豬TGEV HN-2012株ORF3a和ORF3b基因遺傳變異分析及其真核表達研究

曹貝貝,蘭培英,2,韓　麗,劉玲玲,韋學(xué)雷,胡　慧,2

(1 河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 牧醫(yī)工程學(xué)院，河南 鄭州 450002；2 河南省動物性食品安全重點實驗室，河南 鄭州 450002)

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豬TGEV HN-2012株ORF3a和ORF3b基因遺傳變異分析及其真核表達研究

曹貝貝1,蘭培英1,2,韓麗1,劉玲玲1,韋學(xué)雷1,胡慧1,2

(1 河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 牧醫(yī)工程學(xué)院，河南 鄭州 450002；2 河南省動物性食品安全重點實驗室，河南 鄭州 450002)

[摘要]【目的】 研究豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)HN-2012株ORF3a和ORF3b基因的遺傳變異情況?！痉椒ā?根據(jù)GenBank公布的豬傳染性胃腸炎病毒ORF3a和ORF3b基因序列，分別設(shè)計合成1對特異性引物，通過RT-PCR從豬傳染性胃腸炎病毒HN-2012株的cDNA中擴增ORF3a和ORF3b基因，經(jīng)克隆測序后，將其基因序列與NCBI中不同來源的TGEV毒株的相應(yīng)序列進行同源性分析，構(gòu)建系統(tǒng)進化樹并進行遺傳變異分析，然后將ORF3a和ORF3b基因亞克隆至真核表達載體，構(gòu)建pCAGGS-ORF3a-flag和pCAGGS-ORF3b-flag載體，轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞進行表達，利用flag標(biāo)簽抗體對2個基因的蛋白表達情況進行Western blot分析?！窘Y(jié)果】 TGEV HN-2012株的ORF3a基因與其他毒株間核苷酸的同源性為92.6%～100%，ORF3b基因與其他毒株間核苷酸的同源性為98.6%～99.7%。Western blot結(jié)果表明，ORF3a蛋白和ORF3b蛋白的分子質(zhì)量約為8 ku和28 ku。【結(jié)論】 TGEV HN-2012株的ORF3a基因與CH/JLY2/08、CH/HLJH/08株等親緣關(guān)系較近，ORF3b基因與TS株、Miller M6株等親緣關(guān)系較近，與我國其他毒株關(guān)系較遠(yuǎn)；成功實現(xiàn)了ORF3a和ORF3b蛋白在293T細(xì)胞中的表達。

[關(guān)鍵詞]TGEV 河南分離株(HN-2012)；ORF3a和ORF3b基因；293T細(xì)胞；真核表達

豬傳染性胃腸炎病毒(Porcine transmissible gastroenteritis virus，TGEV)屬冠狀病毒科冠狀病毒屬成員，可導(dǎo)致豬傳染性胃腸炎(Transmissible gastroenteritis，TGE)。TGE是豬的一種急性、高度傳染性胃腸道疾病[1]，以嘔吐、水樣腹瀉為臨床特征。不同年齡和品種的豬對該病均易感，其中2周齡以內(nèi)的仔豬死亡率可達100%。該病呈世界范圍分布[2]，大多數(shù)養(yǎng)豬國家都有發(fā)生，給世界養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。世界動物衛(wèi)生組織(World Organization for Animal Health，OIE)將TGE定為B類傳染病；我國從20世紀(jì)50年代末期就有該病的報道，近年來TGE在我國部分地區(qū)仍然時有發(fā)生和流行，屬于我國法定檢疫的疫病[3]。

TGEV的基因組為不分節(jié)段的單股正鏈RNA，3′端有Poly(A)，基因組長約28.5 kb，編碼4種結(jié)構(gòu)蛋白(S、M、sM 和N)和3種非結(jié)構(gòu)蛋白(ORF1、ORF3和ORF7)。ORF3編碼基因包括ORF3a和ORF3b2個基因，不同毒株的ORF3b都為735 bp，而ORF3a因毒株的不同而長度不等。TGEVORF3a和ORF3b堿基不同程度缺失可使ORF3發(fā)生突變，將突變的TGEV在細(xì)胞中培養(yǎng)后進行毒力試驗，結(jié)果表明TGEV的毒力有不同程度的減弱[4]，說明ORF3對毒株毒力的強弱起重要作用。

本試驗對TGEV河南新分離株(HN-2012)的ORF3a、ORF3b基因進行克隆及序列分析，并將其克隆到真核表達質(zhì)粒pCAGGS中，在293T細(xì)胞中進行蛋白表達，以期為進一步研究ORF3a、ORF3b的生物學(xué)功能及TGEV的遺傳變異和綜合防治等奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1病毒細(xì)胞TGEV HN-2012株由河南省動物性食品安全重點實驗室分離并保存；改造的真核表達載體pCAGGS和真核細(xì)胞293T由中國科學(xué)院武漢病毒研究所王漢中老師惠贈；pGEM-T Easy質(zhì)粒載體購自Promega公司;大腸桿菌DH5α由河南省動物性食品安全重點實驗室保存。

1.1.2主要試劑與儀器Trans 5K DNA Marker、Trans 15K DNA Marker購自南京百斯凱科技有限公司；QIAamp Viral RNA Mini Kit提取試劑盒和QIAGEN反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自QIAGEN公司；DNA膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒均購自O(shè)MEGA公司；KOD Neo DNA聚合酶購自TOYOBO公司；限制性內(nèi)切酶XhoⅠ和BglⅡ均購自大連寶生物工程有限公司；T4 DNA連接酶和磷酸鈣轉(zhuǎn)染試劑盒均購自Promega公司；胎牛血清、DMEM購自Gibco公司；蛋白分子質(zhì)量Marker為Fermentas公司產(chǎn)品；Western blot用HRP標(biāo)記的二抗和顯色系統(tǒng)購自Pierce公司；2×HBS溶液(140 mmol/L NaCl，1.5 mmol/L Na2HPO4·2H2O，50 mmol/L HEPS，調(diào)節(jié)pH值，0.22 μm濾器過濾)；RIPA細(xì)胞裂解液(50 mmol/L Tris，150 mmol/L NaCl，體積分?jǐn)?shù)1% NP-40，質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%脫氧膽酸鈉)。

紫外凝膠成像系統(tǒng)購自美國 SIM 公司；PTC-200型PCR儀、CO2培養(yǎng)箱、微量加樣器購自美國 Thermo Forma 公司；超凈工作臺購自蘇凈集團安泰公司；LEICA DMIL倒置顯微鏡購自德國萊卡公司。

1.2PCR引物的設(shè)計與合成

分別根據(jù)GenBank公布的TGEVORF3a、ORF3b基因序列，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計1對引物，用于擴增ORF3a、ORF3b基因全長，長度分別為219和735 bp。引物由上海生物工程有限公司合成，引物用滅菌ddH2O稀釋至 25 μmol/L，各引物序列及擴增片段長度見表1。

1.3TGEV HN-2012株cDNA模板的制備

取TGEV在ST細(xì)胞上的第八代毒，提取病毒RNA，操作步驟按照QIAGEN試劑盒說明進行。具體步驟為：吸取140 μL的樣品于560 μL配好的Buffer AVL-carrier RNA中，渦漩振蕩，瞬離，室溫孵育10 min，加入560 μL的乙醇(體積分?jǐn)?shù)96%～100%)至樣本中，混勻，瞬離；將上步混合液吸取630 μL于QiAamp Mini columm(柱子)上，4 ℃、8 000 r/min離心1 min，丟棄帶廢液的舊管，移至新的2 mL的收集管中，重復(fù)此步驟。加入500 μL Buffer AW1，4 ℃、8 000 r/min 離心1 min，丟棄廢管，移至新管。加入500 μL Buffer AW2，4 ℃、12 000 r/min 離心3 min，丟棄廢管，移至新管。4 ℃、12 000 r/min空離1 min，移至新EP管中，60 μL的平衡酚Buffer AVE至膜上，室溫放置1 min，4 ℃、8 000 r/min離心1 min。并利用QIAGEN反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA。

表 1　引物序列及擴增片段預(yù)計長度

注：上游引物3a-F、3b-F中下劃線部分為XhoⅠ酶切位點，下游引物3a-R、3b-R中下劃線部分為BglⅡ酶切位點和flag標(biāo)簽序列。

Note:Underlined in upstream primers 3a-F and 3b-F wereXhoⅠ enzyme cutting sites,while those in downstream primers 3a-R and 3b-R wereBglⅡ enzyme sites and flag tags.

1.4TGEVORF3a/ORF3b基因的PCR擴增及克隆

PCR反應(yīng)總體系為25 μL，其中TGEV HN-2012株cDNA模板2 μL，上下游引物各0.5 μL，KOD Neo DNA聚合酶0.5 μL，dNTPs 2 μL，10×PCR Buffer 2.5 μL，MgSO41 μL，滅菌ddH2O補至25 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s，ORF3a基因53 ℃(ORF3b基因52 ℃)退火1 min，68 ℃延伸1 min，35個循環(huán)；最后68 ℃延伸5 min。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，按OMEGA膠回收試劑盒操作說明回收目的片段，克隆到pGEM-T easy vector，進行PCR鑒定。

1.5ORF3a和ORF3b序列測定與分析

將經(jīng)PCR鑒定正確的質(zhì)粒送上海生物工程有限公司測序。運用生物信息學(xué)軟件將所獲序列與GenBank中登錄的TGEV其他毒株的ORF3a、ORF3b基因序列及由其推導(dǎo)的氨基酸序列進行分析比較。參與比較的序列見表2。

表 2　NCBI中所選TGEV毒株的ORF3a和ORF3b基因信息

1.6ORF3a和ORF3b基因真核表達載體的構(gòu)建

利用限制性內(nèi)切酶XhoⅠ和BglⅡ分別對pGEM-Teasy-ORF3a-flag、pGEM-Teasy-ORF3b-flag和pCAGGS載體進行雙酶切，產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，切取酶切產(chǎn)物，用膠回收純化試劑盒分別回收目的片段，再用T4 DNA連接酶于16 ℃連接過夜，轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于含50 μg/mL Amp的LB平板上培養(yǎng)過夜，挑取單個菌落于5 mL液體LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h后，提取質(zhì)粒，進行PCR及XhoⅠ和BglⅡ雙酶切鑒定，將鑒定正確的重組質(zhì)粒命名為pCAGGS-ORF3a-flag、pCAGGS-ORF3b-flag。

1.7重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞

用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染前1天將其接種到小的細(xì)胞培養(yǎng)皿(35 mm)上，轉(zhuǎn)染前細(xì)胞密度達到80%左右；18～20 h后可用于轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染具體步驟為：①取出小皿培養(yǎng)的293T細(xì)胞，更換新鮮的含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液；②試驗分為2組：第1組，取2支無菌的EP管，標(biāo)記為A1和B1，先向A1管內(nèi)依次加入對應(yīng)體積的ddH2O 55 μL、pCAGGS-ORF3a-flag質(zhì)粒 15 μL、CaCl230 μL，輕輕混勻(終體積為100 μL)；B1管內(nèi)加入100 μL的2×HBS溶液；第2組，取2支無菌的EP管，標(biāo)記為A2和B2，先向A2管內(nèi)依次加入對應(yīng)體積的ddH2O 55 μL、pCAGGS-ORF3b-flag質(zhì)粒15 μL、CaCl230 μL，輕輕混勻(終體積為100 μL)；B2管內(nèi)加入100 μL的2×HBS溶液；③將管A和管B溶液混合：即將管A內(nèi)混合液慢慢滴加至管B中，一邊滴加管A液體一邊輕彈管B；④混合好后室溫靜置30 min；⑤將室溫靜置30 min的混合液(A+B)用移液器輕輕混勻后滴加到小皿內(nèi)，置于體積分?jǐn)?shù)5% CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)；⑥轉(zhuǎn)染6 h后更換新鮮的培養(yǎng)液。試驗同時設(shè)轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pCAGGS作為陰性對照。

1.8ORF3a和ORF3b蛋白表達情況的Western blot鑒定

收集轉(zhuǎn)染24 h后的293T細(xì)胞，先用PBS洗1～2 次，向細(xì)胞中加入100 μL的RIPA細(xì)胞裂解液，冰上裂解10 min；4 ℃、12 000 r/min離心5 min；取上清液，加入 25 μL的5×上樣Buffer，沸水中煮 10 min，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，取上清液，進行SDS-PAGE電泳。利用半干轉(zhuǎn)法將目標(biāo)蛋白電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，將膜放入體積分?jǐn)?shù)5% BSA中4 ℃封閉過夜；TBST洗滌3次，每次5 min；加入flag標(biāo)簽抗體 4 ℃過夜或37 ℃放置1 h；TBST洗膜3次，每次5 min；加入1∶10 000稀釋的羊抗鼠IgG(HRP標(biāo)記)，37 ℃孵育1 h；TBST洗膜3次，每次5 min；進行HRP顯色。

2結(jié)果與分析

2.1TGEV HN-2012株ORF3a和ORF3b基因的PCR擴增

以TGEV HN-2012株cDNA為模板，加入ORF3a和ORF3b基因的上、下游引物，PCR擴增后分別在219 和735 bp處獲得了一特異性條帶(圖1)，與預(yù)期長度相符。

圖 1　TGEV HN-2012株ORF3a(a)和ORF3b(b)基因的PCR擴增

2.2TGEV HN-2012株ORF3a和ORF3b基因的遺傳變異分析

將PCR擴增得到的ORF3a和ORF3b基因全長克隆、測序后，運用生物信息學(xué)軟件MegAlign對所測的基因序列進行分析。序列分析結(jié)果(表3)顯示，TGEV HN-2012株ORF3a基因與attenuated H、CH/HLJH/08、CH/HBQ/08、CH/JLY3/08、CH/HNH/08株的核苷酸同源性最高，為100%；遺傳進化分析顯示，TGEV HN-2012株的ORF3a基因與CH/JLY2/08、CH/HBQ/08、CH/HLJH/08、attenuated H、CH/HNH/08和CH/JLY3/08親緣關(guān)系較近，與其他毒株如Purdue P115株和virulent Purdue株關(guān)系較遠(yuǎn)(圖2a)。TGEV HN-2012株ORF3b基因與Miller M6、CH/SDQ/08和Hebei株的核苷酸同源性最高，為99.7%(表4)；遺傳進化分析顯示，HN-2012株的ORF3b基因與TS株、Miller M6株、CH/SDQ/08和Hebei株親緣關(guān)系較近，與我國其他毒株如virulent Purdue株、AYU株關(guān)系較遠(yuǎn)(圖2b)。

2.3重組質(zhì)粒pCAGGS-3a-flag和pCAGGS-3b-flag的構(gòu)建

重組質(zhì)粒pCAGGS-3a-flag經(jīng)XhoⅠ和BglⅡ雙酶切獲得了219 bp的條帶(圖3a)，pCAGGS-3b-flag經(jīng)XhoⅠ和BglⅡ雙酶切獲得了735 bp的條帶(圖3b)，均與預(yù)期結(jié)果一致。

表 3　TGEV HN-2012株ORF3a基因的核苷酸同源性分析

注：1～14毒株分別為HN-2012、TS、virulent Purdue、Miller M6、Miller M60、Purdue P115、CH/SDQ/08、attenuated H、CH/HLJH/08、CH/HBQ/08、CH/JLY3/08、CH/HNH/08、CH/HLJB/08、CH/JLY2/08。

Note:1-14 strains were HN-2012,TS,virulent Purdue,Miller M6,Miller M60,Purdue P115,CH/SDQ/08,attenuated H,CH/HLJH/08,CH/HBQ/08,CH/JLY3/08,CH/HNH/08,CH/HLJB/08,and CH/JLY2/08, respectively.

圖 2　TGEV HN-2012株ORF3a (a)和ORF3b(b) 基因的核苷酸進化分析

毒株Strain12345678910111299.6399.799.3499.098.698.8599.999.599.998.9699.599.099.598.599.6798.998.598.699.998.898.48100.099.699.798.699.999.598.9999.699.299.998.899.799.398.599.61099.799.3100.098.999.999.598.699.799.911100.099.699.799.099.999.598.9100.099.699.71299.799.399.598.899.699.298.699.799.399.599.7

注：1～12分別為Miller M6、TS、CH/HBQ/08、virulent Purdue、attenuated H、CH/HLJH/08、AYU、CH/SDQ/08、CH/JLY2/08、CH/JLY3/08、Hebei、HN-2012。

Note:1-12 strains were Miller M6,TS,CH/HBQ/08,virulent Purdue,attenuated H,CH/HLJH/08,AYU,CH/SDQ/08,CH/JLY2/08,CH/JLY3/08,Hebei,and HN-2012,respectively.

圖 3　重組質(zhì)粒pCAGGS-3a-flag(a)和pCAGGS-3b-flag(b)的酶切鑒定

2.4pCAGGS-3a-flag和pCAGGS-3b-flag在293T細(xì)胞中的表達

Western blot檢測結(jié)果(圖4)顯示，在轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pCAGGS-3a-flag和pCAGGS-3b-flag的293T細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)有針對flag標(biāo)簽抗體的特異性條帶，條帶大小分別約為(分子質(zhì)量)8 ku和28 ku；而在轉(zhuǎn)染空載體質(zhì)粒的293T細(xì)胞中，未檢測到相應(yīng)的目的條帶，說明重組質(zhì)粒pCAGGS-3a-flag和pCAGGS-3b-flag轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后可成功表達蛋白。

圖 4　重組蛋白ORF3a(a)和ORF3b(b)的Western blot分析

3討論

豬傳染性胃腸炎病毒是一個典型的感染胃腸道的冠狀病毒，但也可以在呼吸道組織中復(fù)制[5]。該病毒能耐受胃液中的低pH環(huán)境，感染覆蓋在空腸和回腸絨毛上的柱狀上皮細(xì)胞。當(dāng)上皮細(xì)胞感染后，導(dǎo)致細(xì)胞脫落、絨毛萎縮以致腹瀉[6]。所有年齡豬均對豬傳染性胃腸炎易感,但仔豬最為嚴(yán)重。

TGEV復(fù)制周期及其影響因素比較復(fù)雜, 病毒編碼結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白的功能及其相互作用比較復(fù)雜, 這就可能決定了病毒與宿主抗病毒天然免疫反應(yīng)及其機制的復(fù)雜性[7]。缺失ORF3基因的TGEV PUR46-MAD感染性克隆株在體內(nèi)的致病力略有降低，但在細(xì)胞培養(yǎng)中能正常復(fù)制[7-8]。然而，另有研究顯示，TGEV 96-1933毒株在ORF3a刪除后仍能保持腸毒性,這表明ORF3a對維持毒力不是必不可少的，但是這種病毒的毒力需要進一步確認(rèn)，因為病毒分離和測序未進行噬斑純化，且純化后的噬斑在豬體內(nèi)并未測試[9-12]。

為了深入研究TGEV HN-2012株的ORF3a和ORF3b基因與其他毒株的進化關(guān)系，本試驗進行了這2個基因遺傳變異的分析比較，結(jié)果顯示，TGEV HN-2012的ORF3a基因與其他毒株間核苷酸的同源性為92.6%～100%，與CH/JLY2/08、CH/HLTH/08株等親緣關(guān)系較近；TGEV HN-2012株的ORF3b基因與其他毒株間核苷酸的同源性為98.6%～99.7%，與TS株、Miller M6株等親緣關(guān)系較近，與我國其他毒株關(guān)系較遠(yuǎn)。對TGEV病毒變異及進化分析等方面的研究,有助于理解TGEV的分子生物學(xué)特性、遺傳與變異規(guī)律,對新型疫苗的研發(fā)及抗病毒藥物的篩選有重要的理論指導(dǎo)價值。

本研究成功構(gòu)建了含ORF3a和ORF3b基因的真核表達質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞中，通過免疫印跡方法證實其可在真核細(xì)胞中成功表達，為進一步研究該蛋白的生物學(xué)功能和抗毒藥的研制奠定了基礎(chǔ)。

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Genetic variation and eukaryotic expression ofORF3aandORF3bfrom porcine TGEV HN-2012 strain

CAO Bei-bei1,LAN Pei-ying1,2,HAN Li1,LIU Ling-ling1,WEI Xue-lei1,HU Hui1,2

(1CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine,HenanAgriculturalUniversity,Zhengzhou，Henan450002,China;2InternationalFederationofZoonoticDiseaseLaboratoryofHenanProvince,Zhengzhou，Henan450002,China)

Abstract:【Objective】 The genetic variation of ORF3a and ORF3b genes of porcine transmissible gastroenteritis virus (TGEV) HN-2012 was investigated.【Method】 A pair of specific primers were designed and synthesized according to TGEV ORF3a and ORF3b sequences in GenBank.RT-PCR was used to amplify ORF3a and ORF3b from HN-2012 strain.Homology analysis was conducted on gene sequences of HN-2012 and other TGEV strains from various sources in NCBI.Phylogenetic tree was also constructed to analyze genetic variation.Then ORF3a and ORF3b were cloned into eukaryotic expression vectors to construct pCAGGS-ORF3a-flag vector and pCAGGS-ORF3b-flag vector, which were transfected into 293T cells to express.Western blot analysis was conducted using flag to tag antibody.【Result】 The homology of ORF3a gene between TGEV HN-2012 strain and other strains was 92.6%-100%,and that of ORF3b was 98.6%-99.7%.Western blot indicated that molecular weights of ORF3a protein and ORF3b protein were 8 ku and 28 ku,respectively.【Conclusion】 The ORF3a gene of TGEV HN-2012 strain was close to CH/HLJH/08,CH/JLY2/08,while ORF3b gene was close to TS strain and Miller M6 strain.They had distant relationship with other strains in China.This study also achieved the expression of ORF3a and ORF3b in 293T cells.

Key words:TGEV isolates in Henan (HN-2012);ORF3a and ORF3b gene;293T cells;eukaryotic expression

DOI：網(wǎng)絡(luò)出版時間:2016-03-1408:4510.13207/j.cnki.jnwafu.2016.04.002

[收稿日期]2014-08-14

[基金項目]國家自然科學(xué)基金項目“Ⅰ型干擾素在TGEV與樹突狀細(xì)胞相互作用中的免疫功能及調(diào)控機制研究”(31101796)；河南省基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計劃項目“豬傳染性胃腸炎病毒感染對ST細(xì)胞免疫生物學(xué)特性的影響”(112300410161)

[作者簡介]曹貝貝(1987-)，女，河南安陽人，碩士，主要從事動物病原學(xué)研究。E-mail：cbb0416@126.com[通信作者]胡慧(1976-)，女，陜西漢中人，副教授，博士，主要從事動物微生物學(xué)研究。E-mail：huhui2001@163.com

[中圖分類號]S852.65+9.6

[文獻標(biāo)志碼]A

[文章編號]1671-9387(2016)04-0010-07

網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20160314.0845.004.html