樹突狀細(xì)胞在人正常子宮內(nèi)膜的表達(dá)及周期性變化研究

李　莉，樓寒梅，黃麗麗

(1.浙江省腫瘤醫(yī)院婦瘤科，杭州 310022；2.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院計劃生育科，杭州 310006)

樹突狀細(xì)胞在人正常子宮內(nèi)膜的表達(dá)及周期性變化研究

李莉1，樓寒梅1，黃麗麗2△

(1.浙江省腫瘤醫(yī)院婦瘤科，杭州 310022；2.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院計劃生育科，杭州 310006)

[摘要]目的研究樹突狀細(xì)胞(DCs)在人正常子宮內(nèi)膜的表達(dá)及周期性變化。方法免疫組織化學(xué)法分別測定CD1a、CD83 陽性細(xì)胞在40例人正常子宮內(nèi)膜的表達(dá)(增生期20例，植入窗期20例)，結(jié)合血清雌二醇(E2)、黃體酮(P)水平，分析DCs表達(dá)水平與E2、P的相關(guān)性。結(jié)果增生期子宮內(nèi)膜CD1a+DCs陽性率為90%(18/20)，植入窗期CD1a+DCs陽性率為100%(20/20)，所有標(biāo)本均未檢測到CD83表達(dá)。DCs數(shù)量隨月經(jīng)周期變化而變化，植入窗期CD1a+DCs細(xì)胞密度為(18.2±5.76 )個/mm2，顯著高于增生期子宮內(nèi)膜CD1a+DCs細(xì)胞密度(6.5±4.05)個/mm2(P<0.05)。子宮內(nèi)膜DCs數(shù)量與血清P水平具有相關(guān)性(r=0.630，P<0.01)。結(jié)論植入窗期子宮內(nèi)膜CD1a+DCs數(shù)量增加可促進(jìn)母胎免疫耐受。

[關(guān)鍵詞]樹突狀細(xì)胞；子宮內(nèi)膜；月經(jīng)周期；CD1a；CD83

樹突狀細(xì)胞(dendritic cells，DCs)作為功能最強(qiáng)大的抗原提呈細(xì)胞，廣泛分布于皮膚、呼吸道、胃腸道、生殖道等多種組織，不僅能夠誘導(dǎo)抗原特異性免疫應(yīng)答，還能誘導(dǎo)免疫耐受。DCs在免疫調(diào)節(jié)中的作用依賴于不同成熟階段DCs的可塑性。不成熟DCs傾向于誘導(dǎo)免疫耐受反應(yīng)，而成熟DCs誘導(dǎo)免疫激活，傾向于引發(fā)免疫排斥反應(yīng)。

母胎免疫耐受及其機(jī)制是長期困擾免疫學(xué)研究的難題。攜帶50%異源遺傳物質(zhì)的胚胎能在“植入窗”期順利著床，不被機(jī)體免疫系統(tǒng)識別及排斥。母胎界面的局部免疫應(yīng)答是母胎免疫耐受建立和維持的關(guān)鍵[1]。既往的研究集中在子宮內(nèi)膜中uNK細(xì)胞和T細(xì)胞等其他免疫細(xì)胞。最新的研究發(fā)現(xiàn)，DCs與母胎免疫耐受機(jī)制密切相關(guān)。由于DCs在子宮內(nèi)膜中數(shù)量較少，而且不易取材，對DCs的研究主要集中在蛻膜。已有研究證實人類蛻膜存在DCs，在抵御病原體入侵及維持正常妊娠中起著重要作用[2-3]。DCs數(shù)量及功能異常與自發(fā)性流產(chǎn)、子癇前期等病理妊娠有關(guān)[3]。本研究采用免疫組織化學(xué)技術(shù)，觀察育齡女性正常子宮內(nèi)膜組織中DCs的分布及其在月經(jīng)周期的不同時期表達(dá)的差異，推測血清雌二醇(E2)、黃體酮(P)對DCs數(shù)量的影響，進(jìn)而探索DCs在母胎免疫耐受中的作用。

1資料與方法

1.1一般資料本研究經(jīng)浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院倫理委員會審核通過，研究對象來源于2013年1～12月浙江大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院門診及住院患者，所有研究對象均已簽署知情同意書。研究對象的納入標(biāo)準(zhǔn)如下：(1)年齡25～35歲；(2)正常規(guī)律的月經(jīng)周期(月經(jīng)周期26～31 d)；(3)生殖系統(tǒng)解剖、內(nèi)分泌指標(biāo)均正常；(4)婦科及盆腔檢查均正常；(5)近3個月內(nèi)無激素類藥物使用史。兩組研究對象的一般臨床資料見表1。

表1　兩組研究對象的一般臨床資料

1.2組織收集(1)植入窗期子宮內(nèi)膜：收集20例因輸卵管切除或丈夫不育行體外受精-胚胎移植治療的婦女子宮內(nèi)膜。于月經(jīng)周期第20～24天行宮腔探查時使用一次性宮腔組織吸管吸取少量子宮內(nèi)膜組織。(2)增生期子宮內(nèi)膜：收集20例因管性不孕行腹腔鏡檢查及美藍(lán)通液婦女的子宮內(nèi)膜。于月經(jīng)周期第6～10天吸取少量子宮內(nèi)膜組織。收集內(nèi)膜標(biāo)本后，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗去標(biāo)本表面血污。立即于10%中性甲醛中固定18～24 h。常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋。4 μm厚連續(xù)切片。常規(guī)蘇木素-伊紅(HE)染色及免疫組織化學(xué)，根據(jù)組織學(xué)檢查按Noyes標(biāo)準(zhǔn)確定分期。同時所有入組女性在取內(nèi)膜當(dāng)日進(jìn)行下列檢查，并根據(jù)以下標(biāo)準(zhǔn)判斷研究對象的子宮內(nèi)膜的期別：月經(jīng)周期天數(shù)；宮頸黏液評分；基礎(chǔ)體溫；盆腔超聲檢測排卵前優(yōu)勢卵泡的直徑和優(yōu)勢卵泡的消失；盆腔超聲檢測子宮內(nèi)膜厚度；血清E2及P水平。

1.3免疫組織化學(xué)采用Envision兩步法免疫組織化學(xué)試劑盒測定CD1a、CD83在人子宮內(nèi)膜的表達(dá)。鼠抗人單克隆IgG抗體CD1a及鼠抗人單克隆IgG抗體CD83購自美國Santa Cruz公司，Envision兩步法免疫組織化學(xué)試劑盒購自丹麥Dako公司。CD1a、CD83一抗工作液濃度為1∶100，染色步驟按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4判斷標(biāo)準(zhǔn)切片置于顯微鏡下觀察，細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜出現(xiàn)棕黃色為陽性。高倍鏡下(×400)觀察切片并拍照,每張切片隨機(jī)選擇10個不重復(fù)視野，計數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)，結(jié)果以細(xì)胞密度表示(個/mm2)。

2結(jié)果

2.1CD1a、CD83在人正常月經(jīng)周期子宮內(nèi)膜中的表達(dá)共收集20例增生期及20例植入窗期正常子宮內(nèi)膜，除2例分泌期子宮內(nèi)膜染色陰性外，其余38例標(biāo)本皆有CD1a陽性細(xì)胞表達(dá)。CD1a陽性細(xì)胞染色為棕黃色，定位于細(xì)胞膜，主要分布于腺體和血管周圍間質(zhì)，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，表面可見長短不一、數(shù)目不等的樹突樣突起(圖1)。植入窗期子宮內(nèi)膜CD1a+CDs細(xì)胞密度為(18.2±5.76)個/mm2，增生期子宮內(nèi)膜CD1a+CDs細(xì)胞密度為(6.5±4.05)個/mm2。CD1a+DC在植入窗期子宮內(nèi)膜的表達(dá)顯著高于增生期(P<0.05)。陽性對照為人正常外陰皮膚組織切片。PBS代替一抗的陰性對照內(nèi)膜組織切片呈CD1a染色陰性。所有標(biāo)本均未檢測到CD83的表達(dá)。見表2。

A：植入窗期子宮內(nèi)膜；B：增生期子宮內(nèi)膜；C：陽性對照(外陰皮膚)；D：陰性對照。

圖1CD1a+DCs在正常人子宮內(nèi)膜的表達(dá)(免疫組織化學(xué)×400)

圖2　子宮內(nèi)膜CD1a+DCs細(xì)胞密度與血清P水平的相關(guān)性

2.2子宮內(nèi)膜DCs表達(dá)與E2、P相關(guān)性分析在月經(jīng)周期的不同時期，子宮內(nèi)膜DCs的表達(dá)水平(平均細(xì)胞密度)與血清P水平有相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)r=0.630，P<0.01,見圖2。DCs的表達(dá)與血清E2水平無明顯相關(guān)性。

表2　子宮內(nèi)膜CD1a+DCs細(xì)胞密度

a：P<0.05，與增生期比較。

3討論

人類子宮是建立和維持正常妊娠的場所，攜帶50%異源遺傳物質(zhì)的胚胎能在植入窗期順利著床并在妊娠期間不被機(jī)體免疫系統(tǒng)識別及排斥。在母體免疫功能正常時，免疫系統(tǒng)既要保護(hù)母體和胎兒不受外來致病微生物侵犯，又要維持免疫耐受。這種母胎免疫平衡是保證正常妊娠的關(guān)鍵。一旦母胎界面免疫耐受出現(xiàn)紊亂，則會導(dǎo)致不孕、自然流產(chǎn)、子癇前期等不良妊娠結(jié)局。關(guān)于DCs在母胎免疫耐受中作用的研究目前還甚少。已有研究發(fā)現(xiàn)，圍植入窗期小鼠子宮內(nèi)膜DCs數(shù)量增加[4]。DCs缺失的轉(zhuǎn)基因小鼠，植入過程受影響導(dǎo)致妊娠率低下，且著床位置的uNK細(xì)胞成熟受抑制[5]，但目前尚未有對人子宮內(nèi)膜DCs在著床過程中作用的研究。本研究發(fā)現(xiàn)人正常子宮內(nèi)膜存在DCs，為未成熟DCs，其數(shù)量隨月經(jīng)周期變化而變化，受卵巢性激素調(diào)節(jié)。植入窗期未成熟DCs數(shù)量增加，推測與保證胚胎順利著床有關(guān)，在母胎免疫耐受的建立和維持過程中起了關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用。

CD1a是目前公認(rèn)的DCs鑒定標(biāo)記，目前一般采用CD1a陽性細(xì)胞數(shù)的多少來反映DCs數(shù)量[6]。CD83是成熟DCs所特有的膜表面分子，是DCs的成熟標(biāo)記物[7]。本研究證實人正常子宮內(nèi)膜組織含有CD1a+DCs,但未觀察到CD83+成熟DCs的表達(dá)，推測靜息狀態(tài)下子宮內(nèi)膜DCs表型為未成熟DCs，這與消化道黏膜、呼吸道黏膜等外周組織中的DCs為未成熟DCs相一致。機(jī)體免疫激活和免疫耐受的關(guān)鍵環(huán)節(jié)是DCs與T細(xì)胞的相互作用。未成熟DCs誘導(dǎo)免疫耐受，不僅參與中樞免疫耐受的誘導(dǎo)，還能在外周參與外周致耐受作用[8]。本研究證實人類子宮內(nèi)膜存在未成熟DCs，推測其參與母胎免疫耐受的建立和維持。

本研究結(jié)果顯示在育齡女性月經(jīng)周期的不同時期(增生期和植入窗期)，其子宮內(nèi)膜DCs的數(shù)量有顯著變化。在植入窗期， CD1a+DCs細(xì)胞數(shù)量明顯增加，其細(xì)胞密度水平與增生期相比有顯著性差異(P<0.05)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，育齡女性正常子宮內(nèi)膜的DCs數(shù)量與血清P水平具有相關(guān)性。推測，性激素(本研究主要是P)對女性子宮內(nèi)膜DCs發(fā)揮了重要的調(diào)節(jié)作用。增生期P處于較低水平，子宮內(nèi)膜的DCs數(shù)量較少，分泌期(植入窗期)P水平迅速增加，相應(yīng)地促進(jìn)子宮內(nèi)膜的DCs數(shù)量也迅速增加。既往的研究發(fā)現(xiàn)性激素動物及人類的DCs均具有重要的免疫調(diào)節(jié)作用。不同濃度的P能使大鼠髓源性DCs表面組織相容性復(fù)合體(MHC)Ⅱ類分子和共刺激分子的表達(dá)顯著下調(diào)，炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生及刺激T細(xì)胞增殖能力也顯著降低[9]。E2和P能顯著抑制小鼠外周血DCs的抗原提呈功能。E2、P能促進(jìn)人外周血來源的DCs產(chǎn)生更多的Th2型細(xì)胞因子IL-10和IL-27，P還能促使DCs分泌的Th1型細(xì)胞因子IL-23減少，Th2型細(xì)胞因子IL-13增加，從而促進(jìn)機(jī)體的免疫應(yīng)答向Th2偏移[10]。上述研究結(jié)果表明性激素對機(jī)體的免疫應(yīng)答發(fā)揮了重要的調(diào)節(jié)作用，其對生殖系統(tǒng)的免疫應(yīng)答，尤其是子宮內(nèi)膜免疫應(yīng)答的結(jié)局具有重要的影響[11]。作者推測育齡女性植入窗期的子宮內(nèi)膜CD1a+DCs數(shù)量增加，通過下調(diào)機(jī)體免疫應(yīng)答從而促進(jìn)胚胎順利著床。這可能涉及以下多種機(jī)制的共同參與。首先，DCs可能通過調(diào)節(jié)Th1/Th2細(xì)胞因子平衡調(diào)節(jié)母胎免疫，Th1/Th2平衡是母胎免疫的關(guān)鍵因素。未成熟DCs不分泌或分泌極少量的Th1型細(xì)胞因子IL-12，但分泌大量的Th2型細(xì)胞因子IL-10，從而促使Th1/Th2細(xì)胞因子平衡向Th2方向偏移，促進(jìn)了母體對半同種異體胚胎抗原的免疫耐受。其次，DCs通過誘導(dǎo)T細(xì)胞無能發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。T細(xì)胞是機(jī)體內(nèi)的主要效應(yīng)細(xì)胞，其活化需要MHC分子、共刺激分子和附屬分子的共同刺激，而未成熟DCs表面低表達(dá)MHC分子、共刺激分子(CD80,CD86)和附屬分子(CD40)，T細(xì)胞不能被有效激活而處于無能或低能狀態(tài)，因此，機(jī)體的免疫排斥不能被有效激發(fā)。未成熟DCs還可通過誘導(dǎo)具有強(qiáng)大免疫抑制能力的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞產(chǎn)生及誘導(dǎo)T細(xì)胞凋亡下調(diào)機(jī)體的免疫應(yīng)答[12-13]。以上是未成熟DCs參與建立母胎免疫耐受的一些可能機(jī)制。深入研究DCs在母胎免疫耐受中的作用，尤其是胚胎植入過程中的免疫學(xué)機(jī)制，有助于了解不孕、自然流產(chǎn)、子癇前期的免疫學(xué)原因，有助于為臨床找到提高體外受精胚胎移植成功率的方法及治療病理妊娠提供依據(jù)，也有助于開發(fā)行之有效的避孕方法。因此對DCs在母胎免疫耐受中的作用及機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。

參考文獻(xiàn)

[1]Erlebacher A.Immunology of the maternal-fetal interface[J].Annu Rev Immunol， 2013，31：387-411.

[2]Qian ZD,Huang LL,Zhu XM.An immunohistochemical study of CD83- and CD1a-positive dendritic cells in the decidua of women with recurrent spontaneous abortion[J].Eur J Med Res,2015,20(1):2.

[3]Laskarin G,K?mmerer U,Rukavina D,et al.Antigen-presenting cells and materno-fetal tolerance:an emerging role for dendritic cells[J].Am J Reprod Immunol,2007,58(3):255-267.

[4]Lee JY,Lee M,Lee SK.Role of endometrial immune cells in implantation[J].Clin Exp Reprod Med,2011,38(3):119-125.

[5]Krey G,Frank P,Shaikly V,et al.In vivo dendritic cell depletion reduces breeding efficiency,affecting implantation and early placental development in mice[J].J Mol Med (Berl),2008,86(9):999-1011.

[6]Cernadas M,Lu J,Watts G,et al.CD1a expression defines an interleukin-12 producing population of human dendritic cells[J].Clin Exp Immunol,2009,155(3):523-533.

[7]Larangé A,Antonios D,Pallardy M.Kerdine-Romer.glucocorticoids inhibit dendritic cell maturation induced by toll-like receptor 7 and toll-like receptor 8[J].J Leukoc Biol,2012,91(1):105-117.

[8]Dudek AM,Martin S,Garg AD.garg and P.agostinis.immature,semi-mature and fully mature dendritic cells:towards a DC-cancer cells interface that augments anticancer immunity [J].Front Immunol，2013，4：438.

[9]Butts CL,Shukair SA,Duncan KM,et al.Progesterone inhibits mature rat dendritic cells in a receptor-mediated fashion[J].Int Immunol,2007,19(3):287-296.

[10]Kyurkchiev D,Ivanova-Todorova E,Hayrabedyan S,et al.Female sex steroid hormones modify some regulatory properties of monocyte-derived dendritic cells[J].Am J Reprod Immunol,2007,58(5):425-433.

[11]Wira CR,Rodriguez-Garcia M,Patel MV.The role of sex hormones in immune protection of the female reproductive tract[J].Nat Rev Immunol,2015,15(4):217-230.

[12]Yamazaki S,Morita A.Dendritic cells in the periphery control antigen-specific natural and induced regulatory T cells[J].Front Immunol,2013,4:151.

[13]Xu X,Yi H,Guo Z,et al.Splenic stroma-educated regulatory dendritic cells induce apoptosis of activated CD4 T cells via Fas ligand-enhanced IFN-γ and nitric oxide[J].J Immunol,2012,188(3):1168-1177.

Study on the endometrial dendritic cells populations during the normal menstrual cycle*

LiLi1，LouHanmei1，HuangLili2△

(1.DepartmentofGynecologicOncology，ZhejiangCancerHospital，Hangzhou,Zhejiang310022，China；2.DepartmentofFamilyPlanning,Women′sHospitalAffiliatetoMedicalCollegeofZhejiangUniversity,Hangzhou,Zhejiang310006，China)

[Abstract]ObjectiveTo investigate the number and distribution of dendritic cells in normal endometrium of reproductive age during the normal menstrual cycle.MethodsNormal endometrial samples were collected from 40 women of reproductive age.20 endometrium samples at the proliferative phase (day 6th to 10th) and 20 endometrium samples at the "window of implantation" (day 20th to 24th) were obtained.These patients underwent intrauterine exploration before IVF and ET resulting from tubal resection or male factor infertility.Endometrial tissue was collected with a pipelle aspirator.Sections were stained with hematoxylin-eosin (HE) to identify the morphological characteristics of endometrial tissues.The Envision two-step immunohistochemical staining technique was used to detect the expression of CD1a and CD83 in the endometrium.Normal human skin and tonsil were used as positive control tissues for CD1a and CD83,respectively.The serum levels of ovarian steroid hormones were measured to analyze their relationship with the expression of CD1a and CD83.ResultsCD1a+ DCs were found in all samples of "window of implantation" and most samples of the proliferative phase (18/20,90%).DCs showed irregular shape with different processes and were buffy in cell membrane,mainly in stroma around grand and blood vessels.The density of CD1a+ DCs at the "window of implantation" were(18.2±5.76)cells/mm2,significantly higher than that at the proliferative phase [(6.5±4.05)cells/mm2,P<0.05].CD83 was considered as the marker for mature DCs.However,immunohistochemistry with specific antibody revealed no CD83+ DCs were found in human emdometrium in the present study.During the menstrual cycle，the expression of CD1a+ DCs in endometrium (the density of CD1a+DCs) correlated with serum progesterone level(r=0.630，P<0.01).Serum estradiol showed no correlation with the density of CD1a+ DCs(P>0.05).ConclusionIncreased CD1a+ immature DCs at the "window of implantation" in endometrium may play an important role in the establishment of maternal-fetal tolerance.

[Key words]dendritic cells；endometrium；menstrual cycle；CD1a；CD83

doi:·論著·10.3969/j.issn.1671-8348.2016.02.001

基金項目：國家自然科學(xué)基金資助項目(81270730)。

作者簡介：李莉(1982-)，主治醫(yī)師，博士，主要從事婦科腫瘤的基礎(chǔ)和臨床研究。 △通訊作者， E-mail：fbhuanglili@163.com。

[中圖分類號]R446.8

[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A

[文章編號]1671-8348(2016)02-0145-03

(收稿日期：2015-08-08修回日期：2015-09-16)