EGR3在口腔鱗狀細胞癌中的表達及對細胞行為的影響*

翁海勇，鄭根建，何　龍，云　蔓，王瓊超，李鵬程，唐乃高，肖　旭

(海南醫(yī)學院附屬醫(yī)院口腔科，海南?？?570100)

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EGR3在口腔鱗狀細胞癌中的表達及對細胞行為的影響*

翁海勇，鄭根建△，何龍，云蔓，王瓊超，李鵬程，唐乃高，肖旭

(海南醫(yī)學院附屬醫(yī)院口腔科，海南?？?570100)

[摘要]目的探討早期生長反應因子3(EGR3) 在口腔鱗狀細胞癌(以下簡稱口腔鱗癌)中的表達及對細胞行為的影響。方法選擇2010年3月至2013年3月該院收治的口腔鱗癌患者20例的腫瘤組織樣本及配對的癌旁組織樣本作為研究對象，另選正常口腔黏膜樣本7份作為對照組。經過轉染后分析EGR3表達水平，并分析EGR3在人舌鱗癌細胞(Tca-8113)中高表達對細胞系增殖的影響及EGR3轉染后Tca-8113細胞凋亡情況。結果口腔鱗癌組織中，EGR3 mRNA水平為0.008±0.004，顯著低于鱗癌癌旁組織的1.723±1.195(P<0.05)；而EGR3 mRNA于鱗癌細胞系的表達水平為0.008±0.002，顯著低于鱗狀上皮細胞的2.109±0.997(P<0.05)；轉染24 h后，EGR3轉染組的EGR3水平顯著低于未轉染及空質粒對照組(均P<0.05)；EGR3轉染組在轉染24、48 h時的早期凋亡率與中晚期凋亡率，以及壞死細胞率均低于空質粒對照組(均P<0.05)。結論EGR3在口腔鱗癌中低表達或缺失，高表達能夠抑制腫瘤的生長，加快細胞凋亡。

[關鍵詞]早期生長反應因子3；口腔；腫瘤，鱗狀細胞；基因表達；細胞行為

目前，口腔鱗狀細胞癌(以下簡稱口腔鱗癌)的發(fā)病機制仍未完全明晰，但有部分實驗證實其發(fā)生、發(fā)展均與癌基因和抑癌基因異常性表達聯(lián)系緊密[1]。亦有報道指出，染色體的不穩(wěn)定性可能是口腔鱗癌產生機制當中的重要環(huán)節(jié)之一[2]，且現(xiàn)已有研究指出早期生長反應因子3(EGR3)是潛在抑癌基因，其通過表達下調參與到各類腫瘤的發(fā)生及進展。然而，對于EGR3的研究卻鮮少涉及，且作用機制亦不明確。本文通過EGR3在口腔鱗癌的表達及其對于細胞行為產生的影響，得到了一些結論，現(xiàn)報道如下。

1資料與方法

1.1一般資料選擇2010年3月至2013年3月在本院接受治療的口腔鱗癌患者20例的腫瘤組織樣本及配對的癌旁組織樣本作為研究對象。其中男12例，女8例；年齡60～89歲，平均(72.30±3.50)歲。納入標準：(1)患者均滿足WHO關于口腔鱗癌的診斷標準[3]；(2)通過影像學等手段證實；(3)所有患者病歷資料完整。排除標準[4]：(1)患者有其他種類的口腔惡性腫瘤；(2)對診治等方案的依從性不高，拒絕接受進一步治療者。另選本院志愿者正?？谇火つ颖?份作為對照組，其中男4例，女3例；年齡62～85歲，平均(71.90±4.20)歲。

1.2方法

1.2.1材料試劑(1)RPMI 1640培養(yǎng)基和胎牛血清均產于美國GIBCO公司；(2)BIY-Pdc316-mCMV-EGFP-EGR3熒光蛋白(EGFP)與EGR3表達質粒、對照質粒BIY-Pdc316-mCMV-EGFP等均產于北京博淼公司；(3)膜聯(lián)蛋白/碘化丙啶(Annexin/PI)試劑產于北京寶賽公司；(4)BrdU增殖試劑盒產于瑞士羅氏公司；(5)反轉錄RT試劑盒產于美國ABI公司；(6)總RNA的提取試劑盒產于美國Qiagen公司。

1.2.2復蘇培養(yǎng)將口腔鱗癌的細胞系KB及人舌鱗癌細胞(Tca-8113)進行復蘇培養(yǎng)處理，消化收集細胞，將總RNA進行部分提取，剩余細胞接種在6孔板以備轉染。

1.2.3EGR3 mRNA檢測根據(jù)逆轉錄PCR對EGR3 mRNA的表達進行測定。引物序列EGR3的上游為5′-AAT GGA CAT CGG TCT GAC CAA-3′，下游為5′-GGC GAA CTT TCC CAA GTA GGT-3′；產物長度為109 bp。GAPDH的上游為5′-CCA CAT CGC TCA GAC ACC AT-3′，下游為5′- GGC AAC AAT ATC CAC TTT ACC AGA GT-3′。

1.2.4轉染測定增殖、凋亡應用EGR3質粒對Tca-8113進行轉染，評價細胞增殖和凋亡。其中未經過轉染的Tca-8113為未轉染組；經過空質粒轉染的Tca-8113為空質粒對照組；經過EGR3質粒轉染的Tca-8113為EGR3轉染組。轉染并繼續(xù)培養(yǎng)96 h，分別在0、24、48、96 h評價腫瘤增殖和凋亡情況。其中凋亡檢測選擇Annexin/PI雙染標記，并經流式細胞儀分析。使用蛋白免疫印跡法(western blot)對EGR3表達進行測定。相關試劑的使用嚴格遵照說明書進行。質粒構建與轉染：構建EGFP及EGR3 cDNA表達載體，為“BIY-pDC3160-mCMV-EGFP”。體外經陽離子型脂質體對口腔鱗癌的“Tca-8113”細胞系進行轉染，由反轉錄PCR對轉染后Tca-8113內EGR3的mRNA與蛋白表達明顯上調進行驗證。

2結果

2.1EGR3表達水平分析口腔鱗癌組織中，EGR3 mRNA水平為0.008±0.004，低于鱗癌癌旁組織的1.723±1.195，差異有統(tǒng)計學意義(t=4.538，P=0.000)。而EGR3 mRNA在鱗癌細胞系的表達水平為0.008±0.002，低于鱗狀上皮細胞的2.109±0.997，差異有統(tǒng)計學意義(t=6.664，P=0.000)。

2.2EGR3在Tca-8113中高表達對于細胞系增殖的影響轉染24 h后，EGR3轉染組的EGR3水平低于未轉染及空質粒對照組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1。

表1　EGR3表達水平分析

a：P<0.05，與EGR3轉染組比較。

2.3EGR3轉染后Tca-8113細胞凋亡情況EGR3轉染組在轉染24、48 h時的早期凋亡率與中晚期凋亡率及壞死細胞率均低于空質粒對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表2。

表2　EGR3轉染后Tca-8113細胞凋亡情況

3討論

EGR家族主要含有4個基因，分別為EGR1～EGR4，此類基因均含1個關于EGR的早期反應元件，從而結合DNA鋅指結構[5]。EGR3正是其中的一個基因，此基因編碼出的蛋白是EGR家族Cys2His2 鋅指結構性轉錄因子，亦為有絲分裂所刺激誘導的一種早期的生長反應性基因[6]。此基因編碼而成的蛋白質可參與能夠控制到生物節(jié)律轉錄調控的過程中，具有十分重要的意義。有報道稱，口腔鱗癌組織及一些鱗癌細胞系內，EGR家族基因均呈現(xiàn)表達低下或缺失狀態(tài)[7]。為更加具體地進行研究，本文選擇EGR3基因進行深入分析，旨在進一步研究EGR3基因在口腔鱗癌中的表達及其對細胞行為的影響。

本研究發(fā)現(xiàn)，口腔鱗癌組織中，EGR3 mRNA水平顯著低于鱗癌癌旁組織。而EGR3 mRNA于鱗癌細胞系的表達水平顯著低于鱗狀上皮細胞的水平。表明鱗癌組織或細胞系均有較強的EGR3表達，與Lai等[8]的報道結果一致。分析原因，可能是因為EGR3對于腫瘤而言，可作為人凋亡相關因子配體(Fasl)的一種重要調控分子，其自身表達后能夠使FasL表達上升，進而促使凋亡發(fā)生,換言之，EGR3表達的低下或缺失狀態(tài)無法有效啟動使Fas-FasL依賴的相關凋亡途徑，進而導致細胞增殖異常而無法出現(xiàn)凋亡，在一定程度上促使了腫瘤的進一步發(fā)展[9]。因此EGR3轉染24 h后，EGR3水平顯著低于未轉染及空質粒對照組的水平，且EGR3轉染組在轉染24、48 h時的早期凋亡率、中晚期凋亡率及壞死細胞率均低于空質粒對照組，與Garewal等[10]的相關報道一致。關于EGR基因家族和腫瘤間的聯(lián)系，有研究證實EGR1是一種參與到多類腫瘤進展的抑癌基因，但其同時指出，EGR3亦有類似的抑癌作用。目前在臨床上，關于EGR3的研究大都集中于神經和免疫細胞的發(fā)育方向，主要認為其是肌肉與中樞神經系統(tǒng)等發(fā)育過程中的重要調節(jié)基因，亦可調節(jié)FasL和腫瘤壞死因子α(TNF-α)，進而誘導有關的凋亡配體及TNF-α的表達[11]。另一項針對白血病患者的研究發(fā)現(xiàn)，EGR3啟動子呈現(xiàn)異常的高甲基化，致使T細胞中的FasL表達缺失，且Fas-FasL所依賴的凋亡亦發(fā)生缺失，由此引發(fā)急性T細胞性白血病[12]。本研究中，還構建出EGR3表達質粒，將其轉染到Tca-8113型鱗癌細胞系內，結果發(fā)現(xiàn)EGR3在患者口腔鱗癌細胞系中表達能夠有效地抑制腫瘤細胞增殖及凋亡，表明EGR3可能已參與到口腔鱗癌發(fā)生及腫瘤抑制過程。但EGR3是否是一種潛在與口腔腫瘤有關的抑制性基因，仍須通過更多深入研究加以證實。

綜上所述，EGR3在口腔鱗癌中低表達或者表達缺失，臨床可增強其表達來抑制腫瘤生長，并促使腫瘤細胞凋亡，值得臨床重視。

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doi:·經驗交流·10.3969/j.issn.1671-8348.2016.06.022

基金項目：海南省衛(wèi)生廳科技計劃項目(瓊衛(wèi)2010-54)。

作者簡介：翁海勇(1974-)，主治醫(yī)師，大學本科，主要從事口腔頜面外科疾病診治的研究?！魍ㄓ嵶髡?，Tel：18789259928；E-mail：airforcezhgj@163.com。

[中圖分類號]R780

[文獻標識碼]B

[文章編號]1671-8348(2016)06-0793-02

(收稿日期：2015-06-03修回日期：2015-10-10)