熒光標(biāo)記衍生化-高效液相色譜-質(zhì)譜法檢測(cè)水中醛類(lèi)污染物*

陳　芳，賈立明，蔣智偉，杜英秋，李基明（.黑龍江省環(huán)境監(jiān)測(cè)中心站，黑龍江哈爾濱50056；.農(nóng)業(yè)部谷物及制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心（哈爾濱），黑龍江哈爾濱50056）

?

熒光標(biāo)記衍生化-高效液相色譜-質(zhì)譜法檢測(cè)水中醛類(lèi)污染物*

陳芳1，賈立明1，蔣智偉1，杜英秋2，李基明1
（1.黑龍江省環(huán)境監(jiān)測(cè)中心站，黑龍江哈爾濱150056；2.農(nóng)業(yè)部谷物及制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心（哈爾濱），黑龍江哈爾濱150056）

摘要：建立了使用苯并吖啶酮-5-乙酸酰肼作為衍生試劑結(jié)合高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)地表水中11種醛類(lèi)化合物的分析方法，采用了響應(yīng)面優(yōu)化法對(duì)衍生條件進(jìn)行優(yōu)化。使用標(biāo)準(zhǔn)加入法計(jì)算檢出限，各目標(biāo)物的檢出限范圍為0.21～0.58μg·L-1。測(cè)試了地表水中目標(biāo)物質(zhì)的加標(biāo)回收和精密度，回收率范圍為95.8%～102.7%，RSD范圍為2.06%～3.80%。

關(guān)鍵詞：苯并吖啶酮-5-乙酸酰肼；高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜；衍生化

D

醛類(lèi)化合物廣泛存在于自然界中，因其具有較大的毒性和較高的反應(yīng)活性，在環(huán)境檢測(cè)和食品安全中這類(lèi)化合物含量的測(cè)定越來(lái)越受到人們的重視。目前，醛類(lèi)化合物常規(guī)檢測(cè)方法主要包括分光光度法［1，2］、氣相色譜法（GC）［3］和高效液相色譜法［4,5］。由于醛類(lèi)化合物除了具有較強(qiáng)的揮發(fā)性和反應(yīng)活性，本身還缺乏發(fā)色團(tuán)或熒光團(tuán)，紫外吸收較弱且無(wú)熒光吸收，因此，直接的方法檢測(cè)醛相對(duì)困難。為了解決這個(gè)問(wèn)題，在分析前對(duì)醛類(lèi)化合物進(jìn)行化學(xué)衍生化從而改進(jìn)醛的可檢測(cè)性是一個(gè)較好的方法。目前，許多醛的化學(xué)衍生方案已被報(bào)道［6,7］，所用衍生試劑主要是肼基化合物，通過(guò)酸性條件下的羥醛縮合反應(yīng)生成希夫堿或腙類(lèi)化合物。

盡管測(cè)定醛類(lèi)化合物的報(bào)道很多,但在實(shí)際應(yīng)用中仍存在較多缺陷，如靈敏度低、選擇性差和衍生條件苛刻等。因此，建立一種靈敏度高、選擇性好、廉價(jià)穩(wěn)定的方法仍然是十分必要的。本文使用苯并吖啶酮-5-乙酸酰肼（BAAH）試劑作為柱前衍生化試劑用于醛類(lèi)化合物的檢測(cè)，采用梯度洗脫在BDS-C8柱上實(shí)現(xiàn)了相應(yīng)醛衍生物的完全基線分離。

1　實(shí)驗(yàn)部分

1.1儀器和試劑

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LCMS-8050，日本島津公司），配備大氣壓化學(xué)電離源、自動(dòng)進(jìn)樣器和熒光檢測(cè)器、四元梯度泵、在線真空脫氣機(jī)；色譜柱: VP-ODS色譜柱（150mm×2.0mm.id,5.0μm，日本島津公司）；大氣壓化學(xué)電離源。11種醛標(biāo)準(zhǔn)樣品（糠醛和C1-C10脂肪醛）（美國(guó)，Sigma公司），純水由Milli-Q超純水系統(tǒng)制備，三氯乙酸等其他試劑均為分析純。BAAH為實(shí)驗(yàn)室自制。

1.2標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱(chēng)取適量醛標(biāo)準(zhǔn)品，用色譜純乙腈配成0.01mol·L-1的溶液，相應(yīng)低濃度醛標(biāo)準(zhǔn)液（1.0× 10-4mol·L-1）用色譜純乙腈稀釋而成。稱(chēng)取31.7mg BAAH用色譜純乙腈定容至10mL，濃度為1.0×10-3mol·L-1。

1.3標(biāo)準(zhǔn)品衍生化

向2mL安培瓶中依次加入120μL衍生試劑，20μL混合醛標(biāo)品溶液，20μL三氯乙酸，密封后于52℃水浴中反應(yīng)12min。取出放冷后用乙腈稀釋5倍，直接進(jìn)樣10μL分析。

1.4色譜及質(zhì)譜條件

流動(dòng)相A:5%乙腈；流動(dòng)相B: 100%乙腈。梯度洗脫：0-10min，B由40%至55%，10～25min由55% 至100%（保持5min），流速設(shè)置為1.0mL·min-1，進(jìn)樣量10μL，柱溫設(shè)置30℃。熒光激發(fā)波長(zhǎng)為280nm，發(fā)射波長(zhǎng)分別為510nm。

質(zhì)譜:大氣壓化學(xué)源（APCI），掃描模式：正離子，干燥氣溫度設(shè)置350℃，氣化溫度為450℃，干燥氣流量5.0L·min-1，色譜柱電壓3500V，噴霧壓力413.7kPa。

2　結(jié)果與討論

2.1響應(yīng)面法優(yōu)化衍生化條件

采用Design Expert軟件對(duì)己醛為例的實(shí)驗(yàn)響應(yīng)值數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)式回歸擬合。模型的統(tǒng)計(jì)分析是通過(guò)方差分析（ANOVA）實(shí)現(xiàn)的。多項(xiàng)式模型方程的可靠性由決定系數(shù)R2判斷，方程中各變量對(duì)峰面積影響的顯著性由F檢驗(yàn)來(lái)判定，概率P的值越小，相應(yīng)變量的顯著程度越高。

將實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，結(jié)果顯示所有一次項(xiàng)系數(shù)和二次項(xiàng)系數(shù)對(duì)應(yīng)的P值均小于0.01，R2=0.9873表示實(shí)驗(yàn)值與模型預(yù)測(cè)值之間有高度的相關(guān)性。模型建立的回歸方程能較好的解釋響應(yīng)結(jié)果并預(yù)測(cè)最佳的反應(yīng)條件。變異系數(shù)（C.V.%）值為8.30%表明該模型良好的重現(xiàn)性。

響應(yīng)面曲線可以反映出各變量之間的相互作用關(guān)系并從曲線可確定響應(yīng)值最高時(shí)對(duì)應(yīng)的變量值。分別建立反應(yīng)溫度、試劑摩爾比、反應(yīng)時(shí)間三因素影響峰面積的三維立體響應(yīng)面曲線。每個(gè)圖表示固定一個(gè)變量條件下另兩個(gè)變量對(duì)峰面積的影響。圖1為反應(yīng)溫度與試劑摩爾比之間的相互關(guān)系。

圖1　試劑摩爾比與反應(yīng)溫度對(duì)峰面積影響的響應(yīng)面Fig.1 The response surface of the reaction temperature and the reaction temperature to the peak area

由圖1可知，一定反應(yīng)溫度下，峰面積隨著摩爾比的增加而增大，達(dá)到最大值后變化不明顯。

圖2為反應(yīng)溫度與反應(yīng)時(shí)間的關(guān)系。

圖2　反應(yīng)時(shí)間與反應(yīng)溫度對(duì)峰面積影響的響應(yīng)面Fig.2 Response surface of reaction time and reaction temperature

由圖2可知，一定的反應(yīng)時(shí)間時(shí)，峰面積隨著反應(yīng)溫度升高而增大，52℃時(shí)達(dá)到最大值，之后隨溫度升高而下降。

圖3為摩爾比與反應(yīng)時(shí)間對(duì)峰面積的影響。

圖3　反應(yīng)時(shí)間與試劑摩爾比對(duì)峰面積影響的響應(yīng)面Fig.3 Response surface of the reaction time and themolar ratio of the reagent to the peak area

通過(guò)分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，軟件評(píng)估的各衍生因素的最佳條件分別為反應(yīng)溫度51.8℃，試劑與醛的摩爾比為4.3，反應(yīng)時(shí)間11.3min。在上述最佳條件下預(yù)測(cè)最大峰面積為37500。為了便于操作，選取溫度52℃，摩爾比4.5，反應(yīng)時(shí)間12min，此時(shí)最大峰面積預(yù)測(cè)值為37385。

2.2質(zhì)譜鑒定

采用APCI-MS正離子檢測(cè)模式對(duì)醛衍生物的離子化和離子碎片進(jìn)行了研究。醛衍生物產(chǎn)生了強(qiáng)的［MH］+分子離子峰，分子離子［MH］+通過(guò)碰撞誘導(dǎo)裂解分別產(chǎn)生m/z 246.2，m/z286.3，m/z 301.7和［MH-H2O］+。m/z［MH-H2O］+是鑒定不飽和脂肪酸衍生物的特殊碎片離子。

圖4為方法測(cè)定的總離子流圖。

圖4　標(biāo)準(zhǔn)品總離子流色譜圖Fig.4 Standard product total ion current chromatogram

11種醛衍生物的一級(jí)和二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。

表1　醛類(lèi)衍生物的質(zhì)譜數(shù)據(jù)Tab.1 Derivatives of the mass spectrometry data

圖5是以BAAH-己醛衍生物為例的一級(jí)、二級(jí)質(zhì)譜圖和斷裂模式。

圖5　己醛衍生物質(zhì)譜圖Fig.5 Mass spectra of hexanal derivatives

2.3精密度、準(zhǔn)確度和檢出限

于地表水樣品中添加低濃度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，配置成濃度為10μg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)添加溶液，連續(xù)測(cè)試5次，依據(jù)《環(huán)境監(jiān)測(cè)分析方法標(biāo)準(zhǔn)制修訂技術(shù)導(dǎo)則》（HJ 168-2010）計(jì)算其檢出限。對(duì)30μg·L-1醛類(lèi)衍生物平行6次分析，保留時(shí)間和峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.01%～0.05%和1.16%～1.52%范圍內(nèi)，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2　醛類(lèi)衍生物線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和回收率Tab.2 Derivatives linear regression equation, correlation coefficient, detection limit and recovery

3　結(jié)論

建立了使用BAAH作為衍生試劑結(jié)合HPLC-MS/MS檢測(cè)地表水中十一種醛類(lèi)化合物的分析方法，采用了響應(yīng)面優(yōu)化法對(duì)衍生條件進(jìn)行優(yōu)化。對(duì)色譜分離條件進(jìn)行優(yōu)化并進(jìn)行柱后在線質(zhì)譜鑒定，對(duì)地表水樣品中醛類(lèi)化合物的測(cè)定結(jié)果滿意，該方法具有檢測(cè)限低、線性范圍寬、重現(xiàn)性好、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，完全滿足地表水中醛類(lèi)的快速檢測(cè)和確證應(yīng)用。

參考文獻(xiàn)

［1］Gámiz-Gracia L，Luque de Castro MD.Determination of formaldehyde in liquid，solid and semisolid pharmaceuticals and cosmetics by flow injection-pervaporation［J］.The Analyst，1999，124（7）: 1119-1121.

［2］Zhan XQ，Li DH，Zhu Q Z，Zheng H，Xu J G.Sensitive fluorimetric determination of formaldehyde by the co-quenching effect of formaldehyde and sulfite on the fluorescence of tetra -substituted aminoaluminiumphthalocyanine［J］.The Analyst，2000，125（12）: 2330-2334.

［3］張正竹，宛曉春，陶冠軍.茶鮮葉中糖苷類(lèi)香氣前體的液質(zhì)聯(lián)用分析［J］.茶葉科學(xué)，2005，25（4）:275-281.

［4］R E Zhang，Y L Cao，M W Hearn.Synthesis and application of Fmoc-hydrazine for the quantitative determination of saccharides by reversed-phase high-performance liquid chromatography in the low and subpicomole range［J］.Analytical biochemistry，1991，195 （1）: 160-167.

［5］林彤，段金廒，錢(qián)大瑋，等.HPLC-MS/MS聯(lián)用技術(shù)分析鑒定蘇薄荷中的黃酮類(lèi)成分［J］.中國(guó)天然藥物,2006,4（2）:111-115.

［6］Pal Raktim，Kim Ki-Hyun. Experimental choices for the determinationofcarbonylcompoundsinair［J］.Journalofseparationscience，2007，30（16）: 2708-2718.

［7］Shibamoto T.Analytical methods for trace levels of reactive carbonyl compounds formed in lipid peroxidation systems［J］.Journal ofpharmaceutical and biomedical analysis，2006，41（1）: 12-25.

etection aldehyde pollutants in water by fluorescent tags derivatization -HPLC -mass spectrometry*

CHEN Fang1，JIE Li-ming1，JIANG Zhi-wei1，DU Ying-qiu2，LI Ji-ming1
（1.Heilongjiang Province Environmental Monitoring Centre,Harbin 150056，China；2.Inspection and Testing Center for Quality of Cereals and Their Products（Harbin）, Ministry of Agriculture，Harbin 150056，China）

Abstract：An analytic method was built to detect 11 kinds of aldehyde compounds in surface water. In this method, 2-（12-benzo［b］acridin-5-（12H）-yl）-acetohydrazide was used as derivatization reagent to combine with high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Derivative conditions and chromatographic separation conditions were optimized, after column online mass spectrometry was achieved through response surface methodology. Detection limit was calculated by standard addition method. The LOD range of each target object is 0.21～0.58μg·L-1. We tested standard recovery and precision of target objects in surface water. The range of percent recovery is 95.8%～102.7%. The range of RSD is 2.06%～3.80%.

Key words：2-（12-benzo［b］acridin-5-（12H）-yl）-acetohydrazide；high performance liquid chromatographytandem mass spectrometry；derivatization

中圖分類(lèi)號(hào)：X823

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

DOI：10.16247/j.cnki.23-1171/tq. 20160420

收稿日期：2015-11-23

基金項(xiàng)目：2015年國(guó)家環(huán)境監(jiān)測(cè)與信息（2111101）；水污染綜合防治-跨國(guó)界水體環(huán)境調(diào)查及政策研究

作者簡(jiǎn)介：陳芳（1984-），學(xué)士，工程師，畢業(yè)于中央廣播電視大學(xué)，計(jì)算機(jī)專(zhuān)業(yè)，主要研究方向：環(huán)境監(jiān)測(cè)與評(píng)價(jià)。

通訊作者：賈立明，碩士，工程師，主要研究方向?yàn)榄h(huán)境監(jiān)測(cè)與評(píng)價(jià)。