擬南芥IQM5.2的克隆、表達(dá)及其生物信息學(xué)分析

弓路平 蕭文慧 周玉萍 黃小玲 田長恩

（廣州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 植物抗逆基因功能研究廣州市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510006）

研究報(bào)告

擬南芥IQM5.2的克隆、表達(dá)及其生物信息學(xué)分析

弓路平 蕭文慧 周玉萍 黃小玲 田長恩

（廣州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 植物抗逆基因功能研究廣州市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510006）

為了探究擬南芥IQM5基因是否存在不同的剪切方式及其器官特異性表達(dá)，利用RT-PCR技術(shù)和T-A克隆發(fā)現(xiàn)了IQM5基因的一種新的剪切方式，即IQM5.2。利用生物信息學(xué)方法、半定量和定量RT-PCR分析方法分別對新的CDS序列所編碼蛋白的性質(zhì)以及IQM5.1和IQM5.2在不同器官中的比例進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，IQM5.2編碼1個由300個氨基酸組成的多肽，其N端與豌豆重金屬誘導(dǎo)蛋白6A（HMIP6A）具有較高同源性，含有1個IQ基序，屬于鈣不依賴性鈣調(diào)素結(jié)合蛋白；在幼苗、蓮座葉、花序葉、莖和花蕾中都存在IQM5.1和IQM5.2的轉(zhuǎn)錄本，且二者的比例在不同的材料中不盡相同。因此，IQM5基因存在不同的剪切方式和器官特異性表達(dá)。

IQM5.2；選擇性剪切；鈣調(diào)素結(jié)合蛋白；基因表達(dá)；擬南芥

鈣調(diào)素（calmodulin，CaM）作為一類細(xì)胞內(nèi)Ca2+的受體，絕大多數(shù)無酶活性，也無轉(zhuǎn)錄因子活性，更不是結(jié)構(gòu)蛋白，只有通過其下游的鈣調(diào)素結(jié)合蛋白（calmodulin-binding protein，CaMBP）來調(diào)節(jié)細(xì)胞的生理功能［1-3］。因此，研究CaBMP對揭示CaM的功能至關(guān)重要，將有助于解析CaM信號通路的特異性、復(fù)雜性和多樣性。CaM與CaMBP的結(jié)合可分為Ca2+依賴和不依賴兩種類型。其中，Ca2+不依賴型的CaMBP含有IQ基序，完整IQ基序的氨基酸序列為IQXXXRGXXXR或［I/L/V］QXXXRXXXX［R/K］［4，5］，但是，極少數(shù)含IQ基序的蛋白質(zhì)與CaM的結(jié)合也依賴Ca2+［6，7］。在植物中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了5個含IQ基序的蛋白質(zhì)家族［8］：myosin家 族［9-11］、CAMTA家 族［12，13］、CNGC家族［14，15］、IQD家族［6，7，16］和IQM家族［17-19］，分別由17個、6個、20個、33個和6個成員組成。在擬南芥中，IQM家族共有6個成員，均只含有1個能與鈣調(diào)素結(jié)合的IQ基序［20］。IQM1（IQ motif containing 1）是IQM家族的1個成員，由At4g33050編碼，IQM1在體內(nèi)外均能與CaM結(jié)合，并通過蛋白截短實(shí)驗(yàn)證明IQ基序是其鈣調(diào)素結(jié)合所必需的結(jié)構(gòu)域［17］；本研究組將克隆得到的全長cDNA進(jìn)行生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，IQM2也是1個鈣調(diào)素結(jié)合蛋白［21］；IQM3的啟動子中存在多種光、非生物脅迫和植物激素反應(yīng)的順式作用元件，IQM3基因與種子萌發(fā)及幼苗子葉膨大有密切關(guān)系［22］。IQM5是該家族的第5個成員，由At5g57010編碼，其功能尚待研究。檢索生物學(xué)文獻(xiàn)和數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)IQM5基因存在一種剪切方式，即IQM5.1。已知，IQM1存在4種不同的剪切方式（見www.arabidopsis.org）。鑒于此，本研究對不同生長發(fā)育時期的RNA樣本進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增和測序，以探究IQM5是否也存在不同的剪切方式，并對因不同的剪切方式所產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行定量RT-PCR分析，旨為進(jìn)一步解析該基因的功能奠定必要的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

植物材料：擬南芥（Arabidopsis thaliana）生態(tài)型為Columbia（Col）；大腸桿菌菌株為E. coli DH5α；T-A克隆載體為pMD19-T Simple vector，購自TaKaRa公司；總RNA提取試劑盒（RNAiso Plus）、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）、SYBR?PrimeSc riptTMRT-PCR kit（Perfect Real Time）、瓊脂糖凝膠回收試劑盒、DNA片段回收試劑盒、DNA Ligation Kit和PCR相關(guān)的試劑及Taq酶均為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；氨芐青霉素鈉、硫酸卡那霉素、蛋白胨、酵母抽提物、蔗糖、瓊脂粉、各種氨基酸、NaCl等試劑均為生工生物工程上海股份有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取 采用 Trizol 法，從7d幼苗、成熟植株不同器官中提取總 RNA。

1.2.2 不同轉(zhuǎn)錄本的克隆 以7 d幼苗和成熟蓮座葉的總RNA為模板，以5'-atggctttatcttttggttactta-3'和5'-ttagtgccttgggcttggaagacc-3'為引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，得到IQM5CDS。RT-PCR參數(shù)為：50℃反轉(zhuǎn)錄30 min，94℃變性2 min；94℃變性30 s，64℃退火30 s，72℃延伸2 min，共 33個循環(huán)；72℃延伸5 min。反應(yīng)結(jié)束后電泳，并用凝膠成像系統(tǒng)（AlphamagerTM）觀察、拍照，切取目的片段所在的凝膠，用膠回收試劑盒回收擴(kuò)增產(chǎn)品，與pMD19-T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，篩選出陽性菌落，進(jìn)行菌落PCR，選擇陽性菌落搖菌，菌液外送測序，并用生物信息學(xué)的方法分析測序結(jié)果。

1.2.3 基因表達(dá)分析

1.2.3.1 cDNA的獲得 參考PrimeScriptTMRT reagent Kit（Perfect Real Time）的操作手冊進(jìn)行。先用其中的gDNA Eraser除去RNA中的基因組DNA后，再進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，最后進(jìn)行PCR 檢測，以確認(rèn) DNA是否除盡。

1.2.3.2 半定量RT-PCR 以1.2.3.1所獲得的cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。所用引物為IQM5.1-F1：5'-AAGTTTACCAGCACCGAC-3'；IQM5.1-R1：5'-GCAGCAAGATTTCTACGC-3'；IQM5.2-F2：5'-CGTATGTACACATGGTCTTC-3'，IQM5.2-R2：5'-ACACTTCGTAAGCTTGTCTC-3'；Actin2-F：5'-TGACTACGAGCAGGAGATGGAA-3'，Actin2-R：5'-CAAACGAGGGCTGGAACAA-3'。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃變性2 min；94℃變性30 s，62℃（Actin2）或51.5（IQM5.1IQM5.2）退火30 s，72℃延伸10 s，共28個循環(huán)；72℃延伸5 min。反應(yīng)結(jié)束后，用濃度為2%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，用凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照。

1.2.3.3 實(shí)時定量RT-PCR 用SYBR?PrimeSc riptTMRT-PCR kit（Perfect Real Time），相關(guān)耗材為Applied Biosystems（ABI7000）公司產(chǎn)品。所用基因?qū)Ｒ灰锿攵縍T-PCR，模板（1.2.3.1所獲cDNA）濃度為0.5 ng·L-1，每個樣品設(shè)3次重復(fù)。選用表達(dá)相對穩(wěn)定的Actin2作為內(nèi)參基因，以IQM5.2的相對表達(dá)量作為參照因子（即1倍）。采用△△Ct法進(jìn)行基因表達(dá)的相對定量分析，即利用 2-△△Ct公式計(jì)算IQM5.1基因與IQM5.2基因的相對比例（樣品的△Ct=IQM5.1基因/IQM5.2基因的Ct -Actin2Ct，△△Ct=IQM5.2基因△Ct - IQM5.1基因的△Ct）。

2 結(jié)果

2.1 IQM5.2的發(fā)現(xiàn)

以7 d幼苗總RNA為模板進(jìn)行RT-PCR，將擴(kuò)增產(chǎn)物克隆進(jìn)測序載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，隨機(jī)選送5個菌落直接PCR呈陽性的菌落外送測序。測序結(jié)果顯示，全部為IQM5.1。而在以成熟蓮座葉總RNA為模板進(jìn)行的RT-PCR所獲得 9個序列中，3個與IQM5.1完全匹配，另外6個序列都存在1個長75 bp的與IQM5.1不匹配的片段。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，這個75 bp的片段與IQM5.1的基因組序列的第6個內(nèi)含子（1 345-1 419 bp）完全匹配（圖1）。說明IQM5基因至少存在2種不同的剪切方式，其轉(zhuǎn)錄本分別為IQM5.1和IQM5.2。

圖1 所得75 bp片段與IQM5基因的第6個內(nèi)含子的比對

如上所述，在成熟植株的蓮座葉中發(fā)現(xiàn)了一個新的IQM5基因的mRNA——IQM5.2。經(jīng)過生物信息學(xué)分析得知，IQM5.2源于IQM5.1的第6個內(nèi)含子未被剪切。該內(nèi)含子兩端的堿基為“GT-AG”（圖1），屬于第二類“GT-AG”內(nèi)含子。據(jù)此，IQM5基因由IQM5.1的8個外顯子拼接為IQM5.2的7個外顯子（圖2）。

圖2 IQM5.1（A）和IQM5.2（B）的剪切方式示意圖

2.2 IQM5.2的cDNA及其編碼蛋白

IQM5.1基因的cDNA全長1 783 bp，編碼1個由495個氨基酸殘基組成的多肽鏈（NP_200511.1）。IQM5.2 的cDNA全長1 858 bp，編碼1個由300個氨基酸殘基組成的多肽鏈（KT851542）（圖3）。這是由于在多出的75 bp的第70-72位核苷酸殘基為終止密碼“TAA”（圖1-圖3）所致。

2.3 IQM5.1的基本理化性質(zhì)

用ExPASy的ProtParam軟件預(yù)測，IQM5.1的分子式為C2474H3925N723O736S18，相對分子質(zhì)量約為56 kD，酸性氨基酸（Asp + Glu）殘基58個，堿性氨基酸（Arg + Lys）殘基77個，等電點(diǎn)（pI）為9.44，半衰期為30 h，不穩(wěn)定參數(shù)（the instability index，II）是41.89，屬于不穩(wěn)定蛋白。該蛋白親水性平均數(shù)（grand average of hydropathicity，GRAVY）為-0.676，預(yù)測為親水蛋白。

2.4 IQM5.2的理化性質(zhì)

用ExPASy的ProtParam軟件預(yù)測，其分子式為C1528H2427N443O444S9，相對分子質(zhì)量約為34 kD，酸性氨基酸（Asp + Glu）殘基37個，堿性氨基酸（Arg + Lys）殘基51個，等電點(diǎn)（pI）為9.50，半衰期為30 h，不穩(wěn)定參數(shù)是46.11，屬于不穩(wěn)定蛋白。該蛋白親水性平均數(shù)為-0.688，預(yù)測為親水蛋白。

2.5 功能預(yù)測

經(jīng)序列比對發(fā)現(xiàn)，IQM5.1的 N端與豌豆重金屬誘導(dǎo)蛋白6A（HMIP6A）［23］、C端與栝樓天花粉素（trichosanthin）的N端［24］具有較高的同源性，第130-152位氨基酸殘基為IQ基序（圖4）。IQM5.2與豌豆重金屬誘導(dǎo)蛋白6A（HMIP6A）［23］具有較高同源性，第130-152位氨基酸殘基為IQ基序（圖5）。HMIP6 A是在用汞、鎘和鋁處理的豌豆根中被發(fā)現(xiàn)的，具有一個含IQ基序的重復(fù)序列［23］，而IQM5.1和IQM5.2均具有其中一段。提示，IQM5.2可能具有與HMIP6A相似的特性。天花粉素是從葫蘆科植物栝樓（Trichosanthes kirilowii）新鮮塊根中提取的植物蛋白質(zhì)，屬于I型核糖體失活蛋白［24］。與IQM5.1相比，IQM5.2缺少了天花粉素同源區(qū)段。

圖3 IQM5.2的cDNA及其編碼蛋白

圖4 IQM5.1與豌豆重金屬誘導(dǎo)蛋白6A（HMIP 6A）及栝樓天花粉蛋白（Trichosanthin）的序列比對

圖5 IQM5.2與豌豆重金屬誘導(dǎo)蛋白6A（HMIP 6A）的序列比對

2.6 AtIQM5.1和AtIQM5.2的表達(dá)分析

為了進(jìn)一步分析IQM5.1和IQM5.2在不同器官中的表達(dá)比例，選取了7d幼苗、成熟植物的蓮座葉、花序葉、莖和花蕾等5種不同材料進(jìn)行半定量和定量RT-PCR分析。定量RT-PCR分析結(jié)果顯示：若以同一材料中的IQM5.1的表達(dá)量作為1個單位，除花蕾中AtIQM5.2比IQM5.1的相對表達(dá)量低外，其他4種材料中IQM5.2比IQM5.1的表達(dá)量高（圖6-B）。半定量RT-PCR分析結(jié)果（圖6-A）印證了定量RT-PCR分析的結(jié)果。

圖6 AtIQM5.1和AtIQM5.2轉(zhuǎn)錄本的半定量（A）和定量（B）RT-PCR分析

3 討論

本研究在生態(tài)型為Columbia（Col）的擬南芥中發(fā)現(xiàn)了一種IQM5基因的新的剪切方式，由IQM5.1的第6個內(nèi)含子未被剪切所致，所產(chǎn)生的mRNA被命名為IQM5.2。與IQM5.1蛋白相比，IQM5.2蛋白缺少了天花粉素同源區(qū)段，但I(xiàn)QM5.2蛋白仍然保留了與HMIP6A同源的含IQ基序的區(qū)段，可能具有與HMIP6A相似但不同于IQM5.1的功能。本研究組多年從事擬南芥IQM家族的研究，利用截短蛋白所進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)IQ基序是IQM1與CaM結(jié)合的位點(diǎn)［17］；進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，若將IQ基序中的I突變成S，IQM1同樣不能與CaM結(jié)合［25］；在IQM2的鈣調(diào)素結(jié)合活性的研究中，本研究組得到了相同的結(jié)果（待發(fā)表）。因此，推斷IQM5.2蛋白可以與CaM結(jié)合，并且很可能是不依賴Ca2+的CaM結(jié)合蛋白，具體特性還有待進(jìn)一步研究。半定量和定量RT-PCR分析結(jié)果顯示，5種不同材料中都存在IQM5.1和IQM5.2的轉(zhuǎn)錄本，且二者的比例在不同的材料中不盡相同。因此推測，二者的比例可能與發(fā)育調(diào)節(jié)有關(guān)，其間的具體關(guān)系則有待深入研究。

4 結(jié)論

發(fā)現(xiàn)AtIQM5基因的一種新的轉(zhuǎn)錄本IQM5.2，并在擬南芥生態(tài)型為Columbia（Col）的幼苗、蓮座葉、花序葉、莖和花蕾中均存在IQM5.1和IQM5.2兩種轉(zhuǎn)錄本，且二者的比例在不同器官中不盡相同。

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（責(zé)任編輯 狄艷紅）

Cloning，Expression and Bioinformatics Analysis of IQM5.2 from Arabidopsis

GONG Lu-ping XIAO Wen-hui ZHOU Yu-ping HUANG Xiao-ling TIAN Chang-en
（Guangzhou Key Laboratory for Functional Study on Stress-resistant Genes in Plants，School of Life Sciences，Guangzhou University，Guangzhou 510006）

The Arabidopsis IQM5，the fifth member of IQM family，is encoded by At5g57010. So far，there is only one splicing mode found for the IQM5 gene in the biological literatures and databases，i.e.，At5g57010.1（IQM5.1）. In this study，a new splicing mode for IQM5 gene was found by RT-PCR and T-A cloning method，designated as At5g57010.2（IQM5.2）. Bioinformatics methods and semiquantitative and quantitative RT-PCR were employed to analyze the properties of proteins encoded by new CDS sequence，and the ratio of IQM5.1 and IQM5.2 in different organs，respectively. The results revealed that IQM5.2 encoded a polypeptide of 300 amino-acid residues，and its N-terminus shared sequence homology with the pea heavy metal-induced protein 6A（HMIP6A）. The protein retained an IQ motif and was a calmodulin-binding protein of the calcium independent. There were transcripts of IQM5.1 and IQM5.2 in the seedling，rosette leaf，cauline leaf，stem，and flower bud，moreover，the ratios of them in the different organs varied.

IQM5.2；alternative splicing；calmodulin-binding protein；gene expression；Arabidopsis

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.05.009

2015-07-22

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31170204，31470014），羊城學(xué)者科研項(xiàng)目（12A001G）

弓路平，女，碩士研究生，研究方向：分子遺傳學(xué)；E-mail：1537464017@qq.com

田長恩，男，教授，研究方向：分子遺傳學(xué)；E-mail：changentian@aliyun.com