Akt通過磷酸化p27誘導膽管癌細胞生長

王　鋒　胡啟立　李　健　趙　嚴　劉　華　湯茂春　夏小俊　孟宏波　宋振順　徐曉蓉△

(1同濟大學附屬上海市第十人民醫(yī)院消化內科, 2普外科　上?！?00072)

Akt通過磷酸化p27誘導膽管癌細胞生長

王鋒1胡啟立2李健2趙嚴1劉華1湯茂春1夏小俊1孟宏波2宋振順2徐曉蓉1△

(1同濟大學附屬上海市第十人民醫(yī)院消化內科,2普外科上海200072)

【摘要】目的探討Akt和p27蛋白控制膽管癌細胞生長的分子機制。方法利用突變載體、突變失活載體以及位點突變基因的轉染技術,流式細胞儀檢測PI3K、轉染各類載體對膽管癌細胞周期的影響,免疫印跡、免疫熒光檢測PI3K抑制劑、轉染各類載體對P27蛋白表達及分布的影響。結果PI3K抑制劑LY294002引起膽管癌細胞株G1期細胞周期阻滯,并引起p27蛋白入核;Akt能通過誘導p27蛋白出細胞核而解除LY294002的G1期細胞周期阻滯;Akt通過磷酸化野生型p27蛋白第157位蘇氨酸逆轉細胞周期阻滯。 結論Akt通過磷酸化p27第157位蘇氨酸來誘導p27細胞內重定位于細胞質,促進膽管癌細胞的生長。

【關鍵詞】膽管癌;p27;Akt;磷酸化;細胞周期

膽管癌是源自膽管上皮細胞的惡性腫瘤,流行病學研究顯示,膽管癌的發(fā)病率和死亡率在過去30 年間明顯呈進行性增加趨勢[1]。針對膽管癌發(fā)病機制,尋找靶基因進行靶向治療是目前研究的熱點。磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3 kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,PKB)信號通路在肺癌、結腸癌、胰腺癌等惡性腫瘤細胞增殖、細胞周期、分化、凋亡過程中發(fā)揮重要作用,提示腫瘤的不良預后[2-3]。

p27作為細胞周期依賴性蛋白激酶抑制劑,能與cyclinE/CDK2和cyclinD/CDK4復合物緊密結合,同時其也是一種腫瘤抑制基因。研究發(fā)現(xiàn)包括膽管癌在內的幾乎所有人類惡性腫瘤中,均存在p27蛋白的表達下調或缺失,是公認的抑癌蛋白。p27抑制cyclinE/CDK2從而引起細胞周期阻滯在G1期,且p27只有在細胞核中才能抑制細胞的生長。PKB又稱Akt,能抑制p27的活性,PI3K信號通路可激活Akt發(fā)生磷酸化,Akt的激活也是膽管癌增長所需要的,然而,p27和Akt控制膽管癌細胞生長的分子機制目前尚不清楚。我們認為膽管癌細胞中Akt誘導p27功能的喪失,是依賴于p27磷酸化以及p27重新定位于細胞核之外所引起。

因此,本研究擬通過觀察PI3K/Akt通路抑制劑對膽管癌細胞周期的影響,以及p27蛋白質水平及定位的變化,利用突變載體、突變失活載體以及位點突變基因的轉染技術,以初步闡明Akt通過調控p27進而對膽管癌細胞生長產生影響。

材 料 和 方 法

材料和試劑人肝膽管癌細胞HCCC-9810細胞株來自中國科學院上海生物所細胞庫,RPMI-1640 培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Gibco公司，胰蛋白酶購自美國Invitrogen公司。PI3K抑制劑LY294002、MEK信號通路抑制劑U0126、p27 Kip1抗體、α-tubulin抗體、RCC1抗體購自美國Cell Signaling公司,二抗購自美國Santa Cruz公司。第157位蘇氨酸被替換為丙氨酸的p27蛋白(p27-T157A-GFP)、標記GFP的p27蛋白由美國羅切斯特大學Hong W.Yao教授惠贈。突變激活Akt載體(mutationally activated Akt,Myr-Akt)、顯性失活突變Akt(dominate negative Akt,dn-Akt)購自美國Addgene公司。細胞核蛋白與細胞質蛋白抽提試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司。

Western blot法檢測常規(guī)利用試劑盒分別提取細胞核蛋白和細胞質蛋白或提取細胞總蛋白。利用BCA法測定蛋白濃度。取30 μg蛋白樣品,以10%SDS-PAGE凝膠電泳后,轉移至PVDF膜,脫脂牛奶室溫封閉2 h,加入一抗(1∶1 000) 4 ℃孵育過夜,加入二抗(1∶3 000)孵育1 h,洗膜后,以化學發(fā)光液顯像,暗室中進行X光片壓片、顯影、定影后得到目的蛋白表達變化條帶。取重復3次實驗后的平均值作為實驗結果。

免疫熒光染色不同處理的細胞爬片后,經4%甲醛固定10 min,0.5%Triton X-100破膜20 min,PBS清洗,一抗4 ℃ 孵育過夜,PBS清洗,37 ℃孵育熒光二抗1 h,DAPI染核,以含抗熒光淬滅劑的封片液封片。免疫熒光經共聚焦顯微鏡觀察。

細胞周期采用流式細胞術檢測細胞周期。對于各組不同處理的細胞,用胰蛋白酶消化并制備細胞懸液,加入75%的冰乙醇4 ℃固定過夜,再用PBS洗2次,加入終濃度為50 mg/L的核糖核酸酶A(RNase A),37 ℃孵育30 min,加入終濃度為50 mg/L的PI,4 ℃ 閉光染色10 min后用流式細胞儀檢測。用Cell Quest獲取、Mod Fit軟件分析各組細胞的周期分布。

數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析組間數(shù)據(jù)比較使用Student′st檢驗進行分析,所有數(shù)據(jù)均使用SPSS 11.0軟件進行處理。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結果

LY294002對細胞周期及p27的影響與DMSO處理的對照組相比較,HCCC-9810細胞經PI3K抑制劑LY294002(50 μmol/L)處理后,導致G1期細胞數(shù)目增加(P=0.008 9),而MEK抑制劑U0126(20 μmol/L)并不能誘導G1期的細胞數(shù)目發(fā)生變化(圖1A)。同時,PI3K抑制劑LY294002能增加HCCC-9810細胞中p27蛋白的總含量,而MEK抑制劑U0126對其并不產生影響(圖1B)。

LY294002可誘導p27蛋白進入細胞核為評估p27蛋白在細胞內的具體分布情況及明確其發(fā)揮作用的機制,我們進一步檢測了PI3K抑制劑和MEK信號通路抑制劑對p27在細胞質和細胞核分布情況的影響,結果顯示,PI3K抑制劑LY294002能增加p27在HCCC-9810細胞核中的表達,并且降低其在細胞質中的表達(圖1C)。而MEK信號通路抑制劑U0126對p27蛋白在細胞質和細胞核的分布情況并無影響。RCC1和α-tubulin的Western blot實驗結果代表細胞核和細胞質成分的純度。

A:Inhibitor of PI3K induces G1 arrest in HCCC-9810 cells.The percentage of cells in G1 phase was increased by the PI3K inhibitor,LY294002,compared with the DMSO control.MEK inhibitor,U0126,did not alter the number of cells in G1 phase.B:LY294002,increased p27 protein level compared to the DMSO control whereas U0126 had no effect.C:LY294002 decreased p27 content in the cytoplasm and increased p27 in the nuclear fractions.However,the MEK inhibitor did not alter p27 distribution in HCCC-8910 cells.The immunblots for RCC1 and alpha tubulin show appropriate distributions in the nuclear and cytoplasmic fractions,indicating purity of the fractions.(1)P<0.01,vs.DMSO group.

圖1PI3K抑制劑通過增加p27入核引起膽管癌

HCCC-9810細胞株發(fā)生G1期細胞阻滯

Fig 1Inhibitor of PI3K induces G1 phase arrest and increases

nuclear p27 accumulation in HCCC-9810 cell lines

Akt依賴性的p27蛋白再定位參與G1期細胞阻滯與對照組相比,突變激活Akt載體可誘導細胞中Akt蛋白含量增加(圖2B),顯示Myr-Akt工作良好。相對于轉染空質粒組,LY294002對轉染GFP細胞的G1期細胞數(shù)目并沒有影響;而在共轉染Myr-Akt和GFP的細胞中,Myr-Akt增加了Akt總量,LY294002降低了G1期的細胞數(shù)目(圖2A,P=0.007 8)。這些數(shù)據(jù)表明,Akt的過度表達解除了LY294002誘導的G1期阻滯。

進而,我們研究Akt對p27在細胞內的定位情況。Myr-Akt載體誘導細胞高表達Akt,dn-Akt降低Akt表達,收集各組細胞的細胞質、細胞核蛋白進行免疫印跡試驗。結果顯示高表達Akt的膽管癌細胞中,p27在細胞質中含量增加,而在細胞核中含量減少;相反,在低表達Akt的膽管癌細胞中p27在細胞質中含量減少，在細胞核中含量增加(圖2C)。上述數(shù)據(jù)表明,Akt可導致p27再定位到細胞質中,從而參與到G1期細胞阻滯的過程。

A:The representative of immunoblotting of Akt in cells transfected with Myc-Akt or dn-Akt.B:The percentage number of cells in G1 arrest due to LY294002 in cells transfected with empty vector,GFP or co-transfected with Myr-Akt.C:The representative of immunoblotting of p27 in the cytoplasm and nucleus in cells transfected with Myc-Akt or dn-Akt,treated with LY294002 or not.(1)P<0.01,vs. Control group.

圖2Akt依賴性的p27在HCCC-9810細胞內再

定位緩解LY294002誘導的G1期細胞阻滯

Fig 2Akt relieves G1 arrest induced by LY294002

through Akt-dependent p27 subcellular

localization in HCCC-9810 cells

Akt磷酸化p27蛋白第157位蘇氨酸引起p27出核為了解Akt引起p27細胞內再定位的機制,我們采用免疫熒光染色觀察p27的細胞內定位(圖3A)。結果顯示,細胞轉染野生型p27時,p27蛋白幾乎完全定位在細胞核;細胞轉染野生型p27和Myr-Akt載體,p27蛋白在細胞質和細胞核中均有分布;而細胞同時轉染第157位蘇氨酸磷酸化位點突變的p27(p27-T157A)和Myr-Akt載體時,p27蛋白仍主要分布在細胞核內。

進而，我們采用定量方法檢測p27在細胞質和細胞核中的表達量(圖3B)。在轉染野生型p27的細胞中，增加Akt的表達可增加p27在細胞質中的含量并降低其在細胞核中的含量。相反,在細胞中轉染第157位蘇氨酸磷酸化位點突變的p27,Akt的表達對p27的分布影響不大。數(shù)據(jù)表明Akt依賴性的p27重定位需要p27在第157位點磷酸化后才能出核,從而影響其對細胞周期的阻滯作用。

A:The representative image of immunofluorescence staining of p27,Akt in HCCC-8910 cell lines.B:The Quantitative content of p27 distributed in nucleus and cytoplasm in cells transfected with p27 or p27-T157A,with Akt or not.Scale bar=10 μm.

圖3p27細胞內再定位依賴于Akt磷酸化p27

第157位蘇氨酸

Fig 3Akt-dependent phosphorylation of p27 at T157

causes p27 accumulation in the cytoplasm

Akt通過磷酸化p27第157位蘇氨酸解除LY294002的G1期阻滯突變激活表達的Akt可以逆轉HCCC-9810的細胞周期阻滯,是由于野生型p27蛋白所誘導,而不是磷酸化缺失的p27突變體。

相比轉染空載體,轉染野生型p27蛋白能增加細胞在G1期的數(shù)目。野生型p27蛋白與Akt的共表達能降低G1期的細胞數(shù)目(P=0.006 7)。相比轉染空載體,轉染第157位蘇氨酸突變的p27蛋白不僅能誘導G1期細胞增多,還阻斷了Akt降低G1期細胞數(shù)目的功能。結果提示,Akt引起p27蛋白在第157位點的磷酸化導致p27出核,并抑制了其G1期細胞阻滯的特性,從而促進了細胞生長(圖4)。

The percentage number of cells in G1 arrest in cells transfected with p27,p27-T157A or Myr-Akt.(1)P<0.01.

圖4Akt通過磷酸化野生型p27第157位蘇氨酸解除LY294002

對膽管癌細胞HCCC-9810的G1期阻滯

Fig 4Akt rescues HCCC-9810 cells from the cell-cycle

delay induced by LY294002 through wild-type p27

phosphorylation at Thr157

討論

本研究在膽管癌中探對了Akt和p27調控腫瘤細胞生長的機制。結果顯示抑制PI3K/Akt信號通路可誘導細胞發(fā)生G1期阻滯,同時p27蛋白在細胞核內表達增加,這種細胞周期阻滯可被上調的Akt所解除,p27在細胞核內的表達也相應減少,后續(xù)實驗進一步證實Akt是通過p27蛋白Thr157位點磷酸化誘導出核,出核的p27和細胞周期蛋白結合后轉換到促細胞周期進展的模式。我們認為膽管癌細胞生長失調是由于PI3K/Akt信號通路的失調,導致p27磷酸化水平降低,p27細胞質移位導致喪失其生長抑制的特性,從而促進腫瘤細胞生長。

膽管癌是多基因、多因素共同作用的結果,PI3K/Akt信號通路的失調對細胞增殖、凋亡具有重要的調控作用[4],在維持細胞惡性生物學行為中起重要作用。Akt作為PI3K的下游靶蛋白,是PI3K/Akt信號通路的核心,目前認為Akt的活性調節(jié)主要依賴于PI3K,Ser473和Thr308位點的磷酸化是Akt激活的必要條件,磷酸化Akt(pAkt)是PI3K/Akt信號通路的效應核心。磷酸化的pAkt可通過誘導抗凋亡蛋白的表達以及磷酸化凋亡調節(jié)蛋白從而抑制腫瘤細胞凋亡[5]。PI3K/Akt信號通路主要激活途徑是帶有磷酸化位點的結構域與磷脂分子PIP3(磷脂酰肌醇3磷酸)結合后將PI3K亞單位p85募集到近細胞膜附近,p85磷酸化是PI3K激活的啟動及激活因子,從而進一步激活增殖及凋亡相關基因,改變細胞周期,調控腫瘤細胞的生物學行為[6-7]。pAkt處于細胞內多種信號途徑的交匯點,通過激活或抑制下游30余種靶蛋白,參與多種細胞活動及物質代謝調節(jié),尤其與促進細胞增殖、抑制細胞凋亡、調控細胞周期等密切相關[8]。PI3K/Akt可通過mTOR來磷酸化eIF4E和p70S6K,影響細胞增殖,PI3K抑制劑可抑制mTOR,發(fā)生G1期阻滯,影響腫瘤細胞生長[8-9]。Akt升高還可激活p21激酶Pak1,繼而調節(jié)p21活性,導致細胞增殖[10];也可直接磷酸化p27,使其在細胞內堆積,防止其對細胞周期的阻滯作用[11]。LY294002通透細胞后特異性抑制PI3K/Akt信號途徑,包括Akt的磷酸化,我們的研究顯示LY294002可引起膽管癌細胞HCCC-9810發(fā)生G1期阻滯。這種G1期阻滯還伴有p27蛋白在核內分布的增多,這種細胞阻滯也可被外源增加的Akt所解除,同時,p27蛋白在細胞核內的分布也相應減少。這提示p27蛋白在PI3K/Akt通路調控細胞周期、促進細胞增殖中發(fā)揮一定的作用。

p27是一種相對分子質量為27 000的細胞周期抑制性蛋白[12],它能與cyclinE/CDK2、cyclinD/CDK4復合物緊密結合,其基因定位于12號染色體的12p12.0～12p13.1之間,含有3個外顯子和1個內含子[13]。p27蛋白分子的N端含有2個絲氨酸磷酸化位點,介導CDK激酶活性的抑制;C端含有2個蘇氨酸磷酸化位點,與抑制H1組蛋白磷酸化有關。p27是CDK1重要的家族成員,可以結合Cyclin D/CDK復合物,是細胞周期的負調控因子[14]。p27蛋白在膽管癌中通常也是低表達狀態(tài),且p27水平與預后相關,高表達組生存期更高[15-16]。Shiraso等[17]針對p27設計的缺失Jab1結合區(qū)域的p27-jab-d有抑制膽管癌細胞生長的作用。受到惡性增殖信號的刺激,細胞中p27的蛋白表達水平下降,這是由于其合成下降,同時蛋白翻譯后泛素蛋白酶體降解速度也提高[18]。p27蛋白水平功能的下降削弱了其對CDK或cyclin/CDK復合物活性的抑制效應,導致CDK的活化效應遞增,使細胞能夠完成細胞周期G1到S期的重要轉換,驅動細胞周期的運行。Akt也可以使p27的Ser10位點、Thr187位點以及Thr157位點發(fā)生磷酸化,并且Thr157位點位于p27的細胞核內定位信號區(qū)域中。當PKB磷酸化p27的Thr157位點后,p27不能進入細胞核內發(fā)揮G1期阻滯的作用[11],而使細胞增殖、分裂過快、過多并導致腫瘤形成。我們的實驗結果也顯示,在膽管癌細胞中,Akt激活后通過磷酸化p27的Thr157位點從細胞核進入細胞質,從而喪失抑制細胞周期的功能,促進細胞生長。

正常膽管上皮細胞中,細胞周期蛋白依賴性的細胞生長是通過p27蛋白與cyclin/CDK在細胞核中的相互作用而抑制的。在膽管癌細胞中,各類生長因子和細胞因子通過細胞膜受體,激活PI3K/Akt信號通路,磷酸化的Akt可導致核內的p27蛋白在T157位點磷酸化,觸發(fā)p27蛋白的核移出,使得p27與cyclinE/CDK2、cyclinD/CDK4復合物解離,細胞轉換到促細胞周期進展的模式,導致分裂加快、腫瘤形成。我們認為,下調Akt或突變p27第157磷酸化位點,均可調控p27的亞細胞定位,達到G1期阻滯、抑制增殖的目的,可作為膽管癌治療的靶點之一。

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Akt induces cell growth through phosphorylation p27 in cholangiocarcinoma cell

WANG Feng1, HU Qi-li2, LI Jian2, ZHAO Yan1, LIU Hua1, TANG Mao-chun1, XIA Xiao-jun1,MENG Hong-bo2, SONG Zhen-shun2, XU Xiao-rong1△

(1DepartmentofGastroenterology,2DepartmentofGeneralSurgery,ShanghaiTenthPeople′sHospital,TongjiUniversity,Shanghai200072,China)

【Abstract】ObjectiveTo investigate the molecular mechanisms for Akt and p27 in control of cholangiocarcinoma cell growth.MethodsMutationally activated Akt,dominate negative Akt,empty vector and phosphorylation deficient p27 were used in our study.Cholangiocarcinoma HCCC-9810 cells were treated with the above vectors,proteins or PI3K inhibitor.The cell cycle was measured by flow cytometry.The protein level and distribution of p27 were detected by Western blot and immunofluorescence.ResultsLY294002,an inhibitor of PI3K,induced G1 phase arrest in cholangiocarcinoma cell lines and increased p27 into the nucleus.Akt released LY294002-induced G1 phase arrest through increasing cytoplasmic p27 protein level.Akt reversed cells from the cell cycle arrest through wild type p27 phosphorylation at Thr157.ConclusionsAkt induced p27 phosphorylation at Thr157 and p27 relocalization to an extranuclear subcellular distribution in cholangiocarcinoma cells.

【Key words】cholangiocarcinoma;p27;Akt;phosphorylation;cell cycle

【中圖分類號】R753.8

【文獻標識碼】A

doi:10.3969/j.issn.1672-8467.2016.03.003

(收稿日期:2016-01-29;編輯:王蔚)

國家自然科學基金(81472578,81570578); 上海市自然科學基金(15ZR1432800)

△Corresponding authorE-mail:xuxr@#edu.cn

*This work was supported by the National Natural Science Foundation of China(81472578,81570578) and the Natural Science Foundation of Shanghai,China (15ZR1432800).