Dickkopf-1在腦出血大鼠神經(jīng)元凋亡中的作用及機(jī)制研究

張凡喜　張健民　黃曉龍　周玉峰　陳鵬

Dickkopf-1在腦出血大鼠神經(jīng)元凋亡中的作用及機(jī)制研究

張凡喜張健民黃曉龍周玉峰陳鵬

400020解放軍第三二四醫(yī)院神經(jīng)外科

摘要:目的探討Dickkopf-1(DKK-1)在腦出血大鼠神經(jīng)元凋亡中的作用及機(jī)制。方法采用隨機(jī)數(shù)字法將40只成年雄性SD大鼠分成對(duì)照組(n=13)、假手術(shù)組(n=13)及腦出血組(n=14)。通過(guò)顱內(nèi)注射自體外周血制作腦出血模型。采用平衡木行走實(shí)驗(yàn)和肌力測(cè)驗(yàn)進(jìn)行腦出血模型評(píng)估，并利用Real-time PCR和Western blot檢測(cè)大鼠腦組織中Bcl-2、Bax、p-Akt、Akt及DKK-1蛋白和mRNA表達(dá)水平。分離培養(yǎng)原代大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元，分為對(duì)照組、空載體組、DKK-1過(guò)表達(dá)組、BTBD10(Akt磷酸化激活劑)過(guò)表達(dá)組，檢測(cè)細(xì)胞中DKK-1表達(dá)水平和Akt磷酸化水平，利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡。 結(jié)果腦出血組大鼠平衡木行走得分高于對(duì)照組和假手術(shù)組(P<0.05)，而肌力測(cè)驗(yàn)評(píng)分低于對(duì)照組和假手術(shù)組(P<0.05)。與對(duì)照組和假手術(shù)組比較，大鼠腦出血部位腦組織Bcl-2表達(dá)降低(P<0.05)，而B(niǎo)ax表達(dá)則升高(P<0.05)，p-Akt表達(dá)水平下降(P<0.05)，DKK-1表達(dá)水平上升(P<0.05)。DKK-1過(guò)表達(dá)組神經(jīng)元凋亡率及p-Akt表達(dá)水平均高于空載體組和對(duì)照組(均P<0.05)。Akt磷酸化激活劑BTBD10過(guò)表達(dá)組p-Akt水平、Bcl-2蛋白表達(dá)高于對(duì)照組和空載體組，而B(niǎo)ax蛋白表達(dá)則低于對(duì)照組和空載體組。BTBD10過(guò)表達(dá)組神經(jīng)元存活率高于對(duì)照組和空載體組(均P<0.05)，且BTBD10和DKK-1共轉(zhuǎn)染組大鼠神經(jīng)元存活率高于DKK-1轉(zhuǎn)染組(P<0.05)。結(jié)論DKK-1可能通過(guò)抑制Akt的磷酸化促進(jìn)出血性腦卒中大鼠神經(jīng)元的凋亡。

關(guān)鍵詞:腦出血；DKK-1；細(xì)胞凋亡；Akt

腦出血約占全部腦卒中的20%～30%，全球每年有約200萬(wàn)人發(fā)病，且中國(guó)人的發(fā)病率較白種人高[1]。腦出血對(duì)腦部的損傷最初是通過(guò)對(duì)鄰近組織機(jī)械壓迫引起，隨后發(fā)生由腦水腫、炎性反應(yīng)和氧化刺激所引起的繼發(fā)性損傷。在氧化刺激過(guò)程中，活性氧通過(guò)與其他胞內(nèi)分子相互作用引起神經(jīng)細(xì)胞凋亡[2]。Dickkopf家族蛋白(DKKs)多為Wnt信號(hào)的拮抗劑，有研究結(jié)果顯示DKK-1與神經(jīng)退行性病變有關(guān)[3]，其能夠促進(jìn)1-甲基-4-苯基吡啶離子(MPP+)誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡[4]。本研究通過(guò)建立大鼠腦出血模型并分離大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞，初步探討了DKK-1在腦出血中的作用及相關(guān)機(jī)制。

1材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物成年雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠40只，平均體質(zhì)量為250 g；一日齡新生SD大鼠10只，均由重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。利用隨機(jī)數(shù)字法將40只SD大鼠分為對(duì)照組(n=13)、假手術(shù)組(n=13)和腦出血組(n=14)。

1.2主要試劑及儀器馬血清、葡萄糖、HEPES、谷氨酰胺、青霉素和鏈霉素購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，水合氯醛、DMEM培養(yǎng)基、TRIzol試劑盒、Annexin V-FITC凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，抗DKK-1、抗Bcl-2、抗Bax、抗磷酸化Akt(p-Akt)、抗Akt和抗β-actin抗體、DKK-1 siRNA購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司，X-tremeGENE siRNA轉(zhuǎn)染試劑、FuGENE HD 轉(zhuǎn)染試劑盒為美國(guó)Roche公司產(chǎn)品，硝酸纖維膜為德國(guó)GE Healthcare公司產(chǎn)品，MTT、ECL試劑盒購(gòu)自江蘇碧云天公司。其他包括G418(Genview，Carlsbad，Calif)及SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ(Takara，大連)。

1.3方法

1.3.1大鼠腦出血模型制備：以腹膜內(nèi)注射10%(質(zhì)量濃度)水合氯醛麻醉大鼠，以碘附消毒頭頂皮膚，縱向切開(kāi)約1.5 cm切口，暴露顱骨，在前囟后1.40 mm，矢狀縫向右3.20 mm處開(kāi)顱鉆孔(直徑1 mm)。斷尾收取自體全血(50 μL)，無(wú)菌注射器注入右側(cè)尾狀殼核。留針10 min后，縫合皮膚切口，并將大鼠置于12 h光照-黑暗循環(huán)的無(wú)菌條件中飼養(yǎng)。假手術(shù)組僅插入注射器，不注射自體血，對(duì)照組小鼠不做任何處理。分別采用Western blot和Real-time PCR方法檢測(cè)造模術(shù)后0、6、12、24、72、120 h大鼠血腫周?chē)X組織中 Bcl-2、Bax、pAkt、Akt及DKK-1 和表達(dá)水平。

1.3.2腦出血模型評(píng)估：(1)平衡木行走試驗(yàn)：腦出血術(shù)后3 h測(cè)定運(yùn)動(dòng)整合及協(xié)調(diào)能力，平衡木長(zhǎng)80 cm，寬 2.5 cm，平放在距離地面高10 cm 處。按Feeney等[5]評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：0分：穿過(guò)平衡木，不會(huì)跌倒；1分：穿過(guò)平衡木，跌倒機(jī)會(huì)少于50%；2分：穿過(guò)平衡木，跌倒機(jī)會(huì)大于50%；3分：能穿過(guò)平衡木，但受累的癱瘓側(cè)后肢不能幫助向前移動(dòng)；4分：不能穿過(guò)平衡木，但可坐在上面；5分：將大鼠放在平衡木上會(huì)掉下來(lái)。正常為0分，1～4 分視為造模成功。(2)肌力測(cè)驗(yàn)：術(shù)后3 h進(jìn)行大鼠肌力測(cè)驗(yàn)，直徑0.15 mm鐵絲繩，長(zhǎng)46 cm，置于距地面70 cm高度上，其下放泡沫箱。將大鼠兩個(gè)前爪放在繩上，放開(kāi)，記錄大鼠在繩上的時(shí)間。0分：掛在繩上 0～2 s；1分：掛在繩上3～4 s；2分：掛在繩上5 s；3分：掛在繩上5 s，將后腿放在繩上。肌力測(cè)驗(yàn)3分為正常，低于3分視為運(yùn)動(dòng)功能受損。

1.3.3原代大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元的分離和培養(yǎng)：取一日齡新生SD大鼠大腦皮質(zhì)，胰酶消化后獲取單細(xì)胞懸液，以每孔2×106個(gè)細(xì)胞接種于6孔板中。培養(yǎng)基為含10% (體積分?jǐn)?shù))馬血清、25 mmol/L葡萄糖、10 mmol/L HEPES、2 mmol/L谷氨酰胺、100 IU / mL青霉素和0.1 mg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基。于37 ℃、含5%(體積分?jǐn)?shù))CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3 d更換1次培養(yǎng)液。將培養(yǎng)的原代大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元分為對(duì)照組、空載體組、DKK-1過(guò)表達(dá)組、BDBT10(Akt磷酸化激活劑)過(guò)表達(dá)組、DKK-1過(guò)表達(dá)組以及DKK-1+BDBT10共轉(zhuǎn)染組。分別采用Western blot和Real-time PCR方法檢測(cè)各組細(xì)胞 Bcl-2、Bax、pAkt、Akt及DKK-1蛋白和mRNA表達(dá)水平。

1.3.4腦出血大鼠大腦取材：采用10%(質(zhì)量濃度)水合氯醛腹腔注射將大鼠過(guò)量麻醉，75%(體積分?jǐn)?shù))乙醇消毒。斷頭后剪開(kāi)頭皮去除周?chē)∪?，小心打開(kāi)顱骨取出大鼠全腦。去除腦膜及血管后，取血腫周?chē)X組織，將取出的大小約 1 mm3的腦組織迅速冷凍備用。

1.3.5Western blot：分別提取大鼠腦組織和細(xì)胞總蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳完畢后將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜。將膜置于含10%(質(zhì)量濃度)脫脂奶粉PBS中4 ℃封閉1 h。加入一抗孵育1～2 h，TBST清洗之后加入HRP標(biāo)記的二抗孵育30 min，TBST洗膜，采用ECL試劑盒顯色，膠片拍照，用凝膠圖像分析系統(tǒng)對(duì)蛋白條帶進(jìn)行分析。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.3.6Real-time PCR：使用TRIzol試劑盒提取組織或細(xì)胞總RNA。使用Oligo-dT引物和PrimeScript?RT 試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。DKK-1引物：5′-CCAGACTCTTGACAACTACC-3′(順式)， 5′-GATGCTTTCCTCAATTTCCC-3′(反式)；以β-actin為內(nèi)參。引物由上海生工生物公司合成。采用Real-time PCR 試劑盒SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ，反應(yīng)總體系為25 μL，含cDNA 20 ng、引物0.4 μmol/L。反應(yīng)條件：95℃ 5 min預(yù)變性；94℃ 20 s，60 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min 進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)在Bio-Rad iQ5 實(shí)時(shí)定量PCR儀中進(jìn)行，目的基因和β-actin 基因的拷貝數(shù)分別根據(jù)Ct值計(jì)算獲得。取3次重復(fù)的平均值，用目的基因的拷貝數(shù)除以β-actin 的拷貝數(shù)作為靶基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.3.7過(guò)表達(dá)載體的構(gòu)建及細(xì)胞轉(zhuǎn)染：細(xì)胞總RNA的提取及cDNA的反轉(zhuǎn)錄如前所述。利用含BmtⅠ和PstⅠ酶切位點(diǎn)的引物擴(kuò)增大鼠DKK-1和BTBD10 cDNA，DKK-1正向引物為5′-GGCTAGCCTATGAGGGCGGGAACAAG-3′，反向引物為：5′-GCTGCAGCGAGCGAACTGGTGAGCAA-3′；BTBD10正向引物為：5′-GGCTAGCCCATCTCGTCCAAGCAGTCC-3′，反向引物為：5′-GCTGCAGCCGGCTCTTTCCTTCCTCCT-3′。雙酶切DKK-1和BTBD10擴(kuò)增產(chǎn)物插入pcDNA3.1載體中，獲取 pcDNA3.1- DKK-1和pcDNA3.1- BTBD10重組表達(dá)質(zhì)粒。使用FuGENE HD 轉(zhuǎn)染試劑盒進(jìn)行轉(zhuǎn)染。采用Real-time PCR和Western blot檢測(cè)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞DKK-1和BTBD10的表達(dá)。

1.3.8細(xì)胞增殖測(cè)定：采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖。收集細(xì)胞，胰酶消化后計(jì)數(shù)，以6×104個(gè)/孔接種于96孔培養(yǎng)板，每孔加入10 μL MTT于37 ℃ 孵育4 h，加入100 μL的DMSO以溶解Formazan，置搖床震蕩至Formazan充分溶解，用酶標(biāo)儀測(cè)定560 nm處吸光度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.9細(xì)胞凋亡測(cè)定：采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡。收集細(xì)胞，在PBS中洗滌，采用Annexin V-FITC凋亡檢測(cè)試劑盒，于FACS流式細(xì)胞儀中進(jìn)行雙色熒光細(xì)胞流式計(jì)數(shù)，計(jì)算凋亡細(xì)胞百分比。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1腦出血模型評(píng)估 腦出血組大鼠平衡木行走得分高于對(duì)照組和假手術(shù)組(P<0.05)，而肌力測(cè)驗(yàn)評(píng)分顯著低于對(duì)照組和假手術(shù)組(P<0.05)，假手術(shù)組與對(duì)照組間大鼠平衡木行走得分和肌力測(cè)驗(yàn)評(píng)分無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(表1)。

表 1　各組大鼠平衡木行走和肌力

注：與對(duì)照組和假手術(shù)組分別比較，aP<0.05

2.2細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá) 與對(duì)照組比較，腦出血組大鼠腦組織中Bcl-2蛋白表達(dá)降低(P<0.05)，促凋亡分子Bax表達(dá)增高(P<0.05)，p-Akt表達(dá)降低(P<0.05)，Akt總蛋白表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，假手術(shù)組大鼠各基因表達(dá)量與對(duì)照組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。與0 h比較，大鼠腦出血6、12、24、72、120 h后腦組織中Bcl-2蛋白表達(dá)降低(P<0.05)，而B(niǎo)ax表達(dá)則于腦出血后12、24、72、120 h升高(P<0.05)，p-Akt表達(dá)于腦出血6、12、24、72、120 h后下降(P<0.05)，而Akt總蛋白表達(dá)量未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)變化(P>0.05)。具體結(jié)果見(jiàn)圖1～4。

與對(duì)照組比較，aP<0.05；與組內(nèi)0 h點(diǎn)比較，bP<0.05。表2～6同

圖1各組大鼠造模術(shù)后不同時(shí)間腦組織Bcl-2蛋白表達(dá)比較

圖2各組大鼠造模術(shù)后不同時(shí)間腦組織Bax蛋白表達(dá)比較

圖3各組大鼠造模術(shù)后不同時(shí)間腦組織p-Akt的蛋白比較

圖4各組大鼠造模術(shù)后不同時(shí)間腦組織Akt蛋白比較

圖5各組大鼠造模術(shù)后不同時(shí)間腦組織DKK-1 mRNA表達(dá)量

圖6各組大鼠造模術(shù)后不同時(shí)間腦組織DKK-1蛋白表達(dá)量

2.3各組大鼠腦組織DKK-1及其mRNA表達(dá)與對(duì)照組比較，腦出血組大鼠腦組織中DKK-1 mRNA和蛋白表達(dá)升高(P<0.05)，假手術(shù)組大鼠與對(duì)照組大鼠比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與0 h比較，大鼠腦出血12 h、24 h、72 h、120 h時(shí)間點(diǎn)腦組織DKK-1 mRNA和蛋白表達(dá)均升高(均P<0.05)。具體結(jié)果見(jiàn)圖5～6。

2.4DKK-1轉(zhuǎn)染上調(diào)DKK-1的表達(dá) DKK-1轉(zhuǎn)染組大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元中DKK-1 mRNA和DKK-1蛋白表達(dá)水平均高于對(duì)照組和空載體組(P<0.05)，而對(duì)照組與空載體組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果見(jiàn)圖7。

2.5DKK-1在體外促進(jìn)大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元凋亡 DKK-1轉(zhuǎn)染組細(xì)胞凋亡率達(dá)(56±6)%，高于對(duì)照組和空載體組的(12±2)%和(13±3)%(P<0.05)；而對(duì)照組和空載體組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.6DKK-1通過(guò)抑制Akt磷酸化促進(jìn)細(xì)胞凋亡DKK-1過(guò)表達(dá)組p-Akt表達(dá)水平低于對(duì)照組和空載體組(P<0.05)，而總Akt表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，對(duì)照組與空載體組間p-Akt和Akt表達(dá)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖8A)。BTBD10過(guò)表達(dá)組中p-Akt和Bcl-2蛋白水平高于對(duì)照組及空載體組(P<0.05)，Bax蛋白表達(dá)水平則低于對(duì)照組和空載體組(P<0.05)；對(duì)照組、空載體組及BTBD10過(guò)表達(dá)組間總Akt和DKK-1蛋白表達(dá)比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖8B)。BTBD10過(guò)表達(dá)組神經(jīng)元相對(duì)細(xì)胞存活率高于對(duì)照組和空載體組(P<0.05)，對(duì)照組與空載體組間則無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖8C)；BTBD10和DKK-1共轉(zhuǎn)染組大鼠神經(jīng)元存活率高于DKK-1過(guò)表達(dá)組(P<0.05，圖8D)。

與對(duì)照組和空載體組分別比較，aP<0.05

圖7大鼠神經(jīng)元中轉(zhuǎn)染DKK-1過(guò)表達(dá)載體或空載體后細(xì)胞DKK-1 mRNA和蛋白表達(dá)比較

A、B：Western blot檢測(cè)結(jié)果；C、D：MTT法檢測(cè)結(jié)果；與對(duì)照組比較，aP<0.05

圖8DKK-1或(和)BDBT10過(guò)表達(dá)后神經(jīng)元蛋白表達(dá)及細(xì)胞存活率檢測(cè)

3討論

腦出血發(fā)生的原因主要與腦血管的病變有關(guān)，血液流入腦實(shí)質(zhì)特別是腦室和蛛網(wǎng)膜下腔[6]時(shí)，導(dǎo)致腦實(shí)質(zhì)正常解剖結(jié)構(gòu)的破壞，局部壓力增加，引起腦實(shí)質(zhì)水腫，進(jìn)而引發(fā)炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激等繼發(fā)性損傷[7]。其中，神經(jīng)元凋亡被認(rèn)為是最關(guān)鍵的繼發(fā)性損傷的病理變化之一，該過(guò)程依賴(lài)于復(fù)雜的促凋亡和抗凋亡信號(hào)的精細(xì)調(diào)節(jié)[8]。

DKK-1是一種分泌蛋白，被認(rèn)為是一種促凋亡因子。研究結(jié)果顯示，DKK-1能夠促進(jìn)神經(jīng)退行性病變并參與應(yīng)激誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡[4，9]。DKK-1通過(guò)抑制Wnt信號(hào)通路參與應(yīng)激或病理因素引起的神經(jīng)元凋亡。如長(zhǎng)期雌激素缺乏可引起DKK-1表達(dá)上調(diào)，進(jìn)而誘發(fā)海馬神經(jīng)元Wnt/-catenin信號(hào)通路失調(diào)[10]。Matrisciano等[9]研究發(fā)現(xiàn)DKK-1參與了應(yīng)激誘導(dǎo)的腦海馬損傷。本研究通過(guò)顱內(nèi)注射自體外周血建立腦出血大鼠模型，分析大鼠腦組織相關(guān)基因表達(dá)發(fā)現(xiàn)，腦出血大鼠出血區(qū)域腦組織中的抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)降低，而促凋亡蛋白Bax表達(dá)上升；與此同時(shí)，該區(qū)域中腦組織DKK-1 表達(dá)顯著升高，提示DKK-1與神經(jīng)元的凋亡有關(guān)。

絲氨酸/蘇氨酸激酶Akt是位于生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子和其他細(xì)胞刺激的下游細(xì)胞信號(hào)的控制中心[11]。作為一種關(guān)鍵的信號(hào)調(diào)節(jié)分子，Akt與細(xì)胞存活、細(xì)胞增殖及細(xì)胞生長(zhǎng)密切相關(guān)[11-13]。研究結(jié)果顯示，Wnt家族分子能夠正向調(diào)節(jié)Akt信號(hào)通路。如在人骨肉瘤細(xì)胞中，Wnt5a 能夠激活I(lǐng)P3/Akt信號(hào)通路，進(jìn)而促進(jìn)癌細(xì)胞的遷移[14]；在胰腺癌細(xì)胞中，Wnt5a能夠活化Akt/NF-κB信號(hào)通路，從而抑制胰腺癌細(xì)胞凋亡[15]；在神經(jīng)細(xì)胞中，Wnt1能夠激活A(yù)kt1并發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[16]。作為一種Wnt信號(hào)通路的拮抗抑制劑，DKK-1 在Akt信號(hào)通路中發(fā)揮負(fù)向調(diào)節(jié)的作用。如Weng等[17]研究顯示，下調(diào)DKK-1的表達(dá)能夠促進(jìn)Akt的磷酸化，激活A(yù)kt信號(hào)通路，從而抑制骨細(xì)胞的凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)，在大鼠神經(jīng)元中，過(guò)表達(dá)DKK-1能夠抑制Akt的磷酸化。作者推測(cè)：DKK-1可能通過(guò)抑制Wnt信號(hào)發(fā)揮負(fù)向調(diào)節(jié)Akt信號(hào)通路的作用。BTBD10是一種Akt磷酸化激激活劑，其作用原理是通過(guò)降低蛋白磷酸酶2A對(duì)Akt的去磷酸化及抑制作用[18]。為驗(yàn)證上述推測(cè)，本研究通過(guò)上調(diào)神經(jīng)元中BTBD10水平，并探討B(tài)TBD10與神經(jīng)元存活率間的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，上調(diào)神經(jīng)元中BTBD10的表達(dá)可增強(qiáng)Akt磷酸化水平，但是對(duì)Akt總蛋白及DKK-1蛋白表達(dá)的影響則較小。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，BTBD10過(guò)表達(dá)顯著提高神經(jīng)元的存活率。采用BTBD10與DKK-1共轉(zhuǎn)染處理，神經(jīng)元的存活率顯著高于DKK-1轉(zhuǎn)染組，表明DKK-1抑制神經(jīng)元存活與其抑制Akt的磷酸化有關(guān)，而對(duì)DKK-1的表達(dá)沒(méi)有直接作用關(guān)系。進(jìn)一步提示DKK-1誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡是通過(guò)對(duì)Akt信號(hào)通路的抑制實(shí)現(xiàn)。

綜上所述，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)DKK-1在發(fā)生神經(jīng)元凋亡的出血區(qū)域腦組織中高表達(dá)，提示DKK-1可能參與了神經(jīng)元凋亡的過(guò)程。通過(guò)體外上調(diào)DKK-1在大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元凋亡中的表達(dá)，證實(shí)了DKK-1具有促進(jìn)神經(jīng)元凋亡的作用，且DKK-1部分通過(guò)抑制Akt磷酸化促進(jìn)神經(jīng)元的凋亡。如何抑制腦出血后DKK-1的表達(dá)，從而減少腦出血造成的神經(jīng)元凋亡尚需進(jìn)一步研究。

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(本文編輯：時(shí)秋寬)

Effect and mechanism of DKK-1 in neuronal apoptosis in rat with hemorrhagic stroke

ZHANGFanxi*,ZHANGJianmin,HUANGXiaolong,ZHOUYufeng,CHENPeng.

*DepartmentofNeurosurgery, 324HospitalofthePeople’sLiberationArmy,Chongqing400020,ChinaCorresponding author: ZHANG Fanxi, Email:aienlifz@163.com

ABSTRACT:ObjectiveTo investigate the role and mechanism of Dickkopf-1 (DKK-1) in neuronal apoptosis of rat with intracerebral hemorrhage(ICH). MethodsAdult male SD rats(n=40) were randomly divided into the control group (n=13), the sham group (n=13) and the ICH group (n=14). The ICH rat model was established by intracerebral injection of peripheral blood. This model was assessed by beam-walking assay and muscle strength testing. Furthermore, expressions of Bcl-2, Bax, p-Akt, Akt and DKK-1 protein and the mRNA were analyzed by Real-time PCR and Western blot. Primary rat cortical neurons were divided into groups as follows: (1) the control,empty vector and DKK-1 overexpression group; (2)the control,empty vector and BTBD10 overexpression group. The expressions of DKK-1 and phosphorylated Akt were analyzed. The apoptosis was determined by flow cytometry. ResultsThe score of beam walking assay in the ICH group was significantly increased, and the muscle testing score was significantly lower than that in the control and sham groups (all P<0.05).Compared with the control and sham groups, the expressions of Bcl-2 and p-Akt in brain tissues of rats with cerebral hemorrhage decreased, whereas the expressions of Bax and DKK-1 increased after ICH treatment(all P<0.05). In primary rat cortical neurons, the apoptosis rate and p-Akt expression level in the DKK-1 overexpression group were significantly higher than those in the empty vector and control groups (P<0.05).Furthermore, the p-Akt level in the BTBD10 (an Akt phosphorylation activator) overexpression group was significantly higher than that of the empty vector and control groups (all P<0.05). Bcl-2 protein level in the BTBD10 overexpression group was significantly higher, while Bax protein expression was significantly lower than those in the empty vector and control groups (all P<0.05). Additionally, the neuronal survival rate in the BTBD10 overexpression group was significantly higher than that in the empty vector and control groups (all P<0.05) and the neuronal survival rate in the BTBD10 and DKK-1 co-transfected group was significantly higher than that in the DKK-1 transfected group (P<0.05). ConclusionsDKK-1 overexpression might promote neuronal apoptosis in rats with hemorrhagic stroke through the inhibition of Akt phosphorylation.

Key words:cerebral hemorrhage; DKK-1; apoptosis; Akt

doi：10.3969/j.issn.1006-2963.2016.01.005

基金項(xiàng)目：中國(guó)人民解放軍神經(jīng)創(chuàng)傷防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室2013年開(kāi)放課題資助項(xiàng)目(NTP2013005)；國(guó)家科技惠民計(jì)劃項(xiàng)目(2013GS500101-15)

通訊作者：張凡喜，Email：aienlifz@163.com

中圖分類(lèi)號(hào)：R743.3+4

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1006-2963 (2016)01-0019-06

(收稿日期：2015-02-04)