羅丹明B單克隆抗體的制備及初步鑒定

徐聲樂，李道云，王　興，劉金萍，劉云迎，張　偉，秦海艷，劉若璇，蔡云紅，王捍東（.揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州5009；.常州市第一人民醫(yī)院，江蘇常州3003）

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羅丹明B單克隆抗體的制備及初步鑒定

徐聲樂1，李道云2，王興1，劉金萍1，劉云迎1，張偉1，秦海艷1，劉若璇1，蔡云紅1，王捍東1
（1.揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州225009；2.常州市第一人民醫(yī)院，江蘇常州213003）

摘要：采用N-羥基琥珀酰亞胺活性脂（NHS）法將羅丹明B（Rhodamine B，RB）與牛血清白蛋白（BSA）和卵清蛋白（OVA）分別偶聯(lián)形成免疫原和檢測原，經(jīng)紫外分光光度計(jì)掃描鑒定初步判斷偶聯(lián)成功。以人工合成免疫原免疫BALB/c小鼠，利用雜交瘤技術(shù)獲得了3株穩(wěn)定分泌針對RB抗體的雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為2D1、4C3和7F11，將7F11注入BALB/c小鼠腹腔產(chǎn)生腹水，用所得到的腹水建立了間接競爭ELISA（icELISA）標(biāo)準(zhǔn)曲線。對icELISA的工作條件進(jìn)行了優(yōu)化，方陣試驗(yàn)確定了包被抗原的工作濃度為1∶2 000，腹水抗體的工作濃度為1∶64 000。利用RB作藥物抑制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其線性方程為y=0.2848x-0.2847（R2=0.9924），線性范圍為1～1 000 ng/mL，最低檢測濃度為1 ng/mL。交叉試驗(yàn)表明，該單抗與RB的抑制率為100%，與羅丹明6G、羅丹明123、苯酚紅、副品紅、中性紅、曙紅Y、橙黃Ⅱ、甲基橙、結(jié)晶紫均無交叉反應(yīng)。

關(guān)鍵詞：單克隆抗體；羅丹明B；EL ISA；交叉反應(yīng)

自2011年重慶羅丹明B食品安全事件和2012年5月長沙羅丹明B染色辣椒案以來，某些工業(yè)合成染料用于食品加工的問題，再次引起了人們的高度關(guān)注［1］。RB是一種具有鮮桃紅色的人工合成的三苯甲烷類堿性染料，根據(jù)國際癌癥研究署（IARC）化學(xué)品致癌風(fēng)險(xiǎn)評價(jià)表明：攝取、吸入以及皮膚接觸該物質(zhì)均會造成急性和慢性的中毒傷害［2］。因其具有價(jià)格低廉、色澤紅艷、穩(wěn)定性強(qiáng)等特點(diǎn)，常被某些不法商家用來替代食品添加劑的著色劑，給人們的飲食安全帶來極大隱患，歐盟等國已不允許使用［3］。目前對RB的檢測方法主要是色譜法，色譜法具有準(zhǔn)確度高、特異性強(qiáng)、假陽性率低的特點(diǎn)，其缺點(diǎn)是儀器要求較高、操作過程復(fù)雜、耗時(shí)長、檢測過程繁瑣等，不利于批量篩選［4］。免疫分析基于抗原抗體免疫反應(yīng)的特異性較于儀器分析其特異性強(qiáng)、靈敏度高，不僅可以大大簡化甚至省去樣品前處理的復(fù)雜過程，而且避免了因大量使用溶劑而對環(huán)境造成的污染［5］。本研究旨在制備出特異性高、純度高的抗RB的單克隆抗體，以用于針對檢測RB的試劑盒及膠體金免疫層析試紙條的生產(chǎn)。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料6～8周齡雌性BALB/c小鼠由揚(yáng)州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供；羅丹明B、N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）、1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC·HCl）、N-羥基琥珀酰亞胺、弗氏完全佐劑、不完全佐劑（Freund's Adjuvant complete or incomplete），50%PEG溶液（lot36k2321），次黃噪呤、胸腺嘧淀核苦、氨基蝶呤和辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠IgG（Goatanti-mouse IgG-HRP），均購自Sigma公司；羅丹明123、明膠、牛血清白蛋白、二甲基亞砜（DMSO）、尿素過氧化氧（Urea hydrogen peroxide adduct，UHP），購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；羅丹明6G，購自成都西亞化工股份有限公司；DMEM（Dulbecco's Modified Eagle Medium，lot 1331089），購自GIBCO公司；新生牛血清，購自上海洛神生物技術(shù)有限公司；TMB （Tetramethylbenzidine），購自BBI公司；苯酚紅、副品紅、中性紅、曙紅Y、橙黃Ⅱ、甲基橙、結(jié)晶紫均為分析純。

UV-2401PC型紫外-可見分光光度計(jì)，日本島津公司；HiTrap Protein G HP純化柱，購自GE公司。

1.2抗原合成與鑒定采用NHS法［6］將RB分別與BSA和OVA進(jìn)行反應(yīng)。

甲液：稱取51.5 mg RB，溶于2 mL PBS中，加入12.3 mg NHS和20.6 mg EDC-HCl，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)過夜。取反應(yīng)后的液體進(jìn)行離心（3 500 r/min離心10 min），吸取上清。

乙液：236.6 mg BSA溶于5 mL PBS中，30 mg OVA溶于4 mL PBS中。

分別將甲液上清緩慢滴加到乙液BSA溶液和OVA溶液中，4℃攪拌反應(yīng)過夜。反應(yīng)結(jié)束后，離心取上清裝入透析袋中，用PBS透析3 d （4℃），1 d換3次透析液，小管分裝冷藏備用?？乖铣陕肪€見圖1。

圖1　抗原合成路線

利用紫外分光光度計(jì)掃描載體蛋白標(biāo)準(zhǔn)液、RB標(biāo)準(zhǔn)液以及合成好的人工抗原。

1.3單克隆抗體的制備

1.3.1免疫程序以RB-BSA為免疫原，按常用免疫程序?qū)ALB/c小鼠進(jìn)行免疫。為達(dá)到較好的免疫效果，本次試驗(yàn)共免疫6次，且期間在3免和5免后10 d分別尾靜脈采血檢測小鼠的免疫情況，最后選擇檢測結(jié)果最佳的小鼠進(jìn)行細(xì)胞融合。

1.3.2細(xì)胞融合參照劉秀梵介紹的方法［7］，將小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0與加強(qiáng)免疫之后的BALB/c小鼠脾細(xì)胞按1∶5的數(shù)量比進(jìn)行混合，之后加入50%的PEG在37℃水浴中進(jìn)行融合。融合后細(xì)胞分別滴加到已經(jīng)鋪好有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔細(xì)胞板中，100 μL/孔。然后將96孔細(xì)胞板放置于37℃，5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行選擇性培養(yǎng)。24 h之后，輕輕將細(xì)胞板拿出，仔細(xì)觀察細(xì)胞孔有無污染情況，3 d后觀察細(xì)胞融合是否成功。

1.3.3陽性孔的篩選間接ELISA聯(lián)合間接競爭ELISA篩選陽性孔：取每一孔雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)上清，分為等量的2份，各50 μL。1份加50 μL PBS緩沖液，另1份加50 μL適宜濃度RB，分別做ELISA。

1.3.4腹水的制備用高壓過的液體石蠟無菌注入BALB/c小鼠腹腔，14 d后腹腔接種對數(shù)生長期的雜交瘤細(xì)胞。間隔5 d后，每天觀察小鼠腹水產(chǎn)生情況，采集腹水。將腹水離心，取中間層，測定效價(jià)，分裝，-70℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.5單克隆抗體效價(jià)測定利用ic ELISA［8］測定3株單抗效價(jià)，利用適宜稀釋度的包被原RB-OVA，100 μL/孔加入96孔酶標(biāo)板中，4℃包被過夜，PBST洗板4次后拍干，每次4 min。用含0.2%明膠封閉液PBS封閉，200 μL/孔，37℃溫育2 h，洗板4次拍干每次4 min。每列分別加入系列稀釋濃度的腹水抗體，100 μL/孔，同時(shí)設(shè)空白對照、陰性對照和陽性對照各2孔，每孔各100 μL，37℃作用1 h后，洗板4次拍干，每次4 min。加1∶8 000稀釋的酶標(biāo)二抗，100 μL/孔，37℃溫育1 h，洗板4次拍干，每次4 min。加TMB顯色液，100 μL/孔，37℃避光顯色15 min。最后用2 mol/L H2SO4終止反應(yīng)，50 μL/孔。用酶標(biāo)儀測定每孔的OD450值。

1.3.6單克隆抗體的純化采用HiTrap Protein G HP純化柱按照說明書上的操作進(jìn)行純化。

1.3.7抗原抗體的工作濃度確定包被抗原（RB-OVA）作系列稀釋，每一行為一個(gè)稀釋度，溫浴，洗板；加入含明膠的PBS封閉，溫浴，洗板。血清作系列稀釋，每一列為一個(gè)稀釋度，溫浴，洗板；加入酶標(biāo)二抗，溫浴，洗板；加入底物TMB，37℃避光顯色，用硫酸終止反應(yīng)。在酶聯(lián)免疫檢測儀上讀取OD450值。

1.3.8抗RB單抗標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線以RB-OVA包被ELISA板，加入已配制的不同濃度的RB標(biāo)準(zhǔn)液50 μL，同時(shí)加入2個(gè)工作單位濃度的抗RB單抗，37℃作用1 h。洗板。再加100 μL工作濃度的酶標(biāo)羊抗鼠，37℃作用1 h，洗板。底物顯色。根據(jù)各標(biāo)準(zhǔn)濃度RB所得OD450的梯度變化，繪制標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線。

2　結(jié)果

2.1抗原的鑒定偶聯(lián)產(chǎn)物RB-BSA透析后經(jīng)紫外分光光度計(jì)掃描結(jié)果見圖2。RB在523.50、400.00、354.50、304.50、284.00、259.00、226.00 nm以及206.00 nm處有吸收峰，載體BSA在277.80 nm和226.80 nm處有吸收峰，偶聯(lián)產(chǎn)物RB-BSA在557.50、397.50、352.50、310.50、273.50 nm和215.00 nm處有吸收峰，可見偶聯(lián)后吸收峰發(fā)生了漂移，基本判定半抗原與載體偶聯(lián)成功。

2.2抗RB單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株的建立采用有限稀釋法［9］對陽性孔進(jìn)行亞克隆，經(jīng)過連續(xù)3次亞克隆并且用ELISA檢測方法檢測后陽性率都為100%時(shí)，最終可以確定其為能穩(wěn)定分泌針對RB抗體的細(xì)胞株。然后將細(xì)胞株轉(zhuǎn)移到細(xì)胞瓶中擴(kuò)大培養(yǎng)，及時(shí)凍存。最終獲得細(xì)胞株7F11。

2.3單克隆抗體效價(jià)測定2D1效價(jià)為16 000，4C3效價(jià)為64 000，7F11效價(jià)為512 000。

2.4SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測腹水純化效果7F11腹水純化結(jié)果如圖3，1和2分別為純化前后腹水加樣泳道，最右邊的泳道為Marker。從圖中可以看出純化后雜蛋白條帶明顯減少，說明純化效果較好。

2.5抗原抗體工作濃度的確定細(xì)胞株7F11腹水的試驗(yàn)結(jié)果見表1，由方陣試驗(yàn)結(jié)果，得到包被抗原的工作濃度為1∶2 000，腹水抗體的工作濃度為1∶64 000。

表1　包被抗原的工作濃度及腹水效價(jià)與抑制

圖2　BSA與RB偶聯(lián)物紫外掃描A：RB-BSA；B：RB；C：BSA

圖3　7F11腹水純化結(jié)果M：Marker；1、2：純化前后腹水加樣泳道

2.6 Ci-ELISA標(biāo)準(zhǔn)工作曲線及相關(guān)參數(shù)根據(jù)2.5測得最佳工作濃度條件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，測定RB對抗原抗體結(jié)合反應(yīng)的抑制率。以1-B/B0為縱坐標(biāo)，（1+藥物濃度）的對數(shù)Lg（1+C）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)競爭曲線。

抑制率IC=1-B/B0

半數(shù)抑制濃度IC50對應(yīng)的OD值：

ODIC50值=0.5·B0

檢測下限（LOD）對應(yīng)的OD值：ODLOD=B0-3SD

試驗(yàn)結(jié)果見圖4，RB濃度在1～1 000 ng/mL時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)曲線線性良好，線性方程為y=0.2848x-0.2847 （R2=0.9924），IC50為568.2 ng/mL，LOD為1 ng/mL。

圖4　RB標(biāo)準(zhǔn)競爭抑制線性曲線

2.7抗體特異性鑒定抗體特異性試驗(yàn)結(jié)果表明，該單抗對羅丹明6G、羅丹明123、苯酚紅、副品紅、中性紅、曙紅Y、橙黃Ⅱ、甲基橙、結(jié)晶紫幾乎沒有交叉反應(yīng)，而對RB的抑制率為100%，由此判定該單抗特異性優(yōu)良。

3　討論

免疫分析是以抗原抗體的特異性識別和可逆性反應(yīng)為基礎(chǔ)的痕量分析方法，已在殘留物檢測中得到廣泛應(yīng)用［10］。羅丹明B是一種小分子物質(zhì)，進(jìn)入動物機(jī)體后不能刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，但是如果將其與大分子載體蛋白偶聯(lián)后可以刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，從而產(chǎn)生特異性抗體［11］。

目前針對RB的免疫學(xué)檢測方法的報(bào)道主要有熊友華等［12］采用活性酯法將RB偶聯(lián)于BSA和OVA，合成免疫抗原RB-BSA和檢測抗原RBOVA。將RB-BSA免疫BALB/c小鼠，通過雜交瘤技術(shù)獲得雜交瘤細(xì)胞株17F2，并通過對添加回收率的測定初步建立了RB的快速檢測方法。王庭欣等［13］采用戊二醛法，將半抗原R123與BSA及OVA偶聯(lián)制備免疫抗原R123-BSA和包被抗原R123-OVA。經(jīng)動物免疫試驗(yàn)證實(shí)人工抗原合成，并制備抗R123的多克隆抗體，此抗體同時(shí)能夠檢測食品中的RB。宋姍姍［5］根據(jù)RB的結(jié)構(gòu)，用混合酸酐法與牛血清白蛋白偶聯(lián)，用碳二亞胺法與卵清白蛋白偶聯(lián)，制備出免疫原RB-BSA和包被原RB-OVA。利用免疫原RB-BSA免疫新西蘭大白兔制備多克隆抗體，采用間接ELISA測定效價(jià)、抑制率篩選出特異性好的多克隆抗體。并用RB抗體建立免疫親和柱樣品凈化方法，并利用高效液相-質(zhì)譜聯(lián)用檢測。

本試驗(yàn)利用細(xì)胞融合技術(shù)篩選出3株雜交瘤細(xì)胞，其中7F11細(xì)胞株能穩(wěn)定產(chǎn)生特異性抗體，產(chǎn)生的抗體效價(jià)較高且具有較好的靈敏度（1 ng/ mL）。交叉試驗(yàn)表明，該單抗與RB的抑制率為100%，與羅丹明6G、羅丹明123、苯酚紅、副品紅、中性紅、曙紅Y、橙黃Ⅱ、甲基橙、結(jié)晶紫均無交叉反應(yīng)，表明抗體的特異性良好。本試驗(yàn)為研制羅丹明B殘留免疫檢測試劑盒及膠體金免疫層析試紙條的生產(chǎn)提供了可行性。

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Preparation and preliminary characterization of monoclonal antibody against Rhodamine B

XU Sheng-le1，LI Dao-yun2，WANG Xing1，LIU Jin-ping1，LIU Yun-ying1，ZHANG Wei1，QIN Hai-yan1，LIU Ruo-xuan1，CAI Yun-hong1，WANG Han-dong1
（1.College Of Veterinary Medicine Yangzhou University，Yangzhou 225009，China；2.The First Peopele′s Hospital of changzhou，Changzhou 213003，China）

Abstract：Bovine serum albumin and ovalbumin were used as two protein carriers respectively to couple with semiantigen RB by NHS method.The artificial antigen of RB was examined by Ultraviolet absorbance.Mice（BALB/c）were immunized with the compelete antigen.Three hybridoma cell lines secreting monoclonal anti-bodies against RB，named as 2D1，4C3 and 7F11，respectively，were obtained by using the hybridoma technique.After cloning，the positive hybridoma（7F11）was injected intraperiton-eally into mice to obtain ascitic fluid.Indirect competitive ELISA was established with this ascites.The most appropriate concentration of coating antigen was 1∶2 000，and the monoclonal antibody in the abdominal dropsy was attenuated by 1∶64 000.The regression equations of the detection method was y=0.2848x-0.2847（R2=0.9924）.The detectable limit was in the range of 1～1 000 ng/mL. The curve indicated that the lowest detection limit was 1 ng/mL.The cross showed that the monoclonal antibody had 100%inhibition rate for RB，and it had no cross reaction with Rhodamine 6G，Rhodamine 123，Phenol red，Pararosaniline，Neutral red，Eosin Y，OrangeⅡ，Methyl orange and gentian violet.

Key words：Monoclonal Antibody；Rhodamine B；ELSIA；Cross reaction

中圖分類號：R 392.11

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：0529- 6005（2016）03- 0034- 04

收稿日期：2014-09-09

基金項(xiàng)目：江蘇高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程；江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心；江蘇省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題資助

作者簡介：徐聲樂（1989-），男，碩士生，研究方向?yàn)閯游镄允称沸l(wèi)生安全，E-mail：xushengle@163.com

通訊作者：王捍東，E-mail：ydwhd@sina.com

Corresponding author：WANG Han-dong