清肺通絡(luò)膏對呼吸道合胞病毒感染大鼠肺組織PI3K-AKT-NFκB信號通路的影響

劉小雪，　王雪峰，　張秀英，　王藝歡，　王思源，　南春紅

110032 沈陽，遼寧中醫(yī)藥大學(xué)研究生學(xué)院(劉小雪，張秀英，王藝歡)；遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院兒科(王雪峰，王思源，南春紅)

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實驗論著

清肺通絡(luò)膏對呼吸道合胞病毒感染大鼠肺組織PI3K-AKT-NFκB信號通路的影響

劉小雪，王雪峰，張秀英，王藝歡，王思源，南春紅

110032 沈陽，遼寧中醫(yī)藥大學(xué)研究生學(xué)院(劉小雪，張秀英，王藝歡)；遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院兒科(王雪峰，王思源，南春紅)

【摘要】目的觀察清肺通絡(luò)膏對呼吸道合胞病毒(RSV)感染大鼠肺組織PI3K、AKT1/2、NF-κB p65蛋白表達(dá)的影響，探討清肺通絡(luò)膏對PI3K/AKT/NF-κB信號通路的調(diào)控機制。方法將30只SD大鼠隨機分為正常組、模型組、治療組各10只，模型組、治療組均給予RSV滴鼻接種3 d，治療組于接毒第1天予清肺通絡(luò)膏背部貼敷，連續(xù)7 d。于造模第7天后取大鼠肺組織，運用免疫組織化學(xué)染色法檢測各組大鼠肺組織中PI3K、AKT1/2、NF-κB p65蛋白的表達(dá)。結(jié)果與正常組比較，模型組大鼠肺組織PI3K、AKT1/2、NF-κB p65蛋白表達(dá)增多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。治療組大鼠肺組織PI3K、AKT1/2、NF-κB p65蛋白表達(dá)均低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論RSV感染大鼠時激活了PI3K/AKT/NF-κB信號通路，清肺通絡(luò)膏能夠抑制PI3K、AKT1/2、NF-κB p65蛋白的表達(dá)，可能是清肺通絡(luò)膏干預(yù)RSV肺炎的機制之一。

【關(guān)鍵詞】肺炎；呼吸道合胞病毒；清肺通絡(luò)膏；PI3K/AKT/NF-κB信號通路；大鼠

呼吸道合胞病毒(respreatory syncytial virus，RSV)是一種RNA病毒，屬副黏液病毒科，是導(dǎo)致嬰幼兒患病毒性肺炎和毛細(xì)支氣管炎的主要病原體之一[1]。中醫(yī)藥治療病毒性感染疾病獨具優(yōu)勢，療效確切，耐藥性低，不良反應(yīng)少，臨床實踐中發(fā)現(xiàn)，采用中藥外敷治療RSV肺炎患兒，不僅療效顯著，而且解決了嬰幼兒給藥困難、家長不易接受等問題。清肺通絡(luò)膏是根據(jù)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院院內(nèi)制劑敷胸散改良而來，主要組成為大黃、黃芩、大蒜，寒熱兼顧、升降相宜?，F(xiàn)代研究證明，大黃對流感病毒、呼吸道合胞病毒等十幾種對人類危害極大的病毒有顯著的抑制作用[2]；黃芩有抗病毒、抗菌、抗氧化等多方面的藥理作用[3]；大蒜也具有抗菌、抗病毒生物活性[4]。王雪峰教授多年臨床實踐發(fā)現(xiàn)清肺通絡(luò)膏對多種小兒呼吸道疾病有明顯療效，但對其作用機制尚不明確，為進(jìn)一步探討該臨床有效復(fù)方的作用機制，本實驗采用免疫組化法，觀察清肺通絡(luò)膏對RSV感染大鼠肺組織中PI3K、AKT1/2、NF-κB p65蛋白的表達(dá)的影響，為清肺通絡(luò)膏的臨床應(yīng)用提供更有利的理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1實驗動物SPF級SD大鼠30只，雌雄各半，體質(zhì)量60～80 g，由遼寧長生生物技術(shù)有限公司提供，許可證號：SCXK(遼)2010-0001。

1.2細(xì)胞與病毒人喉癌上皮細(xì)胞(Hep-2細(xì)胞)，由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院病毒實驗室提供；RSV(long株)，購自于中國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒所毒種室，保存在遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院病毒室液氮罐中。

1.3實驗藥品及清肺通絡(luò)膏制備大黃、黃芩均購自遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中藥房，經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)中藥分析教研室鑒定均為正品。清肺通絡(luò)膏制備，大黃∶黃芩=1∶1，采用8倍量70%乙醇，回流提取2次，每次2 h，合并濾液，減壓干燥研成粉末，避光冷藏。于給藥前用大蒜汁將干燥粉末調(diào)成膏狀備用。

1.4主要試劑一抗：兔抗PI3K多克隆抗體(批號：ab151549，購自Abcam公司)、兔抗AKT1/2多克隆抗體(批號：ab6076，購自Abcam公司)，兔抗NF-κBp65抗體(批號：bs-0465R，購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司)，SP免疫組化檢測試劑盒(批號：AD0807，購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司)；DAB顯色試劑盒(批號：15111A06，購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。

1.5主要設(shè)備IP1020型自動組織脫水處理機、Autostainer XL型自動組織染色機、EG1105型石蠟包埋機、A020221型烘漂處理儀、RM2135型精密轉(zhuǎn)輪切片機(上海徠卡儀器有限公司)，BX50F4型系統(tǒng)生物顯微鏡(OLYMPUS)，計算機圖像分析儀(北京航空大學(xué)圖像中心)。

1.6實驗方法

1.6.1分組、造模及給藥將30只SD大鼠按隨機數(shù)字表法分為正常組、模型組、治療組各10只。將全部大鼠置于SPF級清潔籠內(nèi)喂養(yǎng)，3 d后開始正式實驗。正常組經(jīng)鼻滴加生理鹽水0.1 mL，其余兩組鼻腔接種RSV原毒液0.1 mL，連續(xù)3 d。接毒第1天，治療組大鼠給予脫毛處理，使大鼠背部皮膚充分暴露，脫毛面積約2 cm×2 cm大小，并給予清肺通絡(luò)膏背部外敷治療，生藥量每次0.6 g，每日1次，連續(xù)敷藥7 d進(jìn)行干預(yù)。正常組和模型組不予干預(yù)。

1.6.2標(biāo)本取材及指標(biāo)測定各組大鼠于造模第7天后取材，取材前8 h禁食水。斷髓處死各組大鼠，無菌開胸，取出肺臟，生理鹽水沖洗干凈后于4%多聚甲醛固定，固定完全后脫水、包埋、切片。按SP免疫組化檢測試劑盒操作說明書上的檢測步驟進(jìn)行大鼠肺組織PI3K、AKT1/2、NF-κB p65的測定。顯微鏡觀察，每張切片任選5個視野(×200)，采用北航分析系統(tǒng)圖像采集，Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)分析、測定每個肺組織的陽性顆粒(棕黃色)的平均光密度。

2結(jié)果

各組大鼠肺組織PI3K、AKT1/2、NF-κB p65蛋白表達(dá)結(jié)果見表1、圖1～3(見封三)。從圖1～3可以看出，正常組、模型組、治療組各組大鼠肺組織免疫組化染色后均可觀察到肺組織中存在棕黃色陽性顆粒，說明各組大鼠肺組織中蛋白PI3K、AKT1/2、NF-κB p65均有表達(dá)。

表1　各組大鼠肺組織PI3K、AKT1/2、NF-κB p65蛋白

注：與正常組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05。

分析各組大鼠肺組織PI3K、AKT1/2、NF-κB p65蛋白平均光密度，從表1可知，模型組大鼠肺組織PI3K、AKT1/2、NF-κB p65蛋白表達(dá)最強，與正常組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；治療組大鼠肺組織PI3K、AKT1/2、NF-κB p65蛋白表達(dá)均低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

3討論

RSV感染是造成嬰兒期住院的常見病原，首次感染多見于1歲以內(nèi)的嬰兒，感染率高，深圳市龍崗區(qū)婦幼保健院2012年3月至2013年3月兒科收治住院的急性下呼吸道感染患兒病毒陽性標(biāo)本中，呼吸道合胞病毒陽性率最高，為47.00%[5]，并且與支氣管哮喘的發(fā)生和發(fā)展關(guān)系密切[6]。小兒RSV肺炎屬于中醫(yī)的“肺炎喘嗽”范疇。小兒臟腑嬌嫩，形氣未充，肺常不足，衛(wèi)外不固，由口鼻或皮毛感受六淫邪氣，致肺失宣肅，肺氣郁閉，郁久化熱，導(dǎo)致肺炎喘嗽發(fā)生。王雪峰教授結(jié)合臨床實踐經(jīng)驗和小兒肺炎的病因病機提出了“從肺毒熱論治”的理論[7]，在小兒肺炎實熱證階段盡早使用入肺經(jīng)的清熱解毒藥；又因肺與大腸相表里，肺之毒熱易移大腸，所以將清熱解毒、瀉下等藥物配伍后外敷于背部肺俞、膏肓等穴位，既可清肺之毒熱又可通導(dǎo)大腸，使毒熱之邪得出路而解。小兒肺炎實熱證階段采用清肺通絡(luò)膏外敷，藥物經(jīng)皮透入，經(jīng)腧穴由表入里，循經(jīng)絡(luò)內(nèi)達(dá)臟腑，達(dá)到內(nèi)病外治的效果。清肺通絡(luò)膏的君臣藥為大黃、黃芩，大黃歸胃、大腸、肝、脾經(jīng)，瀉下攻積，清熱瀉火，具有蕩滌胃腸實熱積滯的作用；黃芩歸肺、膽、脾、大腸、小腸經(jīng)，清熱燥濕，瀉火解毒，長于清除中上二焦?jié)駸?；佐以大蒜，大蒜藥性辛溫，解毒殺蟲，制約大黃及黃芩的苦寒之性，全方配伍簡明扼要、寒熱兼顧、升降相宜。

本研究中，采用RSV(long株)經(jīng)鼻腔接種SD大鼠，建立大鼠RSV肺炎模型。模型組與正常組比較，模型組大鼠肺組織PI3K、AKT1/2、NF-κB p65蛋白的表達(dá)均上調(diào)，說明RSV感染大鼠后存在PI3K/AKT/NF-κB信號通路的激活。許多研究表明，PI3K能夠影響氣道平滑肌細(xì)胞的增殖，干預(yù)Th2細(xì)胞、B細(xì)胞及嗜酸性粒細(xì)胞的炎癥反應(yīng)過程[8]。RSV感染機體后，上調(diào)S1P(sphingosine1-phosphate)，進(jìn)而介導(dǎo)PI3K-Akt信號通路的激活[9]，一旦PI3K-Akt信號通路被抑制，RSV誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡就會大量發(fā)生[10]。PI3K是由一個p110催化亞基和一個p85調(diào)節(jié)亞基組成的異源二聚體，能將PIP2磷酸化成PIP3。PIP3可以將具有PH結(jié)構(gòu)域的信號分子(如Akt)招募到質(zhì)膜上進(jìn)行活化，進(jìn)而啟動下游信號通路[11]。Akt是PI3K信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中一個重要的下游靶激酶，具有絲-蘇氨酸激酶活性。活化的Akt能夠通過活化IKK使IκB磷酸化，從而使NF-κB從IκB/NF-κB復(fù)合物中解離下來重新恢復(fù)NF-κB的轉(zhuǎn)錄激活活性[12]。

本實驗結(jié)果顯示，治療組大鼠肺組織PI3K、AKT1/2、NF-κB p65蛋白的表達(dá)均較模型組低，說明清肺通絡(luò)膏對RSV感染大鼠發(fā)揮一定的治療作用，其作用機制可能就是抑制PI3K/AKT/NF-κB信號通路的激活。本實驗僅從蛋白水平觀察了RSV感染后PI3K/AKT/NF-κB信號通路的情況及清肺通絡(luò)膏對PI3K、AKT1/2、NF-κB p65蛋白表達(dá)的影響，進(jìn)一步還可以從分子水平進(jìn)行研究。

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(本文編輯：劉穎)

Effect of Qingfei Tongluo ointment on the PI3K/Akt/NF-kappaB signaling in rats infected with RSV

LIUXiaoxue,WANGXuefeng,ZHANGXiuying,WANGYihuan,WANGSiyuan,NANChunhong.

LiaoningUniversityofTraditionalChineseMedicine,Shenyang110032,China.

【Abstract】ObjectiveTo observe the effect and the mechanism of Qingfei Tongluo ointment on the expression of PI3K,AKT1/2 and NF-κB p65 in rats infected with RSV.MethodsTotally 30 rats were randomized into 3 groups,namely,normal group,model group,treatment group,with 10 rats in each.The rats of the last two groups were made into RSV infection models.For treatment group Qingfei Tongluo ointment was given at the first day of the experiment,once daily for seven consecutive days.Examine the levels of PI3K,AKT1/2 and NF-κB p65 in lung tissue,using the method of immunohistochemistry.ResultsThe result of PI3K,AKT1/2 and NF-κB p65 expression in lung tissue showed that：compared with the normal group，the model group had significant difference(P<0.05);compared with the model group，the treatment group had significant difference(P<0.05).ConclusionQingfei Tongluo ointment is an effective drug for external use in RSV infection;its action mechanism may be through adjusting the PI3K/Akt/NF-κB signaling.

【Keywords】Pneumonia;RSV;Qingfei Tongluo ointment;PI3K/Akt/NF-kappaB signaling;Rats

基金項目：國家自然科學(xué)基金項目(81273800)

作者簡介：劉小雪(1988-)，女，遼寧中醫(yī)藥大學(xué)2013級碩士研究生在讀。研究方向：病毒性疾病的中醫(yī)藥治療通訊作者：王雪峰，E-mail：lnzywsf@163.com

doi：10.3969/j.issn.1674-3865.2016.02.004

【中圖分類號】R725.6

【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A

【文章編號】1674-3865(2016)02-0136-03

(收稿日期：2016-03-19)