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    預(yù)防用自擬復(fù)方中藥對大腸桿菌感染早期小鼠免疫功能的影響試驗

    2016-06-22 01:42:04左之才余樹民鄧義貞茍麗萍肖越峰四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院環(huán)境公害與動物疾病四川省高校重點實驗室四川雅安625014
    中國獸醫(yī)雜志 2016年3期
    關(guān)鍵詞:大腸桿菌細(xì)胞因子小鼠

    王 嬋,左之才,余樹民,鄧義貞,茍麗萍,肖越峰(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院環(huán)境公害與動物疾病四川省高校重點實驗室,四川雅安625014)

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    預(yù)防用自擬復(fù)方中藥對大腸桿菌感染早期小鼠免疫功能的影響試驗

    王嬋,左之才,余樹民,鄧義貞,茍麗萍,肖越峰
    (四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院環(huán)境公害與動物疾病四川省高校重點實驗室,四川雅安625014)

    摘要:將96只小鼠隨機分為4組,Ⅰ、Ⅱ組生理鹽水灌胃,Ⅲ組復(fù)方中藥灌胃,Ⅳ組黃芪多糖灌胃,連續(xù)3 d;試驗第4天,Ⅰ組注射生理鹽水;Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組小鼠腹腔注射大腸桿菌液。在感染后第3小時、第6小時、第10小時采集小鼠血樣及血清,分別測定其血液生理指標(biāo)(WBC、GRA、LYM及MID)及細(xì)胞因子(TNF-α、IL-6、IL-10、IFN-γ)的變化。結(jié)果自擬復(fù)方中藥具有提高小鼠外周血的WBC(尤其是LYM、MID);促進IL-6分泌,抑制TNF-α、IL-10分泌,使Th2向Th1細(xì)胞漂移,促進腹腔注射大腸桿菌早期小鼠Th2/Th1細(xì)胞亞群恢復(fù)平衡的作用。

    關(guān)鍵詞:復(fù)方中藥;大腸桿菌;小鼠;血液生理指標(biāo);細(xì)胞因子

    在現(xiàn)代集約化畜禽養(yǎng)殖中化學(xué)藥品的濫用、環(huán)境污染,以及一些感染性疾病等因素均可引起動物骨髓產(chǎn)生抑制而使造血功能和免疫功能降低誘發(fā)各類疾病,給畜禽養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大危害。中草藥可以通過影響機體外周白細(xì)胞的數(shù)量以及細(xì)胞因子的分泌達到增強機體免疫功能的作用。單藥如黃芪通過增加健康小鼠及骨髓抑制小鼠的白細(xì)胞總數(shù)(WBC),抑制膿毒癥大鼠腫瘤壞死因子TNF-α、白介素IL-4的表達促進干擾素IFN-γ的表達發(fā)揮其免疫調(diào)節(jié)機能[1-3]。如復(fù)方白頭翁湯具增加小鼠的WBC,并且能提高淋巴細(xì)胞(LYM)的增殖能力[4];玉屏風(fēng)散具有增加表虛征候小鼠的WBC、LYM及淋巴細(xì)胞百分比(LYM%)的作用[5]。

    現(xiàn)代養(yǎng)殖中常以中醫(yī)“治未病”理論為指導(dǎo),為防止在各種應(yīng)激引起畜禽發(fā)生疾病常采取預(yù)防性用藥。以清熱解毒、燥濕健脾、補血和血為原則的中藥復(fù)方,能明顯改善環(huán)磷酰胺致骨髓抑制小鼠的血液生理指標(biāo),并通過細(xì)胞因子IL-2、IL-4等發(fā)揮正向免疫調(diào)節(jié)作用,其中以10 g/kg體重劑量應(yīng)用效果最佳[6-7]。為進一步探討該復(fù)方中藥在早期預(yù)防感染、調(diào)節(jié)機體免疫功能過程中的作用,開展本試驗研究。

    1 材料與方法

    1.1試驗藥物自擬中藥復(fù)方由魚腥草、蒲公英、陳皮、蒼術(shù)、白芍、白術(shù)、當(dāng)歸、白頭翁、大青葉、茯苓、甘草、黃柏、黃芪、連翹等14味中草藥組成,制備見參考文獻[6]。黃芪多糖注射液(10 mL含0.1 g)成都乾坤動物藥業(yè)有限公司,批號:20130609。

    1.2試驗菌株及菌液配制大腸桿菌(vmzs E.coli)從患水腫病竹鼠腹腔積液中分離,由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)內(nèi)科實驗室保存。該菌對昆明系小鼠的LD0為1.7×107CFU[8]。將vmzs E.coli復(fù)壯并接種于5 mL MH肉湯培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)16~18 h,測定其OD值,估算其菌液濃度,再用平板菌落計數(shù)法將菌液濃度稀釋至約為1.7×108CFU/mL,備用。

    1.3實驗動物清潔級昆明系小鼠100只,6~8周齡,體重18~22 g,雌雄各半,購自四川大學(xué)華西醫(yī)學(xué)中心實驗動物中心。

    1.4主要試劑和儀器小鼠TNF-α、IFN-γ、IL-6、IL-10 ELISA檢測試劑盒,均購自武漢基因美生物科技有限公司,批號:Lot.201303;全自動血球分析儀(ABACUS Junior Vet瑞士),全自動熒光酶標(biāo)分析儀(PR-521)。

    1.5實驗動物分組與處理選取96只小鼠隨機分為4組,每組24只。I組(健康對照組);Ⅱ組(感染組)生理鹽水灌胃;Ⅲ組(復(fù)方中藥組)復(fù)方中藥灌胃(劑量為10 g/kg;相當(dāng)于生藥含量);Ⅳ組(對照藥物組)黃芪多糖灌胃(66 mg/kg體重)。各組均按每10 g體重灌服0.1 mL,1次/d,連續(xù)3 d;試驗第4天上午8:00,I組腹腔注射0.1 mL生理鹽水,Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組腹腔注射0.1 mL菌液。各組按常規(guī)飼養(yǎng)管理。

    1.6檢測指標(biāo)及方法在感染后3、6、10 h時,每組各隨機選取8只小鼠,雌雄各半,眼球摘除取血1 mL,其中0.3 mL用EDTA-K2抗凝后用ABACUS Junior Vet測定小鼠血液生理指標(biāo),包括WBC、GRA、LYM、MID等。剩余血液分離血清,用PR-521檢測小鼠TNF-α、IFN-γ、IL-6、IL-10的含量。

    1.7數(shù)據(jù)處理用SPSS 11.0軟件進行方差分析數(shù)據(jù)用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(X±SD)”表示。P≤0.05表示差異顯著,P>0.05表示差異不顯著。

    2 結(jié)果

    2.1小鼠腹腔注射大腸桿菌前后的臨床癥狀

    各組小鼠精神良好,反應(yīng)靈敏,飲、食欲正常。注射大腸桿菌后,Ⅱ組小鼠逐漸出現(xiàn)精神抑制、活動減少、蜷縮等癥狀;注射后3 h,多數(shù)小鼠的飲、食欲明顯減少,喜扎堆;6 h左右,部分小鼠精神高度沉郁,出現(xiàn)呼吸急促,眼睛分泌物增多等癥狀;10 h后,小鼠病情基本穩(wěn)定,與6 h觀察癥狀相似。而Ⅲ、Ⅳ組的小鼠,除部分在3 h~6 h出現(xiàn)精神稍差、活動減少外,沒有表現(xiàn)其他異常癥狀;在10 h后,小鼠的精神狀態(tài)基本恢復(fù)正常。I組小鼠精神良好,反應(yīng)靈敏,飲、食欲均正常。各組小鼠均無死亡。

    2.2注射大腸桿菌早期小鼠的血液生理指標(biāo)變化見圖1。與I組比較,Ⅱ組小鼠3、6、10 h的WBC、GRA、LYM及LYM%、MID及MID%均顯著降低(P<0.05),GRA%在10 h顯著升高。

    圖1 小鼠血液生理指標(biāo)的變化注:各組同一時間點比較,大寫字母不同表示差異顯著(P≤0.05),下圖同

    2.3注射大腸桿菌早期小鼠的細(xì)胞因子變化,見圖2。Ⅱ組小鼠3、6、10 h的TNF-α、IL-10、IFN-γ含量及IL-10/IFN-γ比值,以及6、10 h的IL-6含量較I組顯著升高(P<0.05)。Ⅱ組小鼠3 h的IL-10含量及IL-10/IFN-γ比值顯著高于6、10、3 h的TNF-α含量顯著高于10 h(P<0.05);而3 h的IFN-γ含量顯著低于10 h(P<0.05)。I組小鼠各時間點的指標(biāo)間變化不明顯。

    圖2 小鼠血液細(xì)胞因子的變化

    2.4使用復(fù)方中藥及黃芪多糖小鼠的血液生理指標(biāo)變化,見圖1。與Ⅱ組比較,Ⅲ組小鼠3、6、10 h的LYM、MID,3、6 h的WBC以及3 h的MID%、10 h的LYM%顯著升高(P<0.05);10 h的GRA%顯著降低(P<0.05)。Ⅳ組小鼠3、6、10 h的 WBC、GRA、MID,6、10 h的LYM,3、6 h的MID% 及6 h的GRA%,顯著高于Ⅱ組(P<0.05)。

    2.5使用復(fù)方中藥及黃芪多糖小鼠的細(xì)胞因子變化,見圖2。Ⅲ組小鼠3、6、10 h的TNF-α、IL-10含量以及6、10 h的IL-10/IFN-γ比值較Ⅱ組顯著降低(P<0.05)。Ⅲ組小鼠3h的IL-10含量及IL-10/IFN-γ比值顯著高于6、10 h(P<0.05)、而3 h的IFN-γ含量顯著低于10 h(P<0.05)。Ⅳ組小鼠3 h的IL-10含量、IL-10/IFN-γ比值顯著低于Ⅱ組(P<0.05),3 h的IFN-γ含量、10 h的IL-6含量顯著高于Ⅱ組(P<0.05)。Ⅳ組小鼠10 h的TNF-α含量顯著低于3 h(P<0.05),6、10 h的IL-10/IFN-γ比值顯著高于3 h(P<0.05);而6、10 h的IL-10、IFN-γ含量,10 h的IL-6含量顯著高于3 h(P<0.05)。

    3 討論

    3.1小鼠通過自身調(diào)節(jié)提高血液中的GRA及MID,釋放大量的IFN-γ、TNF-α、IL-6、IL-10等細(xì)胞因子抵抗E.coli的早期感染。白細(xì)胞的主要功能是抵御和消滅入侵的病原微生物,實現(xiàn)對機體的保護作用[9]。機體發(fā)生急性感染時,白細(xì)胞總數(shù)往往升高[10-11]。注射E.coli早期(3 h~10 h),小鼠的GRA、MID、LYM及LYM%、MID%較健康對照組顯著下降,GRA%顯著增加。這與小鼠大量白細(xì)胞經(jīng)血管壁向入侵部位游走,發(fā)揮其抗感染(如吞噬、殺滅病原菌)作用有關(guān)。此外,注射E.coli小鼠的WBC、GRA呈先下降后上升,MID、MID%、GRA%呈逐漸上升,而LYM、LYM%呈逐漸下降的變化趨勢。這與小鼠機體發(fā)揮其調(diào)節(jié)機能,提高血液GRA及MID(單核細(xì)胞為主)的數(shù)量,發(fā)揮抗感染作用有關(guān)。

    當(dāng)機體功能發(fā)生異常,Th2/Th1細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)平衡狀態(tài)被打破,進而引起疾病的發(fā)生和發(fā)展[12-13]。常選用IL-10/IFN-γ[14]或IL-4/IFN-γ[3]代表Th2/Th1細(xì)胞亞群比例,反映其漂移變化。注射E.coli小鼠各時間點的細(xì)胞因子(TNF-α、IL-10、IFN-γ)及IL-10/IFN-γ比值(除3 h的IL-6外)均較對照組顯著升高,表明注射E.coli可使小鼠釋放大量的細(xì)胞因子激活機體的免疫功能,打破Th2/Th1細(xì)胞亞群平衡,向Th2漂移。

    3.2復(fù)方中藥及黃芪多糖通過提高小鼠的WBC,調(diào)節(jié)Th2/Th1細(xì)胞因子的免疫平衡來抵抗E.coli的早期感染。白芍、白術(shù)、魚腥草等組成的中藥復(fù)方則還具有改善骨髓抑制小鼠血象的作用[6]。注射E.coli早期(3 h~10 h),復(fù)方中藥小鼠的WBC、MID及MID%、LYM及LYM%,以及黃芪多糖小鼠的WBC、GRA、MID及LYM等均高于單獨注射E. coli小鼠??梢姀?fù)方中藥以增加小鼠外周血的LYM、MID為主,提高WBC發(fā)揮抗感染作用;而黃芪多糖提高WBC,則以增加GRA、MID為主。

    犀角地黃湯具有降低感染脂多糖小鼠IFN-γ的分泌量,促進Th2/Th1細(xì)胞平衡的恢復(fù),減輕炎性損傷的作用[15]。本復(fù)方中藥通過抑制E.coli所致小鼠TNF-α、IL-10、IFN-γ、IL-10/IFN-γ比值的升高,提高IL-6,促進Th2向Th1漂移,恢復(fù)Th2/ Th1平衡;而黃芪多糖則以抑制E.coli所致小鼠的IL-10及IL-10/IFN-γ比值升高,促進IFN-γ、IL-6分泌,使Th2向Th1細(xì)胞漂移,恢復(fù)Th2/Th1平衡。

    4 結(jié)論

    復(fù)方中藥主要通過提高小鼠外周血的WBC(尤其是LYM、MID),促進IL-6分泌,抑制TNF-α、IL-10分泌,使Th2向Th1細(xì)胞漂移,恢復(fù)Th2/ Th1細(xì)胞因子平衡而發(fā)揮機體抵抗感染的作用;而黃芪多糖則以提高小鼠外周血的WBC(尤其是GRA、MID),促進IFN-γ、IL-6分泌,特別是抑制IL-10分泌,使Th2向Th1細(xì)胞漂移,恢復(fù)Th2/Th1細(xì)胞因子平衡而發(fā)揮作用。

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    中圖分類號:S859.3

    文獻標(biāo)志碼:B

    文章編號:0529- 6005(2016)03- 0066- 03

    收稿日期:2014-12-31

    基金項目:四川省科技廳支撐項目(2013NZ0032)

    作者簡介:王嬋(1989-),女,碩士,從事中西獸醫(yī)與臨床研究,E-mail:wangchan89@163.com

    通訊作者:左之才,E-mail:ZZCJL@126.com

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