甘藍型油菜蘿卜質雄性不育恢復系R2572的分子標記研究

楊其東，席　坤，董軍剛，張　博，許　婷，董振生

(西北農林科技大學 農學院，陜西 楊凌 712100)

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甘藍型油菜蘿卜質雄性不育恢復系R2572的分子標記研究

楊其東，席坤，董軍剛，張博，許婷，董振生

(西北農林科技大學 農學院，陜西 楊凌 712100)

[摘要]【目的】 對甘藍型油菜蘿卜質雄性不育系的18個恢復材料進行恢復基因Rfo及其旁側特異性標記研究，以便篩選出與國外同類恢復材料具有差異的恢復系?！痉椒ā?以18個甘藍型油菜蘿卜質雄性不育恢復系為材料，選擇1個Rfo特異性分子標記、5個與Rfo緊密連鎖的標記以及先鋒國際良種公司關于蕓薹屬Ogura恢復系專利鑒定的特異性標記對所選恢復材料進行分子檢測，根據檢測結果與國內外同類恢復材料(RRH1、R113、R211、R2000、CLR650、SRF系、NW1717)進行對比鑒定?！窘Y果】 18個蘿卜質雄性不育恢復材料均含有恢復基因Rfo，各恢復系缺少了R113、R211，R2000共有的標記E33M47、E32M50、OPN20、OPH15、IN6RS4、E33M58、BolJon、ScH03，同時多了一個R211、R2000、CLR650共有的標記PGlint。各恢復系含有和NW1717相同的標記。【結論】 R2572可能與RRH1、R113、R211、R2000、CLR650，SRF系是不同的，而與導入NW1717的蘿卜片段長短較為接近。

[關鍵詞]甘藍型油菜；蘿卜質雄性不育系；恢復系；蘿卜片段；分子標記

利用細胞質雄性不育、三系配套生產雜交油菜是提高油菜產量與品質的最重要途徑之一，這就要求不育系的育性穩(wěn)定且恢復系恢復育性的能力強[1]。目前國內外報道的甘藍型油菜細胞質雄性不育系主要有波里馬細胞質不育系(Polima CMS)、陜2A細胞質不育系(Shan 2A CMS)、Nas 細胞質不育系(Nas CMS)、蘿卜細胞質不育系(Ogura CMS)[2-3]。其中主要應用的CMS系統(tǒng)是Polima CMS和Shan 2A CMS，但Polima CMS和Shan 2A CMS均存在溫度敏感現(xiàn)象，在開花前遇到低溫條件會恢復育性產生微粉，影響雜交種的純度。

Ogura CMS首次報道于蘿卜資源中[4],其對環(huán)境不敏感，不育性穩(wěn)定徹底，由細胞質中線粒體嵌合基因orf138[5-6]和1對隱性細胞核基因(rfrf)共同控制[7]，被認為是最穩(wěn)定的不育材料，而且?guī)缀跛械母仕{型油菜都可以很好地保持其不育性，因此是選育雙低一高油菜不育系的首選途徑。但Ogura CMS恢復系篩選非常困難，Nieuwhof(1990年)與Bonnet(1997年)在歐洲的蘿卜品種中發(fā)現(xiàn)了Ogura CMS的恢復基因Rfo，Desloire等[6]利用圖位克隆的方法將恢復基因定位在1個15 kb的DNA片段上，但到目前為止并未在蕓薹屬作物中找到Ogura CMS的恢復基因[8-9]。因此選育甘藍型油菜的蘿卜質雄性不育恢復系就成為Ogura CMS三系利用的重點。早期，Heyn[10]通過種屬間雜交將蘿卜中的恢復基因導入到甘藍型油菜中，但該材料對Ogura CMS只能起到部分恢復育性的作用。Pelletier等[11]利用細胞融合技術使甘藍型油菜材料獲得了完全恢復Ogura CMS育性的能力，但導入恢復基因的同時也將高硫苷基因及與恢復系緊密連鎖的冗余片段導入甘藍型油菜[12-14]，導致恢復系農藝性狀差[15]，不能用于商業(yè)生產。Primard-Brisset等[16]利用伽馬射線輻射誘變使DNA片段重組，獲得了低硫苷的甘藍型油菜Ogura CMS恢復系R2000，使Ogura CMS雜交油菜在歐洲廣泛運用。先正達股份公司發(fā)現(xiàn)，Ogura蘿卜的核酸片段在恢復基因座與芥子油基因座之間發(fā)生斷裂并重新連接的BLR1重組現(xiàn)象,并通過具備該現(xiàn)象的BLR-038與甘藍型油菜不育系雜交，從后代中選育出農藝性狀良好的低硫苷恢復系[17]。美國先鋒國際良種公司通過輻射誘變技術選育了具有縮短Raphanus片段(SRF)的新蕓薹屬Ogura恢復系[18]。Chen等[19]以蘿-藍(Raphanobrassica，2n=58)為供體材料，利用嫁接技術將恢復基因導入甘藍型油菜，選育出Ogura CMS的恢復系CLR650，其導入的蘿卜片段長度比國外同類恢復材料R113短，但該恢復材料的硫苷含量較高，仍需要進一步的改良才能投入生產。由于國外的Ogura CMS恢復材料長期受到相關專利的保護，而國內能夠用于商業(yè)化生產的同類材料還很少，因此選育新的Ogura CMS恢復系具有十分重要的意義。為此，本研究以18個甘藍型油菜Ogura CMS恢復系為材料，不育系288和316以及相應的保持系為對照材料，利用分子標記技術驗證材料中Rfo基因的有無，并進一步根據國內外同類恢復材料的分子標記檢測結果進行初步比較，為選育出不同于國內外同類恢復材料提供依據。

1材料與方法

1.1試驗材料

供試材料：18個甘藍型油菜Ogura CMS 自交恢復系(R2572系)，源自于能夠完全恢復Ogura CMS且農藝性狀欠佳的恢復系2572(Ogura CMS恢復基因供體)分別與18個農藝性狀良好且高含油量的不育系(恢復基因的受體)進行雜交，在F1代中選擇可育植株套袋自交并取其花粉對Ogura CMS進行雜交，對可以使Ogura CMS育性恢復的后代進行連續(xù)5代的套袋選擇，直至后代的可育性狀穩(wěn)定且可以完全恢復Ogura CMS的育性。2個甘藍型油菜Ogura CMS不育系材料288和316以及相應的保持系作為對照材料。上述材料均由董振生課題組提供。由于缺少受專利保護的Ogura CMS恢復材料，本試驗直接采用文獻報道[18-19]的RRH1、R113、R211、R2000、CLR650、SRF系、NW1717的分子標記結果作為本研究的分子檢測對照。

1.2試驗方法

1.2.1總DNA的提取 植株發(fā)育到3葉期，田間取油菜幼嫩葉片(1～2片)置于2 mL離心管中放入冰盒帶回實驗室。將樣品葉片置于研缽中并加入液氮用研磨棒迅速研碎，加入2% CTAB 760 μL繼續(xù)研磨至勻漿，60 ℃水浴50 min(每10 min振蕩1次)；加入760 μL氯仿∶異戊醇(體積比24∶1)，充分振蕩后在4 ℃下11 000 r/min離心10 min；將上清液轉移至新的1.5 mL離心管中，加入等體積預冷的異丙醇混勻后置于-4 ℃沉淀30 min，11 000 r/min 離心10 min；棄上清液，依次用體積分數(shù)95%乙醇、75%乙醇清洗2次，待沉淀物風干后加入80 μL無胺酶水，置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2分子標記檢測參照Hu等[20]的公開引物，選取1個基于Rfo基因設計的特異標記引物(BnRFO-AS2F/BnRFO-AS2R)，選取Primard-Brisset等[16]文獻中與Rfo基因連鎖的5個(ScH03、ScA14、SG34、BolJon、PGIint)公開標記引物(表1)以及先鋒國際良種公司的專利[18]中所列出的與Rfo基因連鎖的標記引物對供試材料進行分子檢測，檢測結果與Chen等[19]和先鋒國際良種公司專利中的分子標記結果(RRH1、R113、R211、R2000、CLR650、SRF系、NW1717)進行比較。PCR反應體系：模板DNA(80～100 ng/μL)0.6 μL，上下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL，Reaction ES Mix(購自康為世紀生物科技有限公司) 5.0 μL，加無胺酶水至10 μL。PCR循環(huán)參數(shù)：預變性94 ℃ 1 min；變性94 ℃ 30 s，退火56.5 ℃ 45 s，延伸72 ℃ 30 s，共35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，然后4 ℃保存。電泳檢驗：將擴增產物置于2.5%的瓊脂糖凝膠中，在1%TAE緩沖液中120 V電泳50 min。EB染色20 min，水洗后在凝膠成像系統(tǒng)中進行觀察照相。

表 1　Rfo特異性標記及蘿卜標記的引物序列

2結果與分析

2.1R2572的Rfo特異性鑒定

選取Hu等[20]報道的Ogura CMS恢復基因Rfo特異性分子標記引物BnRFO-AS2F/BnRFO-AS2R,對恢復系R2572進行檢測，結果顯示R2572的18個單株均呈陽性反應(圖1)，表明所選的18個恢復材料均含有Ogura CMS恢復基因Rfo。

圖 1　標記BnRFO-AS2F/BnRFO-AS2R的PCR擴增結果

2.2與恢復基因Rfo連鎖的蘿卜標記的檢測

選取5個與Rfo基因連鎖的分子標記ScH03、ScA14、SG34、BolJon、PGIint對恢復系R2572進行分子標記檢測，結果表明,標記ScH03在18個恢復系中均呈陰性反應；標記BolJon(圖2)在18個恢復系中也呈陰性反應，其中導入甘藍型油菜中與Rfo連鎖的蘿卜片段中BolJon標記為600 bp，950 bp源自甘藍型油菜的C基因組，870 bp源自甘藍型油菜的A基因組;標記ScA14、SG34、PGIint(圖3～5)在18個恢復系中均呈陽性反應。

2.3與已報道蕓薹屬Ogura恢復系的比較

將上述結果分別與Primard-Brisset等[16]和Chen等[19]所列舉的具有Rfo基因的RRH1、R113、R211、R2000、CLR650等5個材料進行對比，結果(圖6)表明： R2572比RRH1缺少2個蘿卜標記(ScH03和BolJon)，比R113缺少1個蘿卜標記(BolJon)，比R2000、CLR650、R211缺少1個蘿卜標記(BolJon)，而多1個蘿卜標記(PGIint)。因此可以初步鑒定恢復系R2572與恢復系RRH1、R113、R211、R2000、CLR650不同。

SRF系是由美國先鋒國際良種公司選育出來的一個蕓薹屬Ogura恢復系，已申請專利保護(專利號200980109801.9)。SRF系的恢復基因位于滲入的Raphanus片段上，由于缺乏該恢復系以及專利中列出的恢復材料，因此選取專利中的分子標記結果與本研究中R2572的檢測結果進行對比，結果(圖7)表明，SRF系缺少RMC25標記，而R2572含有RMC25標記。因此初步判斷R2572與SRF系可能存在差異。如表2所示，R2572系與NW1717的分子標記結果相同，因此推測R2572可能與NW1717蘿卜片段的長短較為接近。根據專利中所列出的法國農科院的R2000、R211與R113的分子標記結果作為對照，可以看出R2572比R211和R2000缺少E33M47、E32M50、OPN20、OPH15、IN6RS4、E33M58等6個標記；比R113缺少E33M47、E32M50、OPN20、OPH15、IN6RS4、E33M58、E33M59A、E33M59B等8個標記，因此可以初步說明R2572可能與法國農科院的R2000、R211、R113有所差異。

圖 6　恢復基因連鎖分子標記的比較

圖 7　標記RMC25的PCR擴增結果

標記組MarkergroupRf標記RfmarkerR2572SRF-R1439SRF-R1815SRF-R1931NW1717R2000-INRAR211-INRAR113-INRARMA0110001111ⅠRMA0210001111RMA0810001111RMA1010001111RMB0111111111E35M6211111111RMB0211111111ⅡRMB0411111111RMB0811111111RMB1011111111OPF1011111111RMB1211111111

續(xù)表 2　Continued table 2

注：“1”表示含有此標記；“0”表示無此標記。

Note:“1” stands for with the marker;“0” stands for without the marker.

3結論與討論

三系配套系統(tǒng)對于甘藍型油菜雜種制種是至關重要的。甘藍型油菜蘿卜質雄性不育恢復系2572由于攜帶的蘿卜滲入片段過長，且這些片段導致恢復系的高硫苷和較差的農藝性狀，不利于農業(yè)生產。減數(shù)分裂具有的不穩(wěn)定性可以促進同源染色體的重組和配對。本課題組利用農藝性狀較好的甘藍型油菜蘿卜質雄性不育系作為遺傳背景，通過雜交、自交縮短恢復系中滲入的蘿卜片段，獲得了18個對Ogura CMS具有完全恢復作用的恢復系，從而改善恢復系2572的農藝性狀。

本研究通過對18個恢復材料進行基于恢復基因Rfo的特異性標記檢測，結果表明18個恢復材料均含有Rfo基因。選取5個與Rfo基因連鎖的標記對18個恢復材料進行檢測，結果表明恢復系R2572缺少標記ScH03和BolJon，因此可以初步判斷恢復系R2572可能與恢復系R113、RRH1、R211、R2000、CLR650有所不同。與美國先鋒國際良種公司具有縮短Raphanus片段(SRF)的新蕓苔屬Ogura恢復系分子標記結果對比表明，恢復系R2572與SRF系不同，但與恢復系NW1717的蘿卜滲入片段長短接近。同時恢復系R2572與專利中列出的法國農科院的恢復系R113、R2000和R211的分子標記結果進行對比，進一步表明恢復系R2572中的蘿卜滲入片段可能短于恢復系R113、R211、R2000，是與之不同的蘿卜質雄性不育恢復系。

由于生物體內存在個別堿基突變的情況，而該情況的發(fā)生可能導致引物無法與堿基片段結合，無法產生擴增的目的片段。因此本研究還有待于在獲得國外受專利保護的恢復材料后進行進一步的測序比對驗證。

[參考文獻]

[1]廖志強，況晨光，許麗芳，等.中國甘藍型油菜細胞質雄性不育的主要類型及在育種實踐中的應用 [J].中國農學通報,2010(3):105-110.

Liao Z Q,Kuang C G,Xu L F,et al.The main styles of cytoplasmic male sterility inBrassicanapusL.and their applications in China [J].Chinese Agricultural Science Bulletin,2010(3):105-110.(in Chinese)

[2]朱彥濤，李殿榮，郭藹光，等.甘藍型油菜細胞質雄性不育系Polima A和陜2A的研究進展 [J].分子植物育種，2009,7(1):5-15.

Zhu Y T,Li D R,Guo A G, et al.Research progress on Polima A and Shan 2A of cytoplasmic male sterile lines inBrassicanapusL. [J].Molecular Plant Breeding,2009,7(1):5-15.(in Chinese)

[3]Hu Q,Andersen S,Dixelius C,et al.Production of fertile intergenetic somatic hybrids betweenBrassicanapusand sinapis arvensis for the enrichment of the rapeseed gene pool [J].Plant Cell Reports,2002,21(2):147-152.

[4]Ogura H.Studies on the new male sterility in Japanese radish,with special references to the utilization of this sterility towards the practical raising of hybrid seed [J].Mem Fac Agric Kagoshima Univ,1968,6(2):39-78.

[5]Brown G G,Formanova N,Jin H,et al.The radishRforestorer gene of Ogura cytoplasmic male sterility encodes a protein with multiple pentatricopeptide repeats [J].Plant J,2003,35(2):262-272.

[6]Desloire S,Gherbi H,Laloui W,et al.Identification of the fertility restoration locus,Rfo,in radish,as a member of the pentatricopeptide-repeat protein family [J].EMBO Rep,2003,4(6):588-594.

[7]Bonhomme S,Budar F,Lancelin D,et al.Sequence and transcript analysis of the Nco 2.5 Ogura-specific fragment correlated with cytoplasmic male sterility inBrassicahybrids [J].Mol Gen Genet,1992,235(2):340-348.

[8]劉后利.油菜的遺傳和育種 [M].上海：上?？茖W技術出版社，1985:387-391.

Liu H L.The genetic and breed of rapeseed [M].Shanghai:Shanghai Scientific and Technical Press,1985:387-391.(in Chinese)

[9]Hiroshi Y.Distribution and allelism of restorer genes for Ogura cytoplasmic male sterility in wild and cultivated radishes [J].Genes Genetic Systems,1998,73(2):79-83.

[10]Heyn F W.Transfer of restore genes from Raphanus to cytoplasmic male sterileBrassicanapus[J].Cruciferae Newsletter,1976,1:15-16.

[11]Pelletier G,Primard C,Vedel F,et al.Intergeneric cytoplasmic hybridization in Cruciferea by protoplast fusion [J].Mol Gen Genet,1983,191(2):244-250.

[12]Jean M，Brown G G,Landry B S.Genetic mapping of nuclear fertility restorer genes for the ‘Polima’ cytoplasmic male sterility in canola(BrassicanapusL.)using DNA markers [J].Theoretical and Applied Genetics,1997,95(3):321-328.

[13]Pellan-Delourme R.Cytoplasmic male sterility in rapesees(Br-assicanapusL.):Female fertility of restored with “Ogura” and cybrids cytoplasms [J].Genome,1988,30:234-238.

[14]Delourme R,Bouchereau A,Hubert N,et al.Identification of RAPD markers linked to a fertility restorer gene for the Ogura radish cytoplasmic male sterility of rapeseed(BrassicanapusL.) [J].Theoretical and Applied Genetics,1994,88:741-748.

[15]Tian E T,Roslinsky V,Cheng B F.Molecular marker-assisted breeding for improve Ogura cms restorer line(RfoRfo) and mapping of the restorer gene(Rfo) inBrassicajuncea[J].Mol Breeding,2014,34:1361-1371.

[16]Primard-Brisset C,Poupard J P.A new recombined double low restorer line for the Ogu-INRA cms in rapeseed(BrassicanapusL.) [J].Theoretical and Applied Genetics,2005,111:736-746.

[17]辛根塔參與股份公司.Ogura細胞質雄性不育蕓薹屬植物的改良的育性恢復方法：中國，200580003519.4 [P].2007-02-14.

Syngenta Participations AG.Fertility restoration for Ogura cytoplasmic male sterileBrassicaand method:China,200580003519.4 [P].2007-02-14.(in Chinese)

[18]先鋒國際良種公司.具有縮短的Raphanus片段(SRF)的新的蕓薹屬Ogura恢復系:中國，200980109801.9 [P].2011-06-01.

Pioneer High-bred International,INC.Raphanus fragment reduction in SRF lines:China,200980109801.9 [P].2011-06-01.(in Chinese)

[19]Chen W J，Li M,Wang T H,et al.Development of new restorer materials with Ogu CMS inBrassicanapus[J].Agricultural Science & Technology,2013,14(1):18-25.

[20]Hu X E,Sullivan-Gilbert M,Kubik T,et al.Mapping of the ogura fertility restorer geneRfoand development ofRfoallele-specific markers in canola(BrassicanapusL.) [J].Mol Breeding,2008,22(4):663-674.

Molecular markers of Ogura CMS restorers R2572 inBrassicanapus

YANG Qi-dong,XI Kun,DONG Jun-gang,ZHANG Bo,XU Ting,DONG Zhen-sheng

(CollegeofAgronomy,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi712100,China)

Abstract:【Objective】 This study conducted molecular research on 18 Ogura CMS restorers (R2572) in Brassica napus with one specific marker for Ogura CMS restoring gene Rfo and its linkage markers to select different restorers from similar foreign materials.【Method】 Molecular detection on 18 Ogura CMS restorers (R2572) was conducted using one Rfo specific marker,5 radish markers linked with Rfo,and specific markers of SRF line.Testing results were compared with similar restorers (RRH1,R113,R211,R2000,CLR650,SRF and NW1717).【Result】 All the 18 restorers of R2572 contained Ogura CMS restorer gene Rfo.Compared to R113,R211 and R2000,R2572 lacked markers E33M47,E32M50,OPN20,OPH15,IN6RS4,E33M58,BolJon and ScH03 but owned PGlint.R2572 had the same markers as NW1717.【Conclusion】 R2572 may be different from RRH1,R113,R211,R2000,CLR650 and SRF,and its length was similar to of radish fragment with NW1717.

Key words:Brassica napus;Ogura CMS;restorer line;radish fragment;molecular markers

DOI：網絡出版時間:2016-03-1408:4510.13207/j.cnki.jnwafu.2016.04.008

[收稿日期]2015-09-06

[基金項目]陜西省科技統(tǒng)籌創(chuàng)新工程計劃項目“主要糧油作物新品種選育”(2011KTZB02-01-03)

[作者簡介]楊其東(1990-)，男，吉林白山人，在讀碩士，主要從事作物雜種優(yōu)勢理論與應用研究。E-mail：jlbsyqd@126.com[通信作者]董振生(1957-)，男，陜西永壽人，研究員，碩士生導師，主要從事油菜遺傳育種研究。E-mail：dzs05319@163.com

[中圖分類號]S634.3

[文獻標志碼]A

[文章編號]1671-9387(2016)04-0057-07

網絡出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20160314.0845.016.html