白藜蘆醇對(duì)脂多糖誘導(dǎo)體外小鼠腹腔巨噬細(xì)胞活性的影響

孫　平，付帥才，肖　樂(lè)，龔昆梅*

1.昆明理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院，昆明 650000；2.云南省第一人民醫(yī)院，昆明 650000

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*通信作者

白藜蘆醇對(duì)脂多糖誘導(dǎo)體外小鼠腹腔巨噬細(xì)胞活性的影響

孫平1，付帥才1，肖樂(lè)2，龔昆梅2*

1.昆明理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院，昆明 650000；2.云南省第一人民醫(yī)院，昆明 650000

[摘要]目的探討白藜蘆醇(RES)對(duì)脂多糖(LPS)誘導(dǎo)體外小鼠腹腔巨噬細(xì)胞(PMA)活化的影響。方法制備腹腔巨噬細(xì)胞，分為陰性對(duì)照組、LPS組和(RES+LPS)Ⅰ～Ⅵ組，培養(yǎng)24 h后，分別進(jìn)行中性紅染色觀察細(xì)胞活性。應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附法和硝酸還原法實(shí)驗(yàn)，用酶標(biāo)儀檢測(cè)細(xì)胞上清液中腫瘤壞死因子-α (TNF-α)、一氧化氮(NO)和超氧陰離子水平。結(jié)果對(duì)照組細(xì)胞活性比較低，LPS誘導(dǎo)后，腹腔巨噬細(xì)胞大量活化，細(xì)胞上清液中TNF-α、NO、超氧陰離子水平顯著增高，加入RES治療的PMA細(xì)胞活性逐漸減弱，并且相應(yīng)的細(xì)胞上清液中TNF-α、NO、超氧陰離子水平明顯降低。結(jié)論RES可以抑制PMA的細(xì)胞活化，從而減少TNF-α、NO和超氧陰離子的過(guò)度分泌。

[關(guān)鍵詞]巨噬細(xì)胞(PMA)；白藜蘆醇(RES)；脂多糖(LPS)；TNF-α；NO；超氧陰離子

0引言

白黎蘆醇(Resveratrol，RES)是從虎杖中提取的多酚類(lèi)化合物[1-3]，其化學(xué)結(jié)構(gòu)為3,5,4′-三羥基苯二烯。近年研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇具有抗炎、抗氧化、抗血小板凝聚、改善微循環(huán)、保護(hù)血管內(nèi)皮、保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)、增強(qiáng)免疫力、延緩衰老等作用[4-5]。脂多糖(Lipopolysaccharides，LPS)是革蘭陰性菌細(xì)胞壁的主要成分，是引起傳染性疾病的主要原因。炎癥過(guò)程中巨噬細(xì)胞的活化能夠引起白細(xì)胞介素-1(IL-1)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、超氧陰離子(O2-)、血小板活化因子(PAF)和一氧化氮(NO)等大量炎癥介質(zhì)釋放[6-9]，這些炎癥介質(zhì)具有多種活性，介導(dǎo)多種生理作用，并且許多作用能夠相互疊加，出現(xiàn)協(xié)同效應(yīng)，從而促使炎癥過(guò)程的發(fā)生和發(fā)展[10-12]。本研究旨在探討白藜蘆醇對(duì)LPS誘導(dǎo)的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞(PMA)活化產(chǎn)生炎癥損傷的抑制作用，探討其對(duì)細(xì)胞保護(hù)作用的可能機(jī)制，為治療炎癥、保護(hù)細(xì)胞活力、延緩細(xì)胞衰老提供新的有效思路和臨床治療方法。

1材料與方法

1.1材料ICR品系小鼠，雌雄不拘，體重(25±3)g，購(gòu)于昆明醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，SPF級(jí)；脂多糖、白藜蘆醇(Sigma公司)；10%小牛血清(BI)；中性紅及臺(tái)盼藍(lán)染液，檢測(cè)TNF-α、超氧陰離子、NO試劑盒(南京建成生物制品公司)；蒸餾水、乙醚等為國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑分析純；酶標(biāo)儀(Multiskan G0美國(guó)Thermo公司)；倒置熒光顯微鏡(ZXZ-SLP，OLYMPUS)；二氧化碳培養(yǎng)箱(水套式，上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；液氮罐YDS-10型(成都金鳳液氮容器有限公司)；雪花制冰機(jī)；電子天平(FA2004N型)；-80 ℃冰箱；手術(shù)器械、一次性無(wú)菌注射器等。

1.2方法

1.2.1小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的制備取2只6～8周、體型相仿、體重接近相等(22 g)的小鼠(飼養(yǎng)條件：室溫20～26 ℃；相對(duì)濕度：45%～60%；光照時(shí)間：每天12 h；提供充足的食物和飲水，以便小鼠隨意進(jìn)食飲水)，乙醚下處死，75%乙醇消毒3～5 min，在無(wú)菌條件下給每只小鼠腹腔液注射10%的小牛血清培養(yǎng)基(引發(fā)小鼠體內(nèi)產(chǎn)生大量巨噬細(xì)胞) 2.5 mL，灌洗適當(dāng)時(shí)間后，取2.8 mL腹腔液加入培養(yǎng)基稀釋至9 mL，鋪到96孔板，每孔為200 μL，置于37 ℃、5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中貼壁細(xì)胞培養(yǎng)24 h。

1.2.2用RES、LPS處理小鼠腹腔巨噬細(xì)胞用體積分?jǐn)?shù)10%的小牛血清培養(yǎng)基調(diào)整PMA濃度約為2×106個(gè)/mL，隨機(jī)分為對(duì)照組、LPS組、RESⅠ～Ⅵ組。對(duì)照組PMA加雙純水(2 μg/mL)；LPS組PMA加入LPS (2 μg/mL)；RES組PMA加入LPS (2 μg/mL)培養(yǎng)30 min后，分別加入濃度為1、1.2、1.5、1.8、2、5 μg/mL的RES。各組均在37 ℃、5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.2.3中性紅檢測(cè)細(xì)胞活力繼“1.2.2”項(xiàng)用RES、LPS處理小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，在37 ℃、5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，去除細(xì)胞培養(yǎng)液，用PBS液沖洗未貼壁的細(xì)胞，向孔內(nèi)加入新鮮配制的中性紅工作液200 μL，在37 ℃、5% CO2條件下，孵育2 h，立即用倒置熒光顯微鏡拍照。棄去上清，用PBS洗滌1遍，加入萃取液(乙醇∶水∶醋酸=50∶49∶1)，酶標(biāo)儀540 nm檢測(cè)光吸收值(D540值)。

1.2.4TNF-α、NO、抗超氧陰離子含量的檢測(cè)經(jīng)2 μg/mL LPS預(yù)處理PMA細(xì)胞損傷，加入不同濃度Res對(duì)PMA細(xì)胞進(jìn)行24 h治愈保護(hù)作用。①TNF-α的檢測(cè)：收集細(xì)胞的上清液，96孔板，每孔樣本量100 μL，采用雙抗體夾心法測(cè)定標(biāo)本中小鼠TNF-α水平，按試劑盒使用說(shuō)明進(jìn)行，酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度(D450值)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品繪制成的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出回歸方程，根據(jù)回歸方程計(jì)算樣品中小鼠TNF-α的濃度。②收集細(xì)胞的上清液，根據(jù)Griess法測(cè)定培養(yǎng)液中的NO，具體按照試劑盒使用說(shuō)明，每孔樣本量100 μL，實(shí)驗(yàn)后用酶標(biāo)儀進(jìn)行NO檢測(cè)；③收集細(xì)胞的上清液，根據(jù)試劑盒的實(shí)驗(yàn)步驟，每孔加樣樣本量為50 μL，酶標(biāo)儀檢測(cè)出超氧陰離子OD值，然后根據(jù)試劑盒中的計(jì)算公式，計(jì)算出抗超氧陰離子的活力單位(U/L)。

1.2.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有數(shù)據(jù)進(jìn)行單向方差分析，各組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的再進(jìn)行多重比較。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計(jì)軟件包GraphPad Prism5進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，檢驗(yàn)顯著水準(zhǔn)α=0.05。

2結(jié)果

2.1RES、LPS對(duì)腹腔巨噬細(xì)胞活性的影響見(jiàn)圖1。中性紅檢測(cè)細(xì)胞活力(應(yīng)用倒置熒光顯微鏡拍照)，見(jiàn)圖2。

圖1　酶標(biāo)儀檢測(cè)各組細(xì)胞的OD值

由圖2可見(jiàn)，培養(yǎng)24 h后，對(duì)照組腹腔巨噬細(xì)胞大量貼壁生長(zhǎng)，形狀呈不規(guī)則的菱形，多數(shù)被中性紅染成紅色，說(shuō)明腹腔巨噬細(xì)胞大量存活生長(zhǎng)良好。LPS組腹腔巨噬細(xì)胞只有很少的細(xì)胞染成紅色，形狀多為圓形，說(shuō)明腹腔巨噬細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)較少，且大量死亡，表明LPS誘導(dǎo)腹腔巨噬細(xì)胞衰老死亡。RESⅠ～Ⅵ組，隨著白藜蘆醇藥量的加大，腹腔巨噬細(xì)胞被染成紅色且貼壁生長(zhǎng)，形狀呈不規(guī)則菱形的腹腔巨噬細(xì)胞數(shù)量越來(lái)越多，說(shuō)明白藜蘆醇抑制LPS引起的細(xì)胞衰老死亡。但是白藜蘆醇藥量較大的RESⅤ組的腹腔巨噬細(xì)胞的貼壁生長(zhǎng)，形狀呈菱形的腹腔巨噬細(xì)胞數(shù)量有變小的趨勢(shì)，說(shuō)明濃度過(guò)大的白藜蘆醇對(duì)細(xì)胞有毒副作用。

2.2RES對(duì)LPS誘導(dǎo)后巨噬細(xì)胞TNF-α的影響見(jiàn)圖3、表1。

圖2　中性紅染色PMA活性觀察(200×)

圖3　白藜蘆醇對(duì)LPS誘導(dǎo)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞TNF-α的影響

組別TNF-α(ng/L)NO(μmol/L)抗O-2(U/L)對(duì)照組1.30±0.021.42±0.81228.00±3.44LPS組1.57±0.01#66.10±11.30#259.10±1.18#RESⅠ組1.56±0.0251.50±5.62*258.40±0.74RESⅡ組1.42±0.01*41.10±2.60**256.10±0.68RESⅢ組1.35±0.01*23.20±6.07**254.10±0.78RESⅣ組1.31±0.02*14.70±0.59**231.70±0.86*RESⅤ組1.26±0.03*5.39±0.28**243.80±0.78*RESⅥ組1.23±0.01*1.96±0.89**258.10±0.74

注：*與LPS處理組比較，P<0.01；#與對(duì)照組比較，P<0.01

由圖3、表1可見(jiàn)，LPS組PMA經(jīng)過(guò)LPS誘導(dǎo)產(chǎn)生的TNF-α含量明顯高于對(duì)照組(P<0.01)；RES組中，隨著RES量的增加，對(duì)LPS致巨噬細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α的抑制更加明顯。

2.3RES對(duì)LPS誘導(dǎo)后的巨噬細(xì)胞生成NO的影響酶標(biāo)儀NO檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖4、表1。由圖4、表1可見(jiàn)，LPS組的PMA經(jīng)過(guò)LPS誘導(dǎo)產(chǎn)生的NO含量明顯高于對(duì)照組(P<0.01)；RES組中，隨著RES量的增加，對(duì)LPS致巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NO的抑制更加明顯。

圖4　白藜蘆醇對(duì)LPS誘導(dǎo)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞NO的影響

圖5　白藜蘆醇對(duì)LPS誘導(dǎo)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞

3討論

研究表明，當(dāng)前白藜蘆醇已經(jīng)成為有效遏制和治療腫瘤和癌變的最有前途的藥物之一，被美國(guó)著名雜志《抗衰老圣典》列為100種最有效的抗衰老藥物之一，被譽(yù)為新的抗癌綠色藥物[13-16]。研發(fā)富含白藜蘆醇的食品、藥物及抗皮膚衰老的化妝品具有非常廣闊的市場(chǎng)前景。隨著分子調(diào)控機(jī)制、蛋白通路研究的完善，越來(lái)越多的白藜蘆醇相關(guān)研究涉及基因調(diào)控、蛋白調(diào)控方面，運(yùn)用高通量技術(shù)探尋在RES保護(hù)治療下有關(guān)miRNA、LncRNA差異表達(dá)譜，篩選在RES保護(hù)下關(guān)鍵miRNA、LncRNA，對(duì)其相關(guān)功能進(jìn)行研究，探索出一系列轉(zhuǎn)錄翻譯、蛋白修飾表達(dá)通路。本研究體外培養(yǎng)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，探討對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞有保護(hù)作用的RES給藥濃度，為后續(xù)小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)提供可靠的用藥劑量方面的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，同時(shí)也為之后用藥動(dòng)物建模篩選的關(guān)鍵基因提供依據(jù)。

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Effect of resveratrol on oxidative activity of murine abdominal peritoneal macrophage induced by lipopolysaccharideinvitro

SUN Pin1,FU Shuai-cai1,XIAO Le2,GONG Kun-mei2*

(1.Medical College of Kunming University of Science and Technology,Kunming 650000,China;2.First People′s Hospital of Yunnan Province,Kunming 650000,China)

[Abstract]ObjectiveTo study the effect of resveratrol on oxidative activity of murine peritoneal macrophages induced by lipopolysaccharied stimulated with lipopolysaccharide (LPS) in vitro.MethodsPeritoneal macrophages were prepared and divided into control group,LPS group and (RES+LPS) Ⅰ～Ⅵ group.After incubation for 24 h,the activity of neutral red stained cell was observed.Enzyme-linked immunosorbent method and nitrate reduction method were used.The tumor necrosis factor-α (TNF-α),nitric oxide (NO) and superoxide anion levels of cell supernatants were detected by microplate reader.ResultsThe cell activity in control group was lower.A large number of peritoneal macrophages were activated after being induced by LPS,and the TNF-α,NO and superoxide anion levels were significantly higher in cell supernatant;the cell activity of PMA was weakened gradually after RES treatment,and the TNF-α,NO,superoxide anion levels decreased significantly.ConclusionRES can inhibit the cell activation of PMA and reduce the excessive secretion of TNF-α,NO and superoxide anion.

Key words：Macrophages(PMA);Resveratrol (RES);Lipopolysaccharides (LPS);TNF-α;NO;Superoxide anion

收稿日期：2015-11-17

基金項(xiàng)目：云南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究(2012FB089、2013FB199)，國(guó)家自然科學(xué)基金(81260066)

DOI:10.14053/j.cnki.ppcr.201604002