綠木霉ZY-01中纖維素酶EGⅣ基因的克隆及其在E.coli中的原核表達(dá)

胡　僑，羅　偉，阮　濤，侯亞利，黃　皓，楊忠華

(武漢科技大學(xué)化學(xué)工程與技術(shù)學(xué)院， 湖北 武漢，430081)

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綠木霉ZY-01中纖維素酶EGⅣ基因的克隆及其在E.coli中的原核表達(dá)

胡僑，羅偉，阮濤，侯亞利，黃皓，楊忠華

(武漢科技大學(xué)化學(xué)工程與技術(shù)學(xué)院， 湖北 武漢，430081)

摘要：以前期篩選到的纖維素酶高產(chǎn)菌株綠木霉T.viride ZY-01的總RNA為模板，利用RT-PCR技術(shù)克隆出內(nèi)切葡聚糖酶EGⅣ基因，連接至pET-28a構(gòu)建出重組質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化至E.coli BL21(DE3)中表達(dá)。該EGⅣ基因約有1089 bp，在啟動子T7lac的控制和IPTG的誘導(dǎo)下，目的基因成功地在原核細(xì)胞中表達(dá)。通過SDS-PAGE檢測得出目標(biāo)蛋白分子量為39 kDa，重組酶的比酶活為1.05 U/mg，該酶最適pH值為6、最適反應(yīng)溫度為50 ℃。

關(guān)鍵詞：綠色木霉；纖維素酶；內(nèi)切葡聚糖酶；EGⅣ基因；基因重組；原核表達(dá)

纖維素是自然界中最豐富、最廉價的有機(jī)可再生資源，而纖維素酶是生物轉(zhuǎn)化纖維素過程中的一類復(fù)合酶，主要由內(nèi)切葡聚糖酶EG、外切葡聚糖酶CBH和β-葡糖苷酶BG等組成，其中，EG酶主要作用于纖維素內(nèi)部的非結(jié)晶區(qū)，能隨機(jī)地在纖維素分子內(nèi)部降解β-1,4糖苷鍵，使長鏈纖維素分子分解成大量含非還原性末端的小分子纖維素。由于EG酶在降解纖維素的過程中起著至關(guān)重要的作用，因此對其基因克隆和表達(dá)的研究成果有不少，其中部分是在酵母表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)[1-3]，但酵母表達(dá)系統(tǒng)較復(fù)雜，并且存在表達(dá)量較低等問題，而原核表達(dá)系統(tǒng)有很多優(yōu)點(diǎn)，如遺傳圖譜明確、遺傳背景清楚、菌株培養(yǎng)操作簡單且周期短成本低、能大量獲得基因表達(dá)產(chǎn)物等，所以，研究EG酶在原核系統(tǒng)中的高效表達(dá)具有重要的意義。

隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，近年來研究人員已從細(xì)菌和真菌(包括里氏木霉、康氏木霉和瑞氏木霉等)中克隆到80多種纖維素酶的相關(guān)基因，這些種屬中的大多數(shù)基因均在大腸桿菌(E.coli)中得到表達(dá)[4-5]。同時，綠色木霉中的CBHⅠ、EGⅢ、EGⅠ等基因也已被克隆出來并在E.coli中表達(dá)[6-7]，但綠色木霉EGⅣ基因目前只在家蠶體內(nèi)表達(dá)過[8-9]。為此，本文擬采用逆轉(zhuǎn)錄和聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)方法從本實(shí)驗(yàn)室前期篩選出的綠木霉T.virideZY-01中克隆EGⅣ基因，并將其轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)中進(jìn)行原核表達(dá)，從而為構(gòu)建高效纖維素酶工程菌株提供技術(shù)基礎(chǔ)。

1實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1菌株及質(zhì)粒

綠木霉T.virideZY-01為本實(shí)驗(yàn)室篩選并保存，該菌已被中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏號為CCTCC No：M 2012205。宿主菌E.coliDH5α和E.coliBL2l(DE3)、表達(dá)載體pET-28a均為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2主要試劑

RNAprep Pure Plant Kit植物總RNA提取試劑盒、質(zhì)?？焖偬崛≡噭┖?、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、T4 DNA連接酶、Taq DNA聚合酶、dNTPs、DNA Marker均購自TIANGEN公司；RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒購自Fermentas公司；限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和HindⅢ購自NEB公司。

1.1.3主要培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基主要用于篩選轉(zhuǎn)化子并誘導(dǎo)重組菌在大腸桿菌中的表達(dá)。察氏培養(yǎng)基主要用于培養(yǎng)T.virideZY-01，按GB/T 4789.28—2003配制。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1T.viride ZY-01的培養(yǎng)

綠木霉T.virideZY-01在察氏固體培養(yǎng)基上劃線，在30 ℃的霉菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 d后，待長出大量單一、均勻的綠色孢子，用蒸餾水洗滌、抽濾得到孢子，保存于液氮或-80 ℃冰箱中備用。

1.2.2T.virideZY-01 RNA的提取以及cDNA的合成

在液氮的作用下將備用孢子研磨至粉末狀。根據(jù)說明書用RNAprep Pure Plant Kit植物總RNA提取試劑盒提取T.virideZY-01的總RNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。以總RNA為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶M-MuLV的作用下，根據(jù)RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒的說明合成cDNA，保存于-70 ℃冰箱中，作為PCR擴(kuò)增的模板。

1.2.3T.virideZY-01纖維素酶EGⅣ基因的克隆

根據(jù)GenBank上編號為HM222525.1的同源菌株TrichodermavirideAS3.3711 EGⅣ的mRNA序列，利用Primer Premier 5軟件設(shè)計引物，根據(jù)序列特點(diǎn)以及pET-28a上的酶切位點(diǎn)，添加相應(yīng)的酶切位點(diǎn)及保護(hù)性堿基，委托北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司合成引物，引物序列為：

正向: 5′-CCCA/AGCTTATGATCCAGAAACTGTCTAACC-3′(HindⅢ)；

反向：5′-CGCG/GATCCCTAGTTCAGGCACTGAGCGTAG-3′(BamHⅠ)。

以cDNA為模板，PCR擴(kuò)增出纖維素酶EGⅣ基因，反應(yīng)條件為：32次擴(kuò)增循環(huán)(95 ℃×5 min，94 ℃×1 min，59 ℃×1 min，72 ℃×1.5 min)，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到目的基因。

1.2.4重組質(zhì)粒pET-28a-EGⅣ的構(gòu)建

回收擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物，同時對表達(dá)載體pET-28a和EGⅣ基因用BamHⅠ和HindⅢ進(jìn)行雙酶切，膠回收并純化，經(jīng)T4 DNA連接酶于16 ℃過夜連接后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌E.coliDH5α，在LB/Kan50抗性平板上篩選轉(zhuǎn)化子，轉(zhuǎn)化子經(jīng)菌落PCR和重組質(zhì)粒雙酶切鑒定，將鑒定正確的重組質(zhì)粒送至北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司測序。

1.2.5EGⅣ基因在E.coliBL21(DE3)中的誘導(dǎo)表達(dá)

測序正確的重組質(zhì)粒用熱激法轉(zhuǎn)化至E.coliBL21(DE3)中，挑取陽性重組子至液體LB/Kan50中，37 ℃搖床培養(yǎng)至OD600為0.4～0.6時，降溫至30 ℃，分別加入終濃度為0.4、0.7、1.0 mmol/L的 IPTG，誘導(dǎo)6 h后取10 mL菌液，離心沉淀，用pH值為7.4 的0.2 mol/L PBS(磷酸鹽緩沖液)洗滌后重懸，超聲波破碎菌體，經(jīng)4 ℃、10 000g離心后收集上清液和沉淀，分別加入100 μL 1×蛋白上樣緩沖液，進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測,同時與誘導(dǎo)空載體pET-28a轉(zhuǎn)化至E.coliBL21(DE3)的菌株進(jìn)行對照。

1.2.6粗酶液的制備及內(nèi)切葡聚糖酶的酶活力測定

取50 mL大腸桿菌的重組子誘導(dǎo)菌液，于4 ℃、8000g離心2 min收集菌體，用5 mL濃度為0.05 mmol/L的檸檬酸緩沖液(pH=4.8)重懸，超聲破碎菌體，4℃、8000g離心10 min，所得上清液即為粗酶液。制作BSA標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用Bradford法對粗酶液中的蛋白含量進(jìn)行測定。

以羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)為底物，用粗酶液將其降解為葡萄糖，利用DNS(二硝基水楊酸)法測葡萄糖的含量，以計算內(nèi)切葡聚糖酶的酶活力。具體方法為：取0.5 mL處理好的粗酶液與1 mL 含0.5% CMC-Na的檸檬酸緩沖液(pH=4.8)在50 ℃反應(yīng)1 h，加入0.5 mL DNS終止反應(yīng)，沸水浴5 min后迅速冰水浴至室溫，加4 mL蒸餾水，混勻，用紫外分光光度計測出OD540值。在本實(shí)驗(yàn)條件下每分鐘由底物產(chǎn)生1 μmol葡萄糖所需的酶量定義為1個酶活力單位(U)。

2實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1T.virideZY-01中纖維素酶EGⅣ基因的克隆

經(jīng)察氏培養(yǎng)基培養(yǎng)得到的生長狀態(tài)最佳的T.virideZY-01綠色孢子如圖1所示，從中提取的總RNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖2所示。由圖2可見，T.virideZY-01總RNA中28S和18S的條帶亮度比為2∶1，且條帶非常整齊，無拖帶現(xiàn)象，表明RNA是完整的；通過測量得出OD260/OD280的值為2.0，表明RNA的純度較高，沒有發(fā)生降解。

RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果如圖3所示。圖3顯示PCR產(chǎn)物的大小約為1100 bp。將目的基因純化后進(jìn)行測序，結(jié)果表明EGⅣ基因開放閱讀框長度為1089 bp，編碼344個氨基酸，計算得到蛋白分子量為39 kDa。所得基因序列與GenBank上編號為 HM222525的序列相比，堿基相似度為91.3%，氨基酸序列相似度高達(dá)100%。

圖1　T. viride ZY-01綠色孢子

Lane 1：DNA Marker;Lane 2：總RNA

Fig.2 Electrophoretogram of total RNA fromT.virideZY-01

Lane 1: 100 bp DNA Ladder;

Fig.3 Electrophoretogram of RT-PCR amplification products

2.2重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

按1.2.4節(jié)的方法構(gòu)建重組質(zhì)粒，挑取轉(zhuǎn)化子至含Kan抗性的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，提取重組質(zhì)粒，利用BamHⅠ和HindⅢ進(jìn)行雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖4，圖中顯示獲得了5300 bp和1100 bp的目的片段，表明質(zhì)粒構(gòu)建成功并成功轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中。

Lane 1：Marker Ⅲ；

Fig.4 Electrophoretogram of recombinant plasmid pET28a-EGⅣ by double enzyme digestion

2.3重組酶的誘導(dǎo)表達(dá)及酶活力測定

分別取不同濃度IPTG下的誘導(dǎo)液，按照1.2.5節(jié)的方法處理之后進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測，結(jié)果如圖5所示。從圖5中能看到約為39 kDa的目的蛋白，這與利用DNA測序結(jié)果進(jìn)行翻譯后預(yù)測的蛋白分子大小相同，說明EGⅣ基因成功地在大腸桿菌中表達(dá)。經(jīng)過檢測計算得到1 L重組菌發(fā)酵液的酶活力為49 U，蛋白含量為0.047 g，表達(dá)強(qiáng)度為49 U/L發(fā)酵液，CMCase比酶活為1.05 U/mg，比野生型綠色木霉T.virideZY-01的CMCase比酶活[10]提高了0.17 U/mg。

Lane M: 蛋白Marker； Lane 1: pET-28a誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物；

Fig.5 SDS-PAGE result of expression products induced by IPTG

2.4重組酶最適宜的反應(yīng)溫度和pH值

分別取1 mL粗酶液與1 mL含0.5% CMC-Na的檸檬酸鈉緩沖液(pH=4.8)，在25、35、…、95 ℃反應(yīng)1 h，測取相應(yīng)條件下EGⅣ重組酶的酶活力，結(jié)果如圖6所示。由圖6可以看出，隨著反應(yīng)溫度從25 ℃升至50 ℃，EGⅣ重組酶的酶活力迅速提高，這是因?yàn)闇囟壬呖杉涌旆肿舆\(yùn)動的速率、提高分子碰撞概率，從而使反應(yīng)速率加快；在50 ℃左右時酶活力達(dá)到最高值；隨著反應(yīng)溫度的繼續(xù)上升，酶蛋白逐步變性而失活，從而降低酶促反應(yīng)速率，酶活力逐漸下降。因此，本研究得到的內(nèi)切葡聚糖酶在50 ℃反應(yīng)時酶活力達(dá)到最高，而野生型綠色木霉T.virideZY-01的纖維素酶最適溫度為60 ℃[10]，兩者存在一定的差異，這是因?yàn)橹亟M酶的酶組分比較單一，而野生綠色木霉生產(chǎn)的纖維素酶是一種復(fù)合酶。

圖6　不同反應(yīng)溫度下重組酶的相對酶活

Fig.6 Relative enzyme activity of recombinase at different reaction temperatures

分別取1 mL粗酶液與1 mL含0.5% CMC-Na的檸檬酸鈉緩沖液(pH值在3～12之間變化)，在50 ℃下反應(yīng)1 h，測取相應(yīng)條件下EGⅣ重組酶的酶活力，結(jié)果如圖7所示。由圖7可以看出，隨著底物pH值從3升至6，底物分子逐步達(dá)到解離狀態(tài)，酶與底物逐漸結(jié)合，使得酶活力不斷上升；當(dāng)?shù)孜飌H值為6時，酶活性中心的可解離基團(tuán)處于最適反應(yīng)狀態(tài)，酶活力達(dá)到最高；隨著pH值的繼續(xù)升高，酶蛋白變性而失活，酶活力又迅速下降。同樣，重組酶的最適pH值與野生型綠色木霉T.virideZY-01的纖維素酶最適pH值(=5.0)[10]相比有一定的差異，EGⅣ重組酶最適宜的作用環(huán)境更接近中性。

圖7　不同pH值下重組酶的相對酶活

Fig.7 Relative enzyme activity of recombinase at different pH values

3討論

綠色木霉是木霉屬中纖維素酶產(chǎn)量較高的菌株，但纖維素酶是復(fù)合酶，而且在纖維素酶降解纖維素的過程中，各組分的比例主要由微生物內(nèi)部的調(diào)控機(jī)制調(diào)節(jié)。為了明確各組分的主要作用，只能采用基因工程技術(shù)分別將纖維素酶中的相關(guān)基因克隆下來并進(jìn)行表達(dá)，對不同酶的活性進(jìn)行測定，找到降解天然纖維素最合適的纖維素酶成分以及最合適的比例，從而達(dá)到高效利用纖維素的目的。

盡管原核表達(dá)系統(tǒng)有很多優(yōu)點(diǎn)，但外源基因在原核細(xì)胞中表達(dá)速度過快，極容易在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)聚集而形成包涵體，使表達(dá)的活性蛋白不可溶且酶活較低，信號肽、內(nèi)含子、翻譯后的修飾問題、密碼子的偏愛性都有可能導(dǎo)致這種問題的發(fā)生。在表達(dá)綠木霉的EGⅣ時，考慮到真核基因在大腸桿菌中表達(dá)時普遍存在表達(dá)量低的問題，本實(shí)驗(yàn)選用了pET-28a作為表達(dá)載體。pET系列是利用大腸桿菌T7噬菌體轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)的載體。T7 lac啟動子是迄今最強(qiáng)的啟動子，它可以最大程度地利用大腸桿菌的資源表達(dá)外源蛋白[7]。本表達(dá)系統(tǒng)與釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)相比，內(nèi)切葡聚糖酶表達(dá)的酶活力偏低，究其原因可能是原核細(xì)胞中缺乏真核基因中罕見的密碼子，從而影響了目的蛋白的高效表達(dá)，此外，在研究中尚未對表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化也是影響酶活力的原因之一。去掉信號肽序列、更換為可溶性表達(dá)載體pET-32a、提高表達(dá)內(nèi)切葡聚糖酶活性的實(shí)驗(yàn)還在進(jìn)一步研究中。

4結(jié)語

本研究克隆了實(shí)驗(yàn)室前期篩選的綠木霉T.virideZY-01中的纖維素酶EGⅣ基因，并將其連接至載體pET-28a且轉(zhuǎn)化至E.coliBL21(DE3)中得到內(nèi)切葡聚糖酶EGⅣ工程菌株，其39 KDa的目標(biāo)蛋白成功地在原核細(xì)胞中表達(dá)，重組酶的CMCase比酶活達(dá)到了1.05 U/mg，比野生型T.virideZY-01的CMCase比酶活提高了0.17 U/mg。對重組酶的酶學(xué)特性進(jìn)行研究，得出其最適pH值為6、最適反應(yīng)溫度為50 ℃。

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[責(zé)任編輯尚晶]

Cloning of cellulase EGⅣ gene fromTrichodermavirideZY-01 and its prokaryotic expression inE.coli

HuQiao，LuoWei，RuanTao，HouYali，HuangHao，YangZhonghua

(College of Chemical Engineering and Technology, Wuhan University of Science and Technology, Wuhan 430081, China)

Abstract:Endoglucanase Ⅳ (EGⅣ) gene was cloned by using RT-PCR with the total RNA of Trichoderma viride ZY-01, a strain with high cellulase productivity and screened in our previous work，as template. Then the gene was ligated into pET-28a to construct the recombinant plasmid, and transformed into E.coli BL21(DE3) to be expressed. The cloned EGⅣ gene fragment is about 1089 bp. Controlled by promoter T7lac and induced by IPTG, the target gene is successfully expressed in prokaryote. Molecular weight of the target protein is 39 kDa according to SDS-PAGE analysis. Specific enzyme activity of the recombinase is 1.05 U/mg. The optimum pH value and reaction temperature of this enzyme is 6 and 50 ℃, respectively.

Key words：Trichoderma viride; cellulase; endoglucanase; EGⅣ gene; gene recombination; prokaryotic expression

收稿日期：2015-12-11

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(21376184).

作者簡介：胡僑(1990-)，女，武漢科技大學(xué)碩士生.E-mail: huqiao294873270@163.com通訊作者：楊忠華(1976-)，男，武漢科技大學(xué)教授，博士生導(dǎo)師.E-mail: yangzh@wust.edu.cn

中圖分類號：Q786

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1674-3644(2016)02-0156-05