(guān)系，病死率高，5年的生存率與惡性腫瘤相似。因此，IPF嚴重威脅著病人的健康與生命，給病人家庭和社會帶來了沉重的經(jīng)濟負擔。在IPF治療方法上，尚缺乏有效的治療方法，因此，切實有效的治療IPF的方法已成為目前研究重點和難點。本實驗通過博來霉素(BLMS)制造大鼠肺纖維化模型，用體外培養(yǎng)和分離的骨髓間充質(zhì)干細胞(MSC)在不同時間點移植入模型組中，觀察對肺纖維化的抑制作用。

1材料與方法

1.1材料①動物購買，雄性Wistar大鼠60只，體重250 g左右，購于哈爾濱醫(yī)科大學附屬二院動物實驗中心。②主要實驗藥物和試劑，博來霉素(Bleomycin，BLM)系日本化藥株式會社產(chǎn)品；胎牛血清(美國Gibco公司)；胰酶(德國Sigma公司)；DMEM/F12(美國Gibco公司)；轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)免疫組化試劑盒(武漢博士德生物有限公司)；羥脯氨酸試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)。③主要實驗儀器，電子天平BL610、石蠟切片機、倒置相差顯微鏡、數(shù)顯電熱恒溫水溫箱HH.W21.600S、KR-180FA高速離心機、Olympus數(shù)碼相機、流式細胞儀、恒溫培養(yǎng)箱、紫外分光光度儀、動物手術(shù)器械、紗布、注射器等。

1.2方法①骨髓間充質(zhì)干細胞的分離培養(yǎng)，將4周齡Wistar雄性鼠一只放至動物實驗室操作臺上，用0.5 mL水合氯醛腹腔注射，用無菌手術(shù)刀將鼠股骨和脛骨的皮毛剝離，在股骨頭處剪斷，放入培養(yǎng)皿中；迅速回到細胞間，取出股骨后向脛骨頭剔除肌肉到關(guān)節(jié)處反向瓣，取出脛骨，放入另一培養(yǎng)皿中；左手用小鑷子夾住骨干，右手用小剪刀將干骺端剪斷，盡量多的保留干骺端；用5 mL 注射器沖洗骨髓直至骨髓變白；以1 000 r/min離心5 min；用吸管吸約5 mL含10%FBS的DMEM/F12到離心管中；血細胞計數(shù)器計算細胞總數(shù)；按1×106個細胞/cm2接種到T25的塑料培養(yǎng)瓶；將培養(yǎng)瓶放入37.0 ℃、5%CO2、飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；72 h后去除未貼壁的造血細胞、全量換液，以后每隔(2～3) d換液1次。10 d～14 d，待貼壁細胞85%融合后需進行消化傳代，倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化；待大部分細胞變圓懸浮后，加入10 mL含10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液終止消化；用含10%FBS的DMEM/Fl2培養(yǎng)液重新懸浮細胞；按1∶2傳代培養(yǎng)。以后各傳代過程如上，根據(jù)細胞密度調(diào)整細胞傳代時間及比例。

1.3動物分組大鼠稱重后腹腔注射10%水合氯醛(0.3 mL /100 g)麻醉，銳性分離淺筋膜，用 1 mL注射器在兩個環(huán)狀軟骨之間刺入。氣管內(nèi)注入含博來霉素的生理鹽水(0.2～ 0.3) mL(5 mg /kg)，對照組氣管內(nèi)注入等體積生理鹽水，以大鼠長軸為中心，立即旋轉(zhuǎn)大鼠，使藥液在肺內(nèi)分布均勻，縫合頸部皮膚，局部青霉素消毒防止感染。將(220～250) g雌性Wistar大鼠60只隨機分入以下各組，各組15只。生理鹽水對照組(A組)即刻氣管內(nèi)注入PBS溶液50 μL；BLMS模型組(B組)，即刻氣管內(nèi)注入博萊霉素5 mg/kg；MSC治療組(C組)，即刻氣管內(nèi)注入博萊霉素后立即尾靜脈注射移植MSC 1×107/mL，200 μL；MSC治療組(D組)，氣管內(nèi)注入BLMS14 d后移植MSC 1×107/mL，200 μL。

1.4標本采集與處理4組分別于造模后7 d、14 d、28 d各隨機處死5只。稱取小鼠體重，剖開腹腔，充分暴露腹主動脈，經(jīng)腹主動脈放血后處死；剪開胸腔，分離肺組織，從右主支氣管氣管插管，然后結(jié)扎近端，注入4%多聚甲醛，完全冷卻后加入固定液使肺復張，置于同樣固定液中浸泡右肺，石蠟包埋和連續(xù)性切片，切片厚度為4 μm，其中一部分進行HE染色和Masson染色做組織診斷學用，另外一部分進行免疫組化染色。

1.5動物一般情況觀察Wistar大鼠精神狀態(tài)、反應(yīng)靈敏度、活動情況、被毛(被毛是否光滑、有無光澤、有無脫毛)、皮膚(顏色、溫度、彈性等)、食欲、體重、死亡情況。

1.6病理組織學改變HE染色參照Szapiel等方法，觀察肺泡炎的程度。0級：無肺泡炎；Ⅰ級：輕度肺泡炎，鏡下可見到肺泡間隔是由于單核細胞浸潤而增厚，但病變僅僅局限于局部和胸膜底部，所占面積少于全肺20%，肺泡結(jié)構(gòu)正常；Ⅱ級：中度肺泡炎，肺泡炎癥病變較廣泛，受累面積占全肺的20%～50%，胸膜基底部較重；Ⅲ級：彌漫性肺泡炎，病變范圍>50%，偶可見到肺泡腔內(nèi)有單核細胞及出血造成的實變。

1.7膠原纖維染色的定性分析參照Fulmer方法，用Masson染色將肺纖維化分5級：0級：正常肺組織；Ⅰ級：微小纖維化，肺泡間隔基本正常，局部有間質(zhì)纖維化，無肺泡的破壞及肺網(wǎng)架結(jié)構(gòu)的改變，肺膠原纖維與正常肺相比升高不小于10%；Ⅱ級：輕度纖維化，肺泡間隔為輕度增厚，部分區(qū)域有正常肺泡，全肺的膠原纖維與正常肺相比占10%～25%；Ⅲ級：中度纖維化，肺泡間隔中度增厚，正常肺泡少見，間質(zhì)結(jié)構(gòu)破壞，全肺膠原纖維與正常肺相比升高至25%～40%；Ⅳ級：嚴重纖維化，所有的肺泡間隔均有不同程度增厚，但仍有可辨認的肺泡結(jié)構(gòu)存在，許多修復部位失去正常間質(zhì)結(jié)構(gòu)，全肺膠原纖維與正常肺相比升高至40%以上。

1.8大鼠肺組織細胞來源檢測取(50～100) mg肺組織按照組織基因組DNA提取試劑盒方法，分別于C組7 d、14 d、28 d及D組28 d肺組織提取DNA，聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴增SRY基因。以2%瓊脂糖凝膠中電泳，凝膠成像系統(tǒng)攝像，以雌、雄Wistar大鼠為陰、陽性對照。合成SRY大鼠基因，上游引物：5’- tttagtgttcagccctacagcc-3’，下 游 引 物：5’-atgctgggattctgttgagcc-3’，擴 增 長 度為322bp； 內(nèi)參照：β 肌動蛋白(β-actin ) 上游引物：5’-cacgatggaggggccggactcatc-3’，下游引物：5’-taaagacctctatgccaacacagt-3’，擴增長度為240 bp。聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴增反應(yīng)條件：94 ℃預變性5 min，94℃變性30 s，52 ℃退 火30 s ，72 ℃退火3 0s，循環(huán)50次，72℃延伸7 min。

1.9HYP檢測取各組大鼠右肺中上葉稱重(50 mg)，采用分光光度計560 nm波長比色，記錄吸光度值，根據(jù)試劑盒所給公式計算待測標本的HYP含量，確定肺組織纖維化程度。

1.10免疫組織化學法測定TGF-β1蛋白表達免疫組化檢測指標的半定量分析，自動計算其積分光密度(integrated optical density，IOD)值進行半定量分析。

1.11統(tǒng)計學處理采用SPSS13．0統(tǒng)計軟件處理，P<0.05為有統(tǒng)計學意義，統(tǒng)計方法使用方差分析等。

2結(jié)果

2.1細胞培養(yǎng)第1天即貼壁，第2天時貼壁細胞較多，第3天可以看到骨髓細胞在培養(yǎng)瓶中長出明顯的MSC克隆，為橢圓形、梭狀，似成纖維細胞樣。骨髓內(nèi)的造血干細胞等其他的細胞在培養(yǎng)瓶中為懸浮方式生長，經(jīng)多次換液后造血干細胞及其他的細胞逐漸減少。約10 d后原代細胞85%融合，進行傳代。傳代后細胞度過抑制期后迅速增長，每傳1代需要(3～4)d，隨著傳代次數(shù)的增加，細胞形態(tài)呈均勻一致的長梭形，排列成旋渦狀或放射狀 。

2.2大鼠術(shù)后觀察A組大鼠術(shù)后蘇醒很快，蘇醒后僅有短暫活力下降，恢復術(shù)前的活力快，進食好，體重逐漸增長；B組大鼠術(shù)后蘇醒較慢，不愛活動，進食較少，皮毛凌亂、無光澤，唇及爪發(fā)紺，可以聽到大鼠的喘息聲，體重明顯減輕；C組大鼠術(shù)后蘇醒較慢，術(shù)后4 d～5 d內(nèi)活力較差，進食較少，體重不增長，第5天后大鼠一般情況逐漸好轉(zhuǎn)，體重逐漸增長。D組大鼠術(shù)后蘇醒更慢，于術(shù)后7 d、8 d活力仍差，進食少，體重不增長，第8天后小鼠一般情況才逐漸好轉(zhuǎn)，體重逐漸增長。

2.3肺組織HE染色、Masson染色A組光鏡下可見肺泡間隔無增厚，無水腫、炎癥及纖維化表現(xiàn)，肺泡腔沒有縮小，且無明顯滲出。B組灌注博來霉素后的7 d內(nèi)表現(xiàn)為急性炎癥，肺泡的間隔增厚，肺泡腔及間隔內(nèi)炎癥細胞聚集；第14天炎性細胞滲出明顯減輕，肺泡間隔增厚，而成纖維細胞增多，肺組織以纖維化改變?yōu)橹?。?8天肺泡結(jié)構(gòu)破壞，肺泡腔明顯縮小，肺間質(zhì)被膠原纖維和成纖維細胞替代，纖維化明顯。C組：于7 d肺組織的充血明顯減輕，點狀出血明顯減少，14 d和28 d雙肺顏色發(fā)暗，表面較粗糙，體積縮小不明顯。各時間點肺泡炎與肺纖維化評分與B組比較均顯著減輕(P<0．05)，仍較A組嚴重(P<0．05)。D組：28 d時雙肺顏色暗，表面粗糙，體積縮小不明顯。肺泡炎較B組減輕，肺纖維化評分較B組減少，但均較A組、C組嚴重。各組肺泡炎及肺纖維化評分結(jié)果見表1、表2。

表1　各組肺泡炎程度比較(±s)　分

表2　各組纖維化程度比較(±s)　分

2.4Y染色體性別決定區(qū)SRY基因檢測A組及B組檢測不到SRY基因，但C組和D組各時間點均能檢測到SRY基因。

2.5HYP檢測肺組織纖維化程度B組注BLM后7 d，HYP含量開始升高，28 d達到最高峰，高于其他3組，與A組相比各時間點HYP含量有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。C組與D組大鼠HYP含量均呈低水平升高趨勢，造模后7 d、14 d、28 dHYP含量均顯著低于B組(P<0.05)。與形態(tài)學肺纖維化觀察結(jié)果相一致(見表3)。

表3　大鼠肺組織HYP含量比較(±s)　μg/g

2.6大鼠肺組織中TGF-β1大鼠肺組織TGF-β1蛋白表達在胞漿呈黃色或棕黃色顆粒，主要定位于肺泡巨噬細胞胞漿中，以細胞胞漿、胞膜、細胞外基質(zhì)染為棕色為陽性；每張切片選取5個視野，計陽性細胞數(shù)/高倍視野(見表4)。博萊霉素處理大鼠的肺組織TGF-β1表達明顯、范圍廣，特別是在第14天時肺泡腔和間質(zhì)中出現(xiàn)大量的TGF-β1強陽性的肺泡巨噬細胞，肺組織中TGF-β1陽性的肺泡巨噬細胞，可以單個或成群肺泡巨噬細胞出現(xiàn)。

表4　各組TGF-β1表達陽性巨噬細胞數(shù)

3討論

在間質(zhì)性肺疾病中，以IPF最為常見，預后極差，從最初確診到死亡的平均時間是(3～5)年。盡管過去數(shù)十年在IPF發(fā)病機制研究取得了很大進展，但其發(fā)病機制尚不十分清楚。過去認為IPF是一種慢性的炎癥反應(yīng)，因而解釋了最初使用皮質(zhì)類固醇激素治療的原因。目前糖皮質(zhì)激素為治療IPF的經(jīng)典藥物，但是僅有10%～30%的IPF病人對糖皮質(zhì)激素治療有一定的療效[3]，而且沒有完全或持續(xù)緩解者，因此有學者不推薦單獨使用糖皮質(zhì)激素治療IPF病人。且糖皮質(zhì)激素副反應(yīng)大，臨床應(yīng)用受限。近年來，隨著對本病發(fā)病機制和病理生理變化的研究以及分子生物學技術(shù)的應(yīng)用，干細胞的研究引起了人們的極大關(guān)注，其中研究最多的是MSC。在體外特定的條件下，MSC 可以定向誘導分化為骨、軟骨、脂肪、心肌、神經(jīng)、皮膚上皮、肝臟、胰島B 細胞等多種類型細胞[4]，被認為是組織工程領(lǐng)域的理想種子細胞來源。本實驗研究的是MCS對博來霉素誘導的肺纖維化的治療機制。文獻上報道的構(gòu)建肺纖維化模型的方法有多種，如應(yīng)用博來霉素、百草枯、放射線、高濃度氧等，博萊霉素氣管內(nèi)給藥因存在方法可靠、操作簡單、制模時間短等[5]優(yōu)點，且博萊霉素致纖維化動物模型與人類IPF的病理學改變相似，所以用博萊霉素復制肺纖維化動物模型是目前普遍采用的方法[6]。本實驗表明：灌注博來霉素后7 d內(nèi)表現(xiàn)為急性炎癥，肺泡間隔明顯增厚，肺泡腔及間隔內(nèi)炎癥細胞聚集；于第14天時炎性細胞滲出減輕，成纖維細胞增多，肺組織以纖維化改變?yōu)橹?。于?8天肺泡結(jié)構(gòu)破壞，肺泡腔明顯縮小，纖維化明顯。說明大鼠肺纖維化模型造模成功。

骨髓來源干細胞療法是生物學發(fā)展最為迅速的領(lǐng)域之一。骨髓間充質(zhì)干細胞是由中胚層發(fā)育的早期細胞，有著較強的自我增殖能力和多向分化潛能，因此為許多復雜疾病的治療帶來了曙光。按發(fā)生學來源可將干細胞分為胚胎干細胞和成體干細胞。近年來，越來越多的證據(jù)表明成體干細胞具有較強的多系分化潛能，大量的研究顯示成體干細胞可以向包括肺組織在內(nèi)的多種非造血細胞類型分化[7]。作為成體干細胞的一種，MSC在研究和應(yīng)用方面具有以下優(yōu)點：①可自體移植避免了免疫排斥；②在正常情況下處于靜止狀態(tài)，只有在病理情況下才顯示出一定的自我更新潛能，因此癌變的可能性較??；③由于分化潛能比較局限，更容易被誘導向特定的組織細胞分裂，可以直接用于體內(nèi)組織的原位修復；④某種類型的成體干細胞有向同種組織的損傷部位遷移的趨勢，這有助于臨床應(yīng)用干細胞來進行疾病替代治療時的定位；⑤分離和使用成體干細胞不存在倫理學問題[8]。至今為止，MSC的分離、培養(yǎng)方法比較常用的是貼壁細胞分離法、密度梯度離心法、流式細胞分選法、免疫磁珠分離法等。本實驗所采取的是全骨髓貼壁細胞分離法，這個方法操作比較簡單、快速、容易掌握、不易污染，比較符合細胞生長的微環(huán)境，可經(jīng)過多次傳代以獲得足夠量細胞的優(yōu)點。收集第4代MSC細胞用于實驗，經(jīng)過3次傳代后可以獲得足夠的細胞數(shù)量；另外第4代細胞很好地保持了其分化特性，符合實驗要求。

轉(zhuǎn)化生長因子-β1最初是從血小板中分離出來的一種細胞因子，因其能促進成纖維細胞轉(zhuǎn)化生長而得名。它是由多種細胞分泌的具有多重生物學效應(yīng)的細胞因子。TGF-β1是迄今發(fā)現(xiàn)的最強的細胞外基質(zhì)沉積促進劑，其作用于多個環(huán)節(jié)，刺激各種細胞外基質(zhì)成分合成和沉積，在減少基質(zhì)降解酶及增加降解抑制劑合成的同時，還是一個強大的細胞增殖調(diào)節(jié)劑，促進肺成纖維細胞增殖，在肺纖維化發(fā)展中起關(guān)鍵作用，是目前研究最多的纖維化促發(fā)因子[9]。早期通過趨化炎癥細胞參與肺損傷和炎癥反應(yīng)，而后主要是促進細胞外基質(zhì)形成和抑制其酶解作用，促進纖維蛋白原向肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化，同時影響其他纖維化細胞因子，導致纖維化發(fā)生[10]。本實驗研究結(jié)果表明，博來霉素灌注后第7天可見肺泡腔和間質(zhì)中出現(xiàn)較多的TGF-β1強陽性的肺泡巨噬細胞，第14天時肺泡腔和間質(zhì)TGF-β1陽性的肺泡巨噬細胞達到高峰，于第28天肺組織中TGF-β1陽性的肺泡巨噬細胞比第7天及第14天減少。與B組比較，C組、D兩組肺組織中TGF-β1陽性的巨噬細胞數(shù)量明顯少，差異有統(tǒng)計學意義。

外源性MSC的確能移植到損傷肺組織中，并具有減輕肺泡炎、肺纖維化的作用。MSC在體外培養(yǎng)即能分泌TGF-β1，且該細胞因子有抑制淋巴細胞增殖的作用，而當MSC進入實驗動物體內(nèi)后，由于微環(huán)境的改變，TGF-β1的表達可能會有改變，因此其在這個修復過程中的作用需進一步研究。

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(本文編輯王雅潔)

中圖分類號：R551.3R285.5

文獻標識碼：A

doi：10.3969/j.issn.1672-1349.2016.10.011

文章編號：1672-1349(2016)10-1091-04

(收稿日期：2016-03-03)