二甲雙胍對NASH小鼠肝組織NF-κB活性、血清IL-6與轉(zhuǎn)氨酶水平的影響

郭中秋，史治宙，賴康保，廖慶輝，譚婭琴，陳玉華，劉榮火

深圳市龍崗區(qū)人民醫(yī)院內(nèi)分泌科，廣東 深圳 518172

二甲雙胍對NASH小鼠肝組織NF-κB活性、血清IL-6與轉(zhuǎn)氨酶水平的影響

郭中秋，史治宙，賴康保，廖慶輝，譚婭琴，陳玉華，劉榮火

深圳市龍崗區(qū)人民醫(yī)院內(nèi)分泌科，廣東 深圳 518172

目的 觀察二甲雙胍對非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis，NASH)小鼠的肝組織NF-κB活性、血清白介素6(IL-6)表達及轉(zhuǎn)氨酶影響，并探討二甲雙胍防治NASH的可能機制。方法 24只昆明小鼠隨機分為3組:對照組、模型組、治療組。凝膠遷移率變動分析(EMSA)檢測小鼠肝組織NF-κB活性；ELISA法檢測小鼠血清IL-6表達；全自動生化儀檢測小鼠轉(zhuǎn)氨酶水平，了解各組小鼠肝臟損傷情況。結(jié)果 與模型組比較，治療組小鼠肝組織NF-κB活性、血清IL-6和轉(zhuǎn)氨酶水平降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與對照組比較，治療組小鼠肝組織NF-κB活性、血清IL-6和轉(zhuǎn)氨酶水平升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 二甲雙胍能降低NASH小鼠肝組織NF-κB活性、血清IL-6和轉(zhuǎn)氨酶水平。

NF-κB活性；白介素6；脂肪性肝炎；二甲雙胍

脂肪性肝炎是脂肪肝向肝硬化發(fā)展的必然步驟，阻斷和逆轉(zhuǎn)脂肪性肝炎的發(fā)展對預(yù)防肝硬化具有重要意義。NF-κB是炎癥反應(yīng)的中心環(huán)節(jié)，在脂肪性肝病中起重要作用。不少研究[1-3]認為二甲雙胍具有抗炎、防治脂肪肝的作用。也有研究[4]認為二甲雙胍具有防止CCl4對小鼠肝毒性的作用。本文就二甲雙胍對CCl4花生油溶液相關(guān)的非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis，NASH)小鼠肝組織NF-κB活性、血清白介素6(IL-6)及轉(zhuǎn)氨酶水平的影響作一概述。

1 材料與方法

1.1 材料雄性昆明小鼠(由廣東醫(yī)學(xué)院動物中心提供)；CCl4(汕頭市光華化學(xué)廠)；核蛋白提取試劑盒(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)；凝膠遷移率變動分析(EMSA)試劑盒(Promega公司)；γ-32P-ATP(北京亞輝生物技術(shù)公司)；ELISA試劑盒(北京晶美生物工程有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組： 24只昆明小鼠隨機分成3組，每組8只。對照組：正常飲食+皮下注射等量生理鹽水；模型組：正常飲食+5% CCl4花生油溶液0.3 ml/10 g小鼠多點皮下注射，5 d/次。治療組：造模的同時，灌胃給藥鹽酸二甲雙胍200 mg·kg-1·d-1。于第8周斷頭處死各組小鼠，取肝組織檢測NF-κB活性，取血檢測IL-6和轉(zhuǎn)氨酶水平。

1.2.2 EMSA法檢測NF-κB活性：(1)提取及定量核蛋白；(2)探針標記純化；(3)4%非變性聚丙烯酰胺凝膠配制；(4)結(jié)合反應(yīng)；(5)0.5×TBE電泳液，恒壓180 V電泳90 min。剝離膠片，電燈烤干，磷屏曝光20 h。圖像分析軟件BandScan 5.0進行面積灰度分析，計算NF-κB活性值(灰度值)。

1.2.3 ELISA法檢測小鼠血清IL-6水平：小鼠斷頭取血，全血標本室溫放置20 min，于4 ℃離心機2 000×g離心20 min后取上清液。操作按ELISA試劑盒說明書進行，測定IL-6蛋白表達量(本實驗用A值)。

1.2.4 檢測經(jīng)不同處理后各組小鼠的肝功能：各組小鼠斷頭取血后常溫下放置20～30 min，4 ℃離心機3 000×g 離心20 min，上清即為所需血清。采用全自動生化儀測定血清ALT、AST。

2 結(jié)果

2.1 小鼠一般情況各組小鼠均存活，對照組小鼠體質(zhì)量增加，鼠毛健康，安靜，反應(yīng)和活動良好。治療組小鼠體質(zhì)量較對照組增加,反應(yīng)和活動尚可，毛發(fā)等情況明顯比模型組好。模型組小鼠體質(zhì)量增加明顯,少部分小鼠鼠毛蓬亂，對刺激反應(yīng)稍遲鈍。

2.2 NF-кB DNA結(jié)合活性情況NF-κB DNA結(jié)合活性二甲雙胍能抑制NF-κB活性，與模型組相比，治療組小鼠肝組織NF-κB活性降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見圖1、表1)。

圖1 不同處理組小鼠NF-κB活性情況 1：正常組; 2：模型組; 3：治療組

2.3 二甲雙胍對小鼠血清IL-6表達的影響二甲雙胍治療組小鼠血清IL-6濃度與對照組、模型組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見表1)。

2.4 二甲雙胍對小鼠轉(zhuǎn)氨酶的影響二甲雙胍能降低小鼠血清轉(zhuǎn)氨酶水平，治療組與模型組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；治療組與對照組小鼠ALT、AST水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見表1)。

表1 不同處理組小鼠轉(zhuǎn)氨酶、血清IL-6水平和NF-κB活性比較±s)

注：與治療組比較，*P<0.05。

3 討論

脂肪性肝炎是脂肪肝進展為肝硬化不可避免的關(guān)鍵階段，本實驗發(fā)現(xiàn)脂肪性肝炎小鼠肝組織NF-κB活性顯著增強。活化的NF-κB導(dǎo)致IL-6、TNF-α、細胞間黏附分子-1(ICAM-1)、生長因子-β1(TGF-β1)和誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶(iNOS)等下游致炎因子表達增加，而IL-6、TNF-α等炎癥因子升高可反過來促使NF-κB活化，形成惡性循環(huán)，放大肝臟炎癥損傷反應(yīng)。肝細胞和Kupffer細胞等肝內(nèi)細胞出現(xiàn)損傷并產(chǎn)生和釋放炎癥因子。肝星狀細胞(HSC)活化并分泌大量細胞外基質(zhì)，使肝臟原有結(jié)構(gòu)被破壞，形成肝纖維化。阻斷脂肪性肝炎的發(fā)生、發(fā)展對防治肝硬化具有重要意義。

脂肪細胞是IL-6的重要來源。高脂喂養(yǎng)的小鼠IL-6表達可顯著升高[5]；有研究發(fā)現(xiàn)脂肪性肝炎患者血清IL-6水平顯著升高，且與胰島素抵抗程度呈正相關(guān)[6]。還有研究[7]發(fā)現(xiàn)IL-6水平與非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)嚴重程度相關(guān)，在單純性脂肪肝向脂肪性肝炎及肝硬化的啟動、發(fā)生和發(fā)展中起重要作用。IL-6可通過調(diào)控細胞因子信號抑制劑(SOCS-3、SOCS-1和SOCS-6)[8]、抑制IRS-1、GLUT4和PI3K的表達、抑制胰島素依賴的AKT的激活等多種作用機制，促使胰島素抵抗的發(fā)生。在脂肪肝的基礎(chǔ)上，包括IL-6在內(nèi)的細胞因子網(wǎng)絡(luò)能刺激肝細胞產(chǎn)生炎性蛋白參與肝臟炎癥應(yīng)答，胰島素抵抗時炎癥敏感蛋白產(chǎn)生增多，進一步強化炎癥反應(yīng)過程，促進脂肪性肝病的發(fā)展。

二甲雙胍是一種降糖藥物，能通過多種途徑起到保護肝臟的作用[9-10]；研究[1]發(fā)現(xiàn)二甲雙胍通過對NF-κB活化的各個環(huán)節(jié)進行調(diào)控，進而起到調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的作用。還發(fā)現(xiàn)高脂喂養(yǎng)的小鼠經(jīng)二甲雙胍治療后IKK-α在肝和腎組織中的表達增加，NF-κB誘導(dǎo)激酶的表達顯著降低。NF-κB活性下調(diào)能顯著降低TGF-β1、TNF-α、IL-6、IL-1β等炎癥介質(zhì)和髓過氧化物酶的表達[2]。還有研究認為，通過抑制NF-κB的表達，包括TNF-α、IL-6和透明質(zhì)酸、層粘連蛋白和Ⅲ型前膠原也下降，ALT、AST等得到不同程度改善[3]。本實驗發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍處理后小鼠的IL-6水平顯著降低，其機制可能與抑制NF-κB活性相關(guān)。此外，還有研究發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍能分別增強或保持抗炎性細胞因子IL-4和IL-10的表達[12]。

本研究發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍治療組小鼠ALT、AST水平較模型組顯著降低。其機制可能與二甲雙胍通過抑制NF-κB活性，減少炎癥介質(zhì)、細胞因子的產(chǎn)生，減輕小鼠的肝臟脂肪變性和炎癥反應(yīng)有關(guān)[1-3]。因此，二甲雙胍可能具有潛在治療脂肪性肝炎、保護肝臟的作用。NF-κB通路可能是二甲雙胍保護肝臟的重要機制之一。本研究使用的二甲雙胍藥物用量大，應(yīng)對臨床用藥安全進行深入研究，在以后的研究需進一步優(yōu)化設(shè)計，如增加低劑量治療組等。

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(責任編輯：王全楚)

The effect of the Metformin on NF-κB activity of the liver tissue, IL-6 and transaminase levels of the NASH mice

GUO Zhongqiu, SHI Zhizhou, LAI Kangbao, LIAO Qinghui, TAN Yaqin, CHEN Yuhua, LIU Ronghuo

Department of Endocrinology, Longgang District People’s Hospital of Shenzhen, Shenzhen 518172, China

Objective To observe the effect of the Metformin on NF-κB activity of the liver tissue, interleukin-6(IL-6) and transaminase levels of the nonalcoholic steatohepatitis (NASH) mice and to investigate the possible mechanism of Metformin prevention of NASH. Methods Twenty-four mice were divided into 3 groups randomly: normal group, model group and Metformin treatment group. Gel mobility shift assay (EMSA) was used to detect NF-κB activity of the liver tissue; the change of IL-6 was detected by ELISA; the level of the aminopherase was detected by automatic biochemical analyzer. Results The Metformin could reduced the NF-κB activity, IL-6 and aminopherase levels, compared with normal group and model group, there was significantly different (P<0.05). Conclusion Metformin can inhibit the NF-κB activity, IL-6 and aminapherase levels.

NF-κB activity; Interleukin-6; Steatohepatitis; Metformin

10.3969/j.issn.1006-5709.2016.01.024

郭中秋，碩士研究生，研究方向：內(nèi)分泌代謝性疾病。E-mail：guozhongqiu2004@163.com

陳玉華，主任醫(yī)師，研究方向：內(nèi)分泌。E-mail：LRH99mymail@126.com

R575

A

1006-5709(2016)01-0087-03

2014-09-01