尼古丁通過蛋白激酶B和糖原合成酶激酶-3調(diào)節(jié)γ網(wǎng)絡(luò)振蕩

賀小龍，成祥林，錢鋒，路承彪

(長江大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖北 荊州 434023)

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尼古丁通過蛋白激酶B和糖原合成酶激酶-3調(diào)節(jié)γ網(wǎng)絡(luò)振蕩

賀小龍，成祥林，錢鋒，路承彪

(長江大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖北 荊州 434023)

[摘要]目的：探討尼古丁調(diào)節(jié)海馬γ網(wǎng)絡(luò)振蕩的機(jī)制。方法：健康雄性Wistar大鼠，取其腦組織制備海馬腦片,制備好的海馬腦片放入恒溫(30～32℃)界面浴槽式灌流系統(tǒng)孵育。灌流液是充有混合氣體(95%O2+5%CO2)的人工腦脊液(pH：7.35～7.50，流速2～3 mL/min)。孵育1h后，采用細(xì)胞外微電極方式記錄。應(yīng)用紅藻氨酸激動(dòng)劑(Kainate)對(duì)大鼠海馬腦片灌流，誘導(dǎo)γ(20～60Hz)網(wǎng)絡(luò)振蕩。分組加入mTOR(Mammalian target of rapamycin)激酶阻斷劑雷帕霉素，糖原合成酶激酶-3 (Glycogen synthase kinase-3, GSK-3) 阻斷劑SB415286，蛋白激酶B阻斷劑Triciribine，待γ網(wǎng)絡(luò)振蕩穩(wěn)定后再加入尼古丁，觀察三者對(duì)尼古丁增強(qiáng)γ網(wǎng)絡(luò)振蕩作用的影響。結(jié)果：雷帕霉素不能阻斷尼古丁增強(qiáng)γ網(wǎng)絡(luò)振蕩的效應(yīng)，SB415286和Triciribine能阻斷尼古丁的效應(yīng)。結(jié)論：尼古丁可能通過激活糖原合成酶激酶-3 (GSK-3)和蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)來增強(qiáng)γ網(wǎng)絡(luò)振蕩。

[關(guān)鍵詞]γ網(wǎng)絡(luò)振蕩；尼古?。焕着撩顾?；SB415286；Triciribine

神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)振蕩是大腦網(wǎng)絡(luò)神經(jīng)元的節(jié)律性同步性活動(dòng)，反映了網(wǎng)絡(luò)環(huán)路的功能特征，是網(wǎng)絡(luò)神經(jīng)元信號(hào)同步輸出的時(shí)間標(biāo)識(shí)[1],與腦的高級(jí)功能如學(xué)習(xí)、記憶密切相關(guān)[2]。海馬網(wǎng)絡(luò)振蕩活動(dòng)按頻率不同主要分為：4～12Hz(theta,θ)，13～30Hz(beta,β)和30～80Hz(gamma,γ)[3]。最近研究表明1μM尼古丁能增強(qiáng)γ網(wǎng)絡(luò)振蕩[4]，近年來研究表明在離體培養(yǎng)神經(jīng)元細(xì)胞中，NMDA受體通過磷脂酰肌醇三磷酸激酶(PI3K)途徑調(diào)節(jié)細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2(ERK1/2)和蛋白激酶B(Akt)的磷酸化[5,6]。我們最近還發(fā)現(xiàn)NMDA阻斷劑完全阻斷了尼古丁的作用，表明尼古丁通過激活NMDA受體而調(diào)節(jié)了神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)活動(dòng)[4]。在培養(yǎng)的海馬神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)，尼古丁能激活依賴cAMP依賴的蛋白激酶A(PKA)及其下游的ERK1/2[7]。在海馬腦片齒狀回，PKA, ERK，PI3K參與了尼古丁誘導(dǎo)的LTP，而依賴鈣離子的蛋白激酶2(CAMKII)并未參與[8]。盡管報(bào)道表明尼古丁影響PI3K-Akt信號(hào)通路的上游分子，而尼古丁對(duì)PI3K-Akt信號(hào)通路的下游分子的作用并不清楚。PI3K-Akt信號(hào)通路下游的一個(gè)重要激酶是mTOR激酶，后者的導(dǎo)致糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)激活，而Akt對(duì)GSK-3β存在抑制作用[9]。Triciribine分別是是一種特異性Akt抑制劑，對(duì)其他激酶如PI3K、PKC、PKA、ERK1/2沒有作用[10]；雷帕霉素是mTOR激酶阻斷劑。mTOR激酶主要參與調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，最近研究發(fā)現(xiàn)其可能還與淀粉樣毒性蛋白的產(chǎn)生和Tau蛋白的磷酸化有關(guān)[11]； SB415286是GSK-3β阻斷劑,對(duì)其他蛋白激酶幾乎沒有活性[12]。淀粉樣毒性蛋白能通過抑制PI3K/Akt信號(hào)通路而激活GSK-3β，被激活的GSK-3β將介導(dǎo)Tau蛋白的磷酸化[13]。因此，我們擬應(yīng)用PI3K-Akt信號(hào)通路下游的三個(gè)重要激酶的阻斷劑Triciribine，雷帕霉素，SB415286來研究尼古丁調(diào)節(jié)γ網(wǎng)絡(luò)振蕩的細(xì)胞內(nèi)機(jī)制。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

潔凈級(jí)Wistar大鼠，4周，雄性，共18只，分為3組，每組6只，體重140g，由武漢動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心購買的4對(duì)大鼠所繁殖。

1.2儀器與試劑

人工腦脊液成分：KCl 3mmol/L，CaCl22mmol/L，NaCl 126mmol/L，MgSO42mmol/L，Glucose 10mmol/L，NaH2PO41.25mmol/L，NaHCO324mmol/L。切片腦脊液成分：Sucrose 225mmol/L，Glucose 10mmol/L，KCl 3mmol/L，NaHCO324mmol/L，MgSO46mmol/L，NaH2PO41.25mmol/L，CaCl20.5mmol/L。戊巴比妥鈉從國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司購買。尼古丁，紅藻氨酸(Kainate)，雷帕霉素(RAPA)，SB415286，Triciribine從Sigma公司購買。LEICA VT1200S振動(dòng)切片機(jī)購買于Leica(英國)；NL125，126FILTERS信號(hào)濾波器，Micro1401信號(hào)處理器，NL104(A.C.PREAMP)信號(hào)放大器和NL106(AC-DC AMP)信號(hào)放大器購買于Digitimer有限公司；Spike 2軟件購于CED(劍橋，英國)，TC324B溫控裝置購于Warner(USA)。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1)局部場(chǎng)點(diǎn)位記錄對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行腹腔麻醉，打開胸腔暴露心臟，用眼科剪剪破右心耳，在心尖處用預(yù)冷0℃)的切片腦脊液(pH:7.35～7.50)經(jīng)左心室灌流至全身，觀察到四肢迅速變白時(shí)，快速斷頭取腦，制備腦片(水平位)，腦片厚度控制在400μm。切好的腦片放孵育灌中用已接通混合氣(95%O2+ 5%CO2)的人工腦脊液(pH:7.35～7.50，流速為2～3mL/min)灌流，75%的大鼠海馬腦片與灌流用的人工腦脊液接觸，并且灌流液體保持32℃。腦片孵育1h后將玻璃微電極至于海馬CA3區(qū)，加入200nM Kainate，20～30min后即開始出現(xiàn)γ網(wǎng)絡(luò)振蕩，1.5～2.0h后達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)，隨后分組加入雷帕霉素(100nM)，SB415286(10μmol)，Triciribine(5μM)，待藥效穩(wěn)定后加入尼古丁(1μmol)，觀察γ網(wǎng)絡(luò)振蕩的改變。

2)電生理記錄的數(shù)據(jù)分析將大鼠腦片置于孵育槽1h候后，可以觀察到良好的腦片呈淡黃色，且形態(tài)學(xué)上完整。在海馬腦片的右側(cè)CA3區(qū)放置一個(gè)記錄電極-參比電極雙電極記錄模式，將充滿人工腦脊液的玻璃微電極(電阻：2～5MΩ)，放置于小鼠海馬CA3區(qū)放射層與錐體細(xì)胞層交界處，通過NL104放大器將生物信號(hào)2倍放大，通過NL106放大器(AC-DC AMP)進(jìn)一步放大500倍，然后信號(hào)經(jīng)由NL125，NL126(FILTERS)進(jìn)行(2～200Hz)濾波。最后通過CED1401ADC板將數(shù)據(jù)以2kHz的采樣速率轉(zhuǎn)換為數(shù)字信號(hào)，在計(jì)算機(jī)上顯示并記錄。分析數(shù)據(jù)使用Spike 2軟件(CED，劍橋，英國)。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2結(jié)果

2.1尼古丁能增強(qiáng)γ網(wǎng)絡(luò)振蕩

大鼠海馬腦片在沒有加任何藥物的情況下，并沒有明顯的生物學(xué)信號(hào)(圖1A1)，當(dāng)加入200nM紅藻氨酸(KA)后，可誘導(dǎo)出明顯γ網(wǎng)絡(luò)振蕩(圖1A2)，再加入尼古丁后γ網(wǎng)絡(luò)振蕩功率譜增加，驗(yàn)證了尼古丁能增強(qiáng)γ網(wǎng)絡(luò)振蕩這一結(jié)論。

2.2雷帕霉素對(duì)γ網(wǎng)絡(luò)振蕩的影響

當(dāng)紅藻氨酸誘導(dǎo)的γ網(wǎng)絡(luò)振蕩達(dá)到穩(wěn)態(tài)后，使用100nM雷帕霉素(RAPA)，γ振蕩功率譜提高了(12.0±5.2)%(圖2B1、B2、C，P>0.05，配對(duì)t檢驗(yàn)，n=6)；再應(yīng)用尼古丁后，γ振蕩功率譜較加入雷帕霉素后相比提高了(17.5±1.9)%(圖2B2、B3、C，P<0.01，配對(duì)的t檢驗(yàn)，n=6)。以上結(jié)果表明：雷帕霉素不能阻斷尼古丁提高γ振蕩功率的作用。

2.3SB415286對(duì)γ網(wǎng)絡(luò)振蕩的影響

當(dāng)γ網(wǎng)絡(luò)振蕩達(dá)到穩(wěn)態(tài)后，使用SB415286(10μmol)，γ振蕩功率譜提高了(11.9±8.1)% (圖3B1、B2、C，P>0.05，配對(duì)t檢驗(yàn)，n=5)；再加入尼古丁后γ振蕩功率譜較加入SB415286后相比提高了(5.4±1.8)%(圖3B2、B3、C，P<0.05，配對(duì)的t檢驗(yàn)，n=5)。以上結(jié)果表明：SB415286能阻斷尼古丁提高γ振蕩功率的作用。

注：A1是未加紅藻氨酸(KA)時(shí)記錄到的細(xì)胞外場(chǎng)電位1S原始曲線；A2是應(yīng)用KA(200nM)后記錄到的場(chǎng)電位1S原始曲線；A3是在A2的基礎(chǔ)上應(yīng)用尼古丁(1μM)后記錄到的場(chǎng)電位1S原始曲線。B1是未加KA時(shí)記錄到的能譜圖；B2是應(yīng)用KA(200nM)后記錄到的能譜圖；B3是應(yīng)用1μM尼古丁后記錄到的能譜圖。圖1　尼古丁對(duì)γ網(wǎng)絡(luò)振蕩的影響

注：A1是應(yīng)用KA(200nM)后記錄到的場(chǎng)電位1S原始曲線；A2是在A1的基礎(chǔ)上應(yīng)用雷帕霉素(100nM)后記錄到的場(chǎng)電位1S原始曲線；A3是在A2的基礎(chǔ)上應(yīng)用1μM尼古丁后記錄到的場(chǎng)電位1S原始曲線。B1～B3是應(yīng)用KA，雷帕霉素，尼古丁后記錄到的能譜圖。C柱狀圖是應(yīng)用KA、雷帕霉素、尼古丁后功γ網(wǎng)絡(luò)振蕩的功率譜。圖2　雷帕霉素對(duì)γ網(wǎng)絡(luò)振蕩的影響

注：A1是應(yīng)用KA(200nM)后記錄到的場(chǎng)電位1S原始曲線；A2是在A1的基礎(chǔ)上應(yīng)用SB415286(10μM)后記錄到的場(chǎng)電位1S原始曲線；A3是在A2的基礎(chǔ)上應(yīng)用尼古丁(1μM)后記錄到的場(chǎng)電位1S原始曲線。B1～B3是應(yīng)用KA、SB415286、尼古丁后記錄到的能譜圖。C柱狀圖是應(yīng)用KA、SB415286、尼古丁后γ網(wǎng)絡(luò)振蕩的功率譜。圖3　SB415286對(duì)γ網(wǎng)絡(luò)振蕩的影響

2.4Triciribine對(duì)γ網(wǎng)絡(luò)振蕩的影響

當(dāng)γ網(wǎng)絡(luò)振蕩達(dá)到穩(wěn)態(tài)后，使用5μM Triciribine，γ振蕩功率譜提高了(18.2±6.0)% (圖4B1、B2、C，P<0.05，配對(duì)t檢驗(yàn)，n=5)；再加入尼古丁后，γ振蕩功率譜較加入Triciribine后相比提高了(2.8±3.2)%(圖4B2、B3、C，P>0.05，配對(duì)的t檢驗(yàn)，n=5)。以上結(jié)果表明：Triciribine能提高γ振蕩功率，并且能阻斷尼古丁的作用。

注：A1是應(yīng)用KA(200nM)后記錄到的場(chǎng)電位1S原始曲線；A2是在A1的基礎(chǔ)上應(yīng)用Triciribine(5μM)后記錄到的場(chǎng)電位1S原始曲線；A3是在A2的基礎(chǔ)上應(yīng)用尼古丁(1μM)后記錄到的場(chǎng)電位1S原始曲線。B1～B3是應(yīng)KA、Triciribine、尼古丁后記錄到的能譜圖。C柱狀圖是應(yīng)用KA、Triciribine、尼古丁后γ網(wǎng)絡(luò)振蕩的功率譜。圖4　Triciribine對(duì)γ網(wǎng)絡(luò)振蕩影響

3討論

低濃度尼古丁(1μM)在海馬腦片CA3區(qū)能增強(qiáng)持續(xù)的γ網(wǎng)絡(luò)振蕩，加入NMDA受體阻斷劑后，尼古丁對(duì)γ網(wǎng)絡(luò)振蕩的作用消失[4]。由此可見NMDA調(diào)節(jié)尼古丁的γ網(wǎng)絡(luò)振蕩增強(qiáng)作用。我們結(jié)果也顯示，Akt或GSK-3β的抑制阻斷了尼古丁的γ網(wǎng)絡(luò)振蕩增強(qiáng)作用，但是mTOR的抑制對(duì)尼古丁的γ網(wǎng)絡(luò)振蕩增強(qiáng)作用無影響，表明尼古丁通過激活NMDA受體，導(dǎo)致一系列的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)(激酶)激活，包括PI3K-Akt-GSK-3β信號(hào)通路的激活，而調(diào)控了γ網(wǎng)絡(luò)振蕩。

有趣的是，在一定條件下Akt抑制劑Triciribine本身增強(qiáng)了γ網(wǎng)絡(luò)振蕩，這種現(xiàn)象提示Akt可能直接參與γ網(wǎng)絡(luò)振蕩的調(diào)控。也有報(bào)道表明Triciribine 是一個(gè)DNA合成的抑制劑，這種現(xiàn)象是否與其對(duì)DNA合成的抑制有關(guān)待進(jìn)一步探討。

mTOR的抑制對(duì)尼古丁的γ網(wǎng)絡(luò)振蕩增強(qiáng)作用并無影響，mTOR是GSK-3β上游信號(hào)，mTOR的抑制會(huì)導(dǎo)致GSK-3β的活性下降，和應(yīng)用GSK-3β的阻斷劑應(yīng)該有相似作用。說明mTOR的作用的復(fù)雜性和細(xì)胞種類的特異性。

Akt或者其他蛋白激酶如PKA能磷酸化GSK-3β并阻斷其介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[14,15]。所以抑制Akt和GSK-3β應(yīng)該會(huì)出相反的結(jié)果。然而使用上述兩個(gè)受體的阻斷劑后，尼古丁的效應(yīng)都被阻斷。最近研究表明酒精能同時(shí)激活A(yù)KT和GSK-3β[16,17]，是否尼古丁能通過類似的機(jī)制產(chǎn)生作用，待進(jìn)一步研究。

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[編輯]方多

[收稿日期]2016-01-01

[作者簡(jiǎn)介]賀小龍(1988-)，男，碩士生，主要從事神經(jīng)病學(xué)研究工作；通信作者：路承彪，354277140@qq.com。

[中圖分類號(hào)]R338.2

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

[文章編號(hào)]1673-1409(2016)18-0001-05

[引著格式]賀小龍，成祥林，錢鋒，等.尼古丁通過蛋白激酶B和糖原合成酶激酶-3調(diào)節(jié)γ網(wǎng)絡(luò)振蕩[J].長江大學(xué)學(xué)報(bào)(自科版)，2016，13(18)：1～5.