檸檬酸調(diào)節(jié)水體酸堿度抑制黃絲藻藻華的研究

王愛卿，楊仕豪，李西雨，潘連德

(上海海洋大學(xué)省部共建水產(chǎn)種質(zhì)資源發(fā)掘與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海　201306)

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檸檬酸調(diào)節(jié)水體酸堿度抑制黃絲藻藻華的研究

王愛卿，楊仕豪，李西雨，潘連德

(上海海洋大學(xué)省部共建水產(chǎn)種質(zhì)資源發(fā)掘與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海201306)

摘要：用檸檬酸調(diào)節(jié)試驗(yàn)水體pH值，并保持在5.0、5.5、6.0和6.5四個(gè)梯度下，將采自養(yǎng)殖池塘的黃絲藻(Tribonema sp.)藻華的10 g藻絲體放入試驗(yàn)水體，每隔48 h采樣一次，觀察黃絲藻藻絲體外部形態(tài)、顯微結(jié)構(gòu)的變化。同時(shí)測(cè)定其葉綠素a(Chl a)、丙二醛(MDA)的含量和超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)的活性。結(jié)果表明：96 h黃絲藻藻絲體大量下沉，有些藻絲體斷裂，無氣泡產(chǎn)生，水體開始混濁；192 h水體混濁、藻絲體斷裂并溶解的現(xiàn)象進(jìn)一步明顯；192 h各試驗(yàn)組藻細(xì)胞內(nèi)葉綠體集于中央，并呈現(xiàn)不同程度的解體，細(xì)胞結(jié)構(gòu)也變得模糊，細(xì)胞質(zhì)膜與細(xì)胞壁之間的空隙增大。四個(gè)試驗(yàn)組Chl a含量明顯低于對(duì)照組。對(duì)于SOD、CAT的活性，pH5.0的試驗(yàn)組呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，而pH 5.5、6.0、6.5的試驗(yàn)組呈現(xiàn)先增長(zhǎng)后下降的趨勢(shì)；各個(gè)試驗(yàn)組MDA明顯高于對(duì)照組，這說明192 h后黃絲藻藻絲體受到嚴(yán)重的破壞，開始解體、死亡。試驗(yàn)得出結(jié)論：用檸檬酸降低水體pH值，可以有效抑制或殺死了黃絲藻，從而控制了黃絲藻藻華。

關(guān)鍵詞：檸檬酸；黃絲藻(Tribonema sp)；葉綠素a；抗氧化酶

在養(yǎng)殖水體，絲狀藻類旺盛生長(zhǎng)形成藻華(俗稱青苔)，消耗水體中無機(jī)鹽，釋放有毒物質(zhì)，使水質(zhì)變得清瘦，毒害水生生物[1]。蝦、蟹頰部、額部、基關(guān)節(jié)附著絲狀藻類，會(huì)使蝦、蟹活動(dòng)困難，進(jìn)食減少，嚴(yán)重時(shí)致其窒息死亡[2]。在景觀水體，藻類大量爆發(fā)時(shí)既影響水體的景觀效果，也使水體散發(fā)異味，對(duì)周圍環(huán)境造成影響[3]。

目前，常用控制藻類的方法主要有物理法[4]、化學(xué)法[5-7]和生物法[8-10]。盡管上述方法在短期內(nèi)都能有效控制水體藻類，但長(zhǎng)期使用會(huì)對(duì)生態(tài)系統(tǒng)產(chǎn)生壓迫，并且經(jīng)濟(jì)成本高[11-12]。因此，需要尋找一種既能有效控制藻類，又對(duì)環(huán)境的破壞性小，便于長(zhǎng)期操作的辦法。

表層水體的pH是一個(gè)重要的環(huán)境因素，它能在很大程度上影響藻類種群的增長(zhǎng)[13]。在排除其它外界環(huán)境因素的條件下，藻類只有在一定的pH值范圍內(nèi)才能生長(zhǎng)良好，如果超出這個(gè)范圍，藻類活性就會(huì)受到抑制或死亡[14]。藻類喜歡生長(zhǎng)于偏堿性水體(pH7.7～9.4)，因此在一定的范圍內(nèi)，可以把養(yǎng)殖水體pH值調(diào)到偏酸性，進(jìn)而可以抑制藻類生長(zhǎng)[15]。Axelsson等[16]發(fā)現(xiàn)在酸性條件下，高濃度的金屬和低濃度的營(yíng)養(yǎng)鹽對(duì)藻類的生長(zhǎng)有間接抑制效果，而氫離子的濃度對(duì)藻類有直接的破壞作用。

目前，針對(duì)絲狀藻類的研究主要是其作為初級(jí)生產(chǎn)者對(duì)周圍環(huán)境的影響[17-20]，而作為有害藻華的相關(guān)研究較少[5,21]。本研究利用檸檬酸改變水體pH值來進(jìn)行黃絲藻(Tribonemasp)藻華的抑制試驗(yàn)，探索養(yǎng)殖水體黃絲藻等絲狀藻藻華的預(yù)防與控制的新思路和新方法。

1試驗(yàn)材料

檸檬酸購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒、過氧化氫酶(CAT)試劑盒、丙二醛(MDA)試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

黃絲藻藻華采集于上海浦東新區(qū)臨港新城一個(gè)養(yǎng)殖池塘，去除其上所附的雜草、螺類，放入超白玻璃缸內(nèi)，注入河水，室內(nèi)自然光照下暫養(yǎng)、備用。

2試驗(yàn)方法

2.1檸檬酸添加頻率的確定

分別配置pH值5.0、5.5、6.0、6.5四個(gè)不同梯度的檸檬酸溶液，并設(shè)對(duì)照，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)。連續(xù)進(jìn)行pH值測(cè)定，以便于觀察水體pH值的變化趨勢(shì)，確定檸檬酸添加頻率。

表1　不同處理組12 h 后的pH值變化

注：偏離量平均值中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，后綴相同字母之間表示沒有顯著差異(P>0.05),不同字母者表示差異顯著(P<0.05)，下同。

由表1可知，12 h各試驗(yàn)組pH值與設(shè)定值出現(xiàn)一定的偏差，就平均值而言，pH值5.5時(shí)，偏離程度最小，pH值為5.0時(shí)，偏離程度最大。對(duì)每一次的偏離量的絕對(duì)值進(jìn)行平均后發(fā)現(xiàn)，4個(gè)處理之間pH值偏離值沒有明顯差異。所以，確定間隔12 h為檸檬酸的最佳添加時(shí)間。

2.2黃絲藻藻絲體培養(yǎng)方法和條件

分別稱取10 g的黃絲藻藻絲體，蒸餾水洗凈，放于3 L含有BG11培養(yǎng)基的對(duì)照組(pH=7.8)與加有檸檬酸調(diào)節(jié)pH值為5.0、5.5、6.0、6.5四個(gè)不同梯度的BG11培養(yǎng)基中，日光燈照射，光照度為 2 000 lx，光暗比為 12 h∶12 h，溫度22 ℃，充氣培養(yǎng)。

2.3pH對(duì)黃絲藻藻絲體結(jié)構(gòu)的改變

肉眼觀察不同pH值條件下黃絲藻藻絲體顏色、沉降、光合作用產(chǎn)生的氣泡，水體混濁現(xiàn)象及藻絲體的斷裂與自溶等表觀特征。

使用顯微鏡(型號(hào)：BH-2，×20倍、×40倍)分別觀察不同pH值條件下黃絲藻細(xì)胞壁、細(xì)胞膜、色素體的變化。

2.4pH對(duì)黃絲藻藻絲體Chla含量的影響

每隔48 h取一次樣，測(cè)定Chla含量，連續(xù)進(jìn)行192 h。取0.12 g黃絲藻藻絲體，用吸水紙吸干，放入具塞刻度試管，迅速轉(zhuǎn)移至冰箱冷凍室冷凍12 h和以上或過夜，取出后立即加入15 mL已經(jīng)預(yù)熱(80 ℃)的95%乙醇中，并在恒溫水浴鍋中80 ℃萃取2 min，緊接著使用超聲波細(xì)胞粉碎儀(冰浴中)進(jìn)行粉碎，放入4 ℃冰箱黑暗靜置4 h后，轉(zhuǎn)入有刻度的離心管中，定容至15 mL，離心10 min(4000 r/min)，取上清液于分光光度計(jì)上測(cè)定663 nm、645 nm和630 nm下的吸光度值[22]。Chl a含量按照下列公式計(jì)算：

Ca=[11.64(OD663)-2.16(OD645)+0.10(OD630)]×V/M

式中：Ca為1 g藻絲體中所含的Chl a量(mg/g)；V為定容的體積(L)；M為稱取的藻絲體的重量(g)。

2.5pH對(duì)黃絲藻藻絲體兩種抗氧化酶活性及MDA含量的影響

每隔48 h取一次樣，測(cè)定黃絲藻藻絲體兩種抗氧化酶活性及MDA含量，連續(xù)進(jìn)行192 h。參考Furey等[23]方法，取0.20 g的黃絲藻藻絲體，吸干、剪碎，加入冷卻至4 ℃的0.05 mol/L磷酸緩沖液5 mL(pH=7.82，內(nèi)含4 mmol/L EDTA-Na2)，在冰水浴中用超聲波細(xì)胞粉碎儀破碎，勻漿液8000 r/min、4 ℃下離心10 min，收集上清液，用于測(cè)定SOD、CAT、MDA，樣品處理完后24 h內(nèi)測(cè)定完畢。

2.6數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS13.0單因素方差分析(One-way ANOVY)進(jìn)行Duncan′s法多重比較，P>0.05表示差異不顯著，P<0.05表示差異顯著。

3結(jié)果

3.1pH對(duì)黃絲藻藻絲體結(jié)構(gòu)的改變

3.1.1pH對(duì)黃絲藻藻絲體外部形態(tài)的改變

從圖1、圖2可以看出，試驗(yàn)組藻類由于受到不同程度的損害，96 h和192 h試驗(yàn)組與對(duì)照組出現(xiàn)了明顯的差異性。192 h與96 h相比，pH 6.5的試驗(yàn)組，水體混濁度明顯增加，無氣泡產(chǎn)生，藻類顏色變?yōu)辄S褐色，藻絲體斷裂，沉于瓶底。pH 6.0的試驗(yàn)組混濁度增加，數(shù)量明顯減少。pH 5.5和5.0的水體，幾乎看不到藻絲體，說明基本已經(jīng)溶解。

圖1　96 h不同pH值條件下黃絲藻藻絲體外部形態(tài)結(jié)果

圖2　192 h不同pH值條件下黃絲藻藻絲體外部形態(tài)結(jié)果

3.1.2pH對(duì)黃絲藻藻絲體顯微結(jié)構(gòu)的改變

從圖3、圖4中可以看出，192 h四個(gè)試驗(yàn)組與對(duì)照組出現(xiàn)了明顯差異，pH5.0的試驗(yàn)組中毒現(xiàn)象最為嚴(yán)重，黃絲藻藻絲體接近死亡，與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組的色素體集中于細(xì)胞中央，含量明顯減少，顏色呈黃灰色，細(xì)胞結(jié)構(gòu)也變得模糊，細(xì)胞質(zhì)膜與細(xì)胞壁之間的空隙增大。隨著pH值升高，則中毒現(xiàn)象減輕。pH值5.5、6.0、6.5的試驗(yàn)組藻類色素體含量高于pH值5.0的試驗(yàn)組，黃綠色藻類較多，這說明處理192 h各個(gè)試驗(yàn)組葉綠體受到破壞，葉綠素的合成受到阻礙。

3.2pH對(duì)黃絲藻藻絲體Chla含量影響

由表2，圖5可知，在加入檸檬酸48 h，對(duì)照組pH值8.2，黃絲藻藻絲體Chla含量為0.972 mg/g，而pH值5.0、5.5、6.0、6.5實(shí)驗(yàn)組含量分別為0.558、0.605、0.707、0.822 mg/g，試驗(yàn)組與對(duì)照組表現(xiàn)明顯的差異性。pH值5.5、6.0、6.5的試驗(yàn)組含量呈現(xiàn)先增長(zhǎng)后下降的趨勢(shì)，而pH值5.0的試驗(yàn)組一直保持下降趨勢(shì)。說明pH值5.0的較酸性環(huán)境，使黃絲藻細(xì)胞受到破壞，所以沒有進(jìn)行增殖便開始死亡。而其它試驗(yàn)組由于受到酸性環(huán)境的有效刺激，促進(jìn)其增長(zhǎng)，但是隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，則出現(xiàn)了抑制現(xiàn)象。

3.3pH對(duì)黃絲藻藻絲體兩種抗氧化酶活性、MDA含量的影響

3.3.1pH對(duì)黃絲藻藻絲體SOD活性的影響

由表3，圖6可以看出，pH值5.5、6.0、6.5的環(huán)境條件下，SOD呈現(xiàn)先增長(zhǎng)后下降的增長(zhǎng)趨勢(shì)，而pH值5.0的試驗(yàn)組表現(xiàn)為下降趨勢(shì)，但總體上都低于對(duì)照組。

圖3　192 h后黃絲藻藻絲體顯微結(jié)構(gòu)中毒結(jié)果(×20)

pHChla含量/(mg/g)48h96h144h192h對(duì)照0.972±0.092a1.226±0.075a1.465±0.136a1.537±0.112a5.00.558±0.011d0.445±0.049c0.410±0.012d0.237±0.052e5.50.605±0.058cd0.833±0.082b0.644±0.018c0.464±0.021d6.00.707±0.08bc0.975±0.058b0.926±0.041b0.614±0.082c6.50.822±0.046b1.156±0.123a1.319±0.133a0.878±0.109b

圖4　192 h后黃絲藻顯微結(jié)構(gòu)中毒結(jié)果(×40)

pHSOD活性/(U/mgprot)48h96h144h192h對(duì)照55.369±0.798c69.154±0.700a71.195±1.429a70.747±1.811a5.036.365±0.765e32.576±2.111c26.893±1.634c10.809±1.864e5.546.254±1.484d51.453±2.184b48.972±1.549b29.037±1.351d6.062.934±1.189b66.685±1.097a71.413±1.820a37.857±2.192c6.568.393±2.600a68.713±1.435a70.304±1.130a65.369±2.989b

圖5　不同pH值對(duì)黃絲藻藻絲體葉綠素a含量的影響

圖6　不同pH值對(duì)黃絲藻藻絲體SOD活性的影響

3.3.2檸檬酸對(duì)黃絲藻藻絲體CAT活性的影響

由表4，圖7可知，試驗(yàn)組與對(duì)照組出現(xiàn)明顯差異性，pH值5.5、6.0、6.5的試驗(yàn)組呈現(xiàn)先增長(zhǎng)后下降的趨勢(shì)，而pH值5.0的試驗(yàn)組保持下降趨勢(shì)，并且都明顯低于對(duì)照組。

表4　不同pH值對(duì)黃絲藻藻絲體CAT活性的Duncan′s比較

3.3.3pH對(duì)黃絲藻藻絲體MDA含量的影響

由表5，圖8可知，試驗(yàn)組MDA含量明顯高于對(duì)照組，192 h各個(gè)試驗(yàn)組呈先增長(zhǎng)后下降的趨勢(shì)，并且酸性越強(qiáng)，MDA含量越高。說明試驗(yàn)組黃絲藻藻絲體由于受到酸性環(huán)境的脅迫，細(xì)胞遭到破壞程度最嚴(yán)重。

表5　不同pH值對(duì)黃絲藻藻絲體MDA含量的Duncan′s比較

注：表中MDA單位：nmol/mgprot

4討論

根據(jù)黃絲藻藻絲體結(jié)構(gòu)的變化，葉綠素a含量和各種抗氧化酶指標(biāo)的測(cè)定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，192 h各個(gè)試驗(yàn)組與對(duì)照組相比，表現(xiàn)出明顯的抑制效果。并且抑制率與酸度成正比關(guān)系。抑制率從高到低的順序依次為：pH 5.0>pH 5.5>pH 6.0>pH 6.5>對(duì)照組。針對(duì)調(diào)節(jié)pH值來控制絲狀藻的相關(guān)研究仍較少，但是Wang等[15]的研究表明：使用CO2調(diào)節(jié)試驗(yàn)水體pH值在5.5和6.0時(shí)，可以直接殺死銅綠微囊藻，而在pH值6.5的水體，銅綠微囊藻的生長(zhǎng)受到抑制，但不會(huì)出現(xiàn)死亡。李靜會(huì)等[24]

圖7　不同pH值對(duì)黃絲藻藻絲體CAT活性的影響

圖8　不同pH值對(duì)黃絲藻藻絲體MDA含量的影響

使用醋酸治理玄武湖藍(lán)藻藻華實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：當(dāng)平均用量為26.87 g/m3，水體表面pH值為5.5時(shí)，實(shí)驗(yàn)區(qū)藻類總量下降了82.8%。這與本試驗(yàn)研究有相似之處，說明一定的酸性條件可以抑制或殺死藻類。但對(duì)于不同的藻類，其抑制效果可能會(huì)有差異。對(duì)于其作用機(jī)理有兩種推測(cè)，其一：過量的H+降低碳酸酐酶活性，從而使CO2濃縮機(jī)制受到影響，進(jìn)而導(dǎo)致藻類死亡[25]；其二：過量的H+對(duì)藻細(xì)胞的內(nèi)部結(jié)構(gòu)有直接的破壞作用，從而使光合作用受到影響；特別是降低細(xì)胞質(zhì)和葉綠體內(nèi)pH值，從而阻止卡爾文循環(huán)，因此降低了開放式光合系統(tǒng)II反應(yīng)位點(diǎn)數(shù)量[26]。

Chla在光合作用的光能收集、傳遞和轉(zhuǎn)化中起不可替代的作用，其含量的高低直接影響植物對(duì)于光合能量的利用，進(jìn)而影響到光合能量的凈積累，最終會(huì)以產(chǎn)量和生物量的形式表現(xiàn)出來[27]。本研究中四個(gè)試驗(yàn)組的Chla含量明顯低于對(duì)照組，這可能是由于酸性條件抑制了黃絲藻藻華Chla的合成或造成了Chla的分解。有研究表明：pH值5.5、6.0、6.5的環(huán)境條件下，銅綠微囊藻和魚腥藻的Chla含量明顯下降[16]。這與本試驗(yàn)的結(jié)果相似。

藻類光合作用過程包括光化學(xué)過程和酶促過程。藻類光合磷酸化過程的速度受酶控制，而酶在水溶液環(huán)境中的解離狀態(tài)和行為，都受到氫離子濃度的影響。氫離子濃度對(duì)酶促反應(yīng)的速度不僅有明顯的影響，而且影響機(jī)理也不同[28]。對(duì)于酸性條件下，藻類各種抗氧化酶活性的變化目前還沒有研究。本試驗(yàn)的研究結(jié)果顯示除pH值5.0的試驗(yàn)組藻絲體SOD、CAT活性隨時(shí)間呈下降趨勢(shì)外，其它試驗(yàn)組均表現(xiàn)為先增長(zhǎng)后下降的趨勢(shì)，表明了當(dāng)過度的酸性環(huán)境刺激，會(huì)造成抗氧化酶系統(tǒng)的失活，而適度的酸性環(huán)境脅迫會(huì)增強(qiáng)抗氧化酶活性，從而加強(qiáng)了清除活性氧的綜合能力。但是隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)和脅迫程度的加重，各種抗氧化酶協(xié)同清除活性氧的綜合能力下降，就會(huì)積累更多的活性氧，產(chǎn)生嚴(yán)重的氧化脅迫，進(jìn)而影響細(xì)胞活性。

結(jié)合試驗(yàn)結(jié)果和分析表明，在使用檸檬酸調(diào)節(jié)水體pH值在5.0～6.5之間，對(duì)黃絲藻藻絲體都有一定的抑制效果。因此，在黃絲藻等絲狀藻藻華爆發(fā)的養(yǎng)殖水體，可以通過人為方法適當(dāng)改變水體pH值以達(dá)到抑制絲狀藻藻華的目的。

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(責(zé)任編輯：陳細(xì)華)

Growth inhibition of Tribonema bloom by acidification using citric acid

WANG Ai-qing， YANG Shi-hao，LI Xi-yu，PAN Lian-de

(KeyLaboratoryofExplorationandUtilizationofAquaticGeneticResourcesofChinaMinistry

ofEducation,ShanghaiOceanUniversity，Shanghai201306,China)

Abstract：The Tribonema filaments,weighing 10g,taken from aquacultural ponds were added to four different acidic experimental water (constant pH 5.0,5.5,6.0,and 6.5) driven by citric acid.The external morphology and microscopic structures of Tribonema filaments were observed every 48 h.Meanwhile,the contents of chlorophyll a (Chl a) and malondialdehyde (MDA),and the activities of superoxide dismutase (SOD) and catalase (CAT) were measured.The results showed that after 96 h exposure,lots of Tribonema filaments sank and a fraction of them broke;cloudy water began to appear but free of bubbles.After 192 h exposure,the phenomenon of cloudy-water,and fracture and dissolving of algal filaments became further conspicuous.The intracellular chloroplasts of each test group gathered in the center of cells and showed different levels of disintegration;cell structure became fuzzy;the gap between cell membrane and cell wall increased.The contents of Chl a of each experimental group were significantly lower than that of the control.The group of pH 5.0 showed a tendency to decrease the activities of SOD and CAT,while the other groups increased at first and then decreased on that.MDA contents of each experimental group were significantly higher than that of the control,indicating that Tribonema filaments were severely damaged and began to disintegrate and die after 192 h exposure.It was concluded that acidic water driven by citric acid could effectively inhibit or kill Tribonema sp.and thus control Tribonema blooms.

Key words：citric acid;Tribonema;chlorophyll a;antioxidant enzymes

收稿日期：2014-05-09；

修訂日期：2016-01-13

第一作者簡(jiǎn)介：王愛卿(1986-)，女，碩士研究生， 研究方向：絲狀藻環(huán)境控制生態(tài)學(xué)，E-mail：13825276702@163.com通訊作者：潘連德。E-mail：ldpan@shou.edu.cn

中圖分類號(hào)：S946.3

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1000-6907-(2016)03-0052-08

資助項(xiàng)目：上海市高校知識(shí)服務(wù)平臺(tái)項(xiàng)目(ZF1206)；上海海洋大學(xué)研究生科研基金項(xiàng)目