產(chǎn)直鏈脂肽類抗菌物質(zhì)枯草芽孢桿菌HS-A38的生物學(xué)特性

馬 樹 瑞，　叢 麗 娜，　孫　 蕾，　李 　 成，　王　 巖，　張　 歡，　張　 齊

( 大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院, 遼寧 大連　116034 )

產(chǎn)直鏈脂肽類抗菌物質(zhì)枯草芽孢桿菌HS-A38的生物學(xué)特性

馬 樹 瑞，叢 麗 娜，孫 蕾，李 成，王 巖，張 歡，張 齊

( 大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院, 遼寧 大連116034 )

摘要:以從海參腸道中篩選的枯草芽孢桿菌HS-A38為目的菌株，分析了其生長特性、產(chǎn)酶特性、抑菌活性及其產(chǎn)生抗菌活性物質(zhì)的能力。結(jié)果表明，培養(yǎng)時間為36～38 h時芽孢出芽率最高，該菌株具有較強的抑菌作用，并具有產(chǎn)生蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶和果膠酶的能力。從該菌株的發(fā)酵后上清液中提取得到2種具有抗菌活性的化合物，初步推斷這2種物質(zhì)為直鏈脂肽類抗菌物質(zhì)。

關(guān)鍵詞:枯草芽孢桿菌；抗菌活性；脂肽類抗菌物質(zhì)

0引言

枯草芽孢桿菌廣泛分布于自然界中，如土壤，湖泊，海洋，植物組織，動物類諸如豬腸道、雞腸道、對蝦胃腸道中。枯草芽孢桿菌無致病性，可分泌多種酶和抗生素?？莶菅挎邨U菌具有良好的發(fā)酵基礎(chǔ)[1]，在水質(zhì)處理、醫(yī)藥、食品、飼料工業(yè)等眾多領(lǐng)域都具有廣泛的應(yīng)用[2]。枯草芽孢桿菌是農(nóng)業(yè)部公布的12種飼料級微生物添加劑之一，可直接飼喂動物[3]，不僅能夠促進動物健康生長，又可降低抗生素的用量[4]。劉雪等[5-6]報道了枯草芽孢桿菌由核糖體合成途徑產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)，如細菌素、酶類、活性蛋白質(zhì)類以及非核糖體合成途徑產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)，如脂肽類、多肽類等。近年來，多種枯草芽孢桿菌的抗菌活性物質(zhì)已經(jīng)從其代謝產(chǎn)物中分離純化出來[7-8]，研究人員對其結(jié)構(gòu)組成、作用機理進行了詳細介紹，為枯草芽孢桿菌在植物病蟲害生物防治中的應(yīng)用提供了參考。課題組從大連海域海參腸道中篩選得到了一株枯草芽孢桿菌HS-A38，本實驗對該菌株的生長特性、酶學(xué)性質(zhì)以及產(chǎn)活性物質(zhì)進行了初步研究。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1菌株

枯草芽孢桿菌HS-A38，實驗室分離，16SrDNA序列在GenBank數(shù)據(jù)庫檢索號為GQ466597。

指示菌：金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、溶壁微球菌(Micrococcus lysodeikticus)、副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)，實驗室分離保存。

1.1.2培養(yǎng)基

種子液培養(yǎng)基：酵母膏1g/L，蛋白胨5g/L，磷酸鐵0.1g/L，pH7.2。

菌株HS-A38發(fā)酵培養(yǎng)基：牛肉膏15g/L，葡萄糖10g/L，K2HPO45g/L，pH7.2。

HS-A38固體培養(yǎng)基：在發(fā)酵培養(yǎng)基中加入1.5%的瓊脂粉。

指示菌液體培養(yǎng)基：牛肉膏3g/L，蛋白胨10g/L，氯化鈉5g/L，pH7.2～7.4。

指示菌固體培養(yǎng)基：在發(fā)酵培養(yǎng)基中加入1.5% 的瓊脂粉。

1.2方法

1.2.1菌株HS-A38生長特性測定

菌株形態(tài):將保存的HS-A38菌株在固體培養(yǎng)基上30 ℃ 培養(yǎng)24h，觀察菌落形態(tài)。挑取培養(yǎng)基上的單菌落進行革蘭氏染色,在顯微鏡下進行菌株形態(tài)觀察。

生長曲線:將保存在斜面上的菌種挑取少許接入10mL的種子液培養(yǎng)基中，在30 ℃、轉(zhuǎn)速160r/min條件下培養(yǎng)16h即為種子液。將活化后的HS-A38菌株的種子液按5%的體積分數(shù)接入50mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，在30 ℃、160r/min的條件下?lián)u床培養(yǎng)，每隔4h取樣，用分光光度計測吸光值OD600。橫坐標(biāo)為培養(yǎng)時間，縱坐標(biāo)為OD600測量值繪制菌株HS-A38的生長曲線。

出芽孢時間：將菌株HS-A38在發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每隔4h取樣，用電子顯微鏡觀察其出芽孢情況。

1.2.2菌株HS-A38發(fā)酵液抑菌譜測定

采用管碟法[9]測定菌株HS-A38發(fā)酵液對指示菌的抗菌活性。取100μL指示菌培養(yǎng)液，均勻涂布在指示菌固體平皿培養(yǎng)基上，抑菌平板上放置滅過菌的牛津杯，分別取200μL菌株HS-A38的發(fā)酵上清液加入牛津杯中，于37 ℃過夜培養(yǎng)，觀察測量抑菌圈。

1.2.3菌株HS-A38產(chǎn)酶特性測定

蛋白酶活力：采用福林法[10]測定。1mL上清液在pH8.0、40 ℃，每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生1mol酪氨酸的酶量為1個酶活力單位(U)。

脂肪酶活力：采用p-NPP法[11]測定。1mL上清液在pH7.0、37 ℃，每分鐘水解p-NPP并釋放1molpNP的酶量為1個酶活力單位(U)。

淀粉酶活力：采用碘指示法[12]測定。1mL上清液在pH6.0、40 ℃，每分鐘水解1mg淀粉所需的酶量為1個酶活力單位(U)。

纖維素酶活力：測定采用DNS法[13]測定。1mL上清液在pH5.4、37 ℃，每分鐘從4mg/mL的羧甲基纖維素鈉溶液中產(chǎn)生1μmol還原糖的酶量為1個酶活力單位(U)。

果膠酶活力：采用DNS法[14]測定。1mL上清液在pH4.8、40 ℃，每分鐘水解果膠產(chǎn)生1μg半乳糖醛酸的酶量為1個酶活力單位(U)。

1.2.4菌株HS-A38產(chǎn)活性物質(zhì)的初步檢測

抗菌粗品制備:發(fā)酵液1 000mL經(jīng)8 000r/min離心20min得到上清液，用6mol/L的HCl調(diào)節(jié)上清液pH至2.0，4 ℃靜置過夜；將上清液離心后保留沉淀，再用甲醇充分溶解沉淀，過濾得到棕色液體提取物；蒸干提取物，丙酮溶解得到黃色液體產(chǎn)物，再向其中加入飽和正丁醇萃取，萃取3次，取出正丁醇層，將正丁醇層在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中蒸干得到淺棕色固體粗提物。

取蒸干得到的粗提物0.1g溶于2mL甲醇中混勻；取5μL樣品在薄層層析(TLC)分析板上點樣，在層析缸中展開。展開劑為氯仿-甲醇-水(V(氯仿)∶V(甲醇)∶V(水)=65∶25∶4)，0.5%茚三酮水溶液染色。

活性化合物的分離及檢測:采用制備型層析板制取技術(shù)分離TLC板上的2種化合物(P1和P2)。取甲醇溶解粗品液100μL，在板上每點10μL點樣；在層析缸中展開，展開劑為氯仿-甲醇-水(V(氯仿)∶V(甲醇)∶V(水)=65∶25∶4)，干燥；選定茚三酮顯色區(qū)域，在TLC板上確定2種化合物的位置，刮取與此顯色位置對應(yīng)的制備板區(qū)域的硅膠，用甲醇充分溶解，通過離心去除硅膠粉，得到待檢測的物質(zhì)P1和P2。以原粗提物甲醇溶解液為對照，與刮取后分離的提取物一起在TLC板點樣分析。

將分離得到的2種化合物甲醇溶解液用微孔過濾膜過濾除菌，在常溫下使甲醇揮發(fā)，得到的化合物P1和P2。取適量無菌水將化合物P1和P2溶解，并用無菌水作為空白對照，采用濾紙片法檢測其對副溶血弧菌的抑菌活性[15]。參照文獻[16]對化合物P1和P2進行雙縮脲反應(yīng)檢測。

2結(jié)果與分析

2.1菌株HS-A38生長特性

2.1.1菌株形態(tài)特征

菌落形態(tài)特征(圖1(a))：單菌落圓形，表面光滑，隆起，不透明，乳白色，邊緣整齊，有一定黏度。在顯微鏡下觀察經(jīng)革蘭氏染色后的菌株(圖1(b))，發(fā)現(xiàn)HS-A38為革蘭氏陽性菌，菌體呈桿狀,芽孢位于菌體中央或微偏一側(cè)。

圖1　HS-A38的菌落形態(tài)和細胞形態(tài)

2.1.2生長曲線

在一定條件下液體培養(yǎng)菌株HS-A38，根據(jù)相應(yīng)發(fā)酵時間取樣測得菌體吸光值，繪制菌株的生長曲線。生長擬合曲線為y=-2.836x4+0.003x3-0.088x2+1.243x+0.043。由圖1可知菌株HS-A38發(fā)酵基本無延遲期，迅速進入對數(shù)期，6h后進入穩(wěn)定期，36h后進入衰亡期。

圖2　菌株HS-A38的生長曲線

2.1.3芽孢形成時間

每4h對菌株HS-A38培養(yǎng)液進行取樣，在顯微鏡下觀察其出芽孢情況。培養(yǎng)到36～40h時，每個細胞幾乎都產(chǎn)生了芽孢。由菌株HS-A38生長曲線可知，培養(yǎng)36h時生長狀態(tài)處于穩(wěn)定末期，尚未處于衰亡期。因此可以確定,若將HS-A38菌株開發(fā)成益生菌微生態(tài)制劑，選擇培養(yǎng)時間36～38h較為適宜;在此條件下制成的微生態(tài)制劑其芽孢比率高，能夠保持枯草芽孢桿菌的活性和穩(wěn)定性，利于運輸保藏。

2.2菌株HS-A38發(fā)酵液抑菌譜

采用管碟法對菌株HS-A38的發(fā)酵液進行抑菌活性檢驗?？咕钚越Y(jié)果(表1)表明，該發(fā)酵液分泌的代謝物質(zhì)不僅對以金黃色葡萄球菌和溶壁微球菌為代表的革蘭氏陽性菌有很強的抑制作用，而且對以銅綠假單胞菌和副溶血性弧菌為代表的革蘭陰性菌也具有較好的抑菌作用。

表1　菌株HS-A38發(fā)酵上清液的抑菌活性

2.3菌株HS-A38產(chǎn)酶特性

由表2可以看出，枯草芽孢桿菌HS-A38具有分泌脂肪酶、蛋白酶和淀粉酶的能力，不具備分泌纖維素酶的能力。該菌株分泌的這些消化酶，對降解動植物性飼料中復(fù)雜有機物、促進消化吸收、提高飼料利用率非常有利。

表2　枯草芽孢桿菌HS-A38酶活力

2.4菌株HS-A38產(chǎn)直鏈脂肽活性物質(zhì)

該菌株發(fā)酵后的上清液經(jīng)鹽酸沉淀、有機溶劑提取后，在TLC板上經(jīng)展層劑展開、再經(jīng)茚三酮染色后，可以觀察到幾個分離的化合物點。再用制備型的層析板將其中2個化合物點分離并純化，命名為化合物P1和P2(圖3A)。將純化的P1和P2液體樣品點樣至含有副溶血弧菌為指示菌平板的小濾紙片，該平板經(jīng)培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，作為對照組的無菌水的周圍并沒有抑菌圈的出現(xiàn)而化合物P1和P2的周圍出現(xiàn)了抑菌圈(圖3B)，從而證明化合物P1和化合物P2具有抗菌活性。

經(jīng)檢測化合物P1和P2對蛋白酶K不敏感。這2個化合物的茚三酮反應(yīng)均呈陽性，說明它們含有自由N-端。在用酸水解后，茚三酮反應(yīng)和雙縮脲反應(yīng)呈陽性，所以推測它們可能為直鏈的肽類化合物[17-18]。

A：TLC圖譜(a—抗菌粗品)

3結(jié)論

菌株HS-A38分離來自海參腸道，屬于枯草芽孢桿菌(B. subtilis)。通過測定菌株HS-A38的生長曲線和在電子顯微鏡下觀察其出芽孢的情況發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵培養(yǎng)36h時發(fā)酵液的菌體濃度最高，且此時的細胞幾乎全部出現(xiàn)了芽孢，因此確定以發(fā)酵時間36～38h為該菌株的最適培養(yǎng)時間。通過抑菌試驗檢測，枯草芽孢桿菌對以金黃色葡萄球菌和溶壁微球菌為代表的革蘭氏陽性菌以及對以銅綠假單胞菌和副溶血性弧菌為代表的革蘭陰性菌均具有較好的抑菌作用。通過檢測枯草芽孢桿菌發(fā)酵液的酶活，發(fā)現(xiàn)其具有分泌蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、果膠酶活性的能力，尤其是脂肪酶活力較高，不分泌纖維素酶。另外，從該菌株發(fā)酵液提取的粗品中分離得到2種物質(zhì)P1和P2，通過印三酮顯影技術(shù)及雙縮脲反應(yīng)結(jié)果，初步推斷這2種物質(zhì)為一類直鏈脂肽類化合物，并且發(fā)現(xiàn)它們對副溶血弧菌具有明顯的抑制作用。

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BiologicalcharacteristicsofBacillus subtilisHS-A38producinglinearlipopeptideantibacterialsubstance

MAShurui,CONGLina,SUNLei,LICheng,WANGYan,ZHANGHuan,ZHANGQi

(SchoolofBiologicalEngineering,DalianPolytechnicUniversity,Dalian116034,China)

Abstract:Bacillus subtilis HS-A38 was isolated from the sea cucumber intestine and its growth characteristic, produced enzyme, antibacterial activity and the ability of producing antimicrobial substances were analyzed. The results showed that the maximum budding rate was present at 36-38 h. It was shown that the strain had excellent antimicrobial effect and could produce protease, lipase, amylase and pectinase. Two antimicrobial compounds were isolated from the supernatant after fermentation, and were preliminarily deduced to be straight-chain lipopeptide.

Key words:Bacillus subtilis; antibacterial activity; lipopeptide antibacterial substances

收稿日期:2015-03-01.

基金項目:國家海洋食品工程技術(shù)研究中心資助項目(2012FU125X03)；海洋公益性行業(yè)科研專項(201405003-3)；遼寧省教育廳重點實驗室項目(LZ2014029).

作者簡介:馬樹瑞(1990-)，男，碩士研究生；通信作者：叢麗娜(1962-)，女，教授，E-mail：congln@dlpu.edu.cn.

中圖分類號:S917.1

文獻標(biāo)志碼:A

文章編號:1674-1404(2016)03-0181-04