槲寄生凝集素抗膽管癌的作用及機(jī)制研究

陜西省友誼醫(yī)院(西安710068)　高旭亮　王佐權(quán)　胡江波　詹俊宏

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槲寄生凝集素抗膽管癌的作用及機(jī)制研究

陜西省友誼醫(yī)院(西安710068)高旭亮王佐權(quán)▲胡江波詹俊宏

摘要目的：研究槲寄生凝集素是否具有抗膽管癌的作用并初步探討其作用機(jī)制。方法：體外培養(yǎng)膽管癌細(xì)胞ICC-9810，根據(jù)培養(yǎng)液中槲寄生凝集素濃度的不同，分為對(duì)照組、1ng/ml組、10ng/ml組、100ng/ml組。干預(yù)48 h后收集標(biāo)本。MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力，并計(jì)算腫瘤抑制率；流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡細(xì)胞比率；Western-blot方法檢測(cè)Bcl-2蛋白表達(dá)情況。結(jié)果：干預(yù)48 h后，各實(shí)驗(yàn)組OD值出現(xiàn)了降低，且隨給藥濃度的增加，OD值逐漸降低，腫瘤抑制率逐漸增高(P<0.05)；凋亡細(xì)胞比率也隨培養(yǎng)液中槲寄生凝集素濃度的增加逐漸升高(P<0.05)；Bcl-2蛋白表達(dá)量也隨給藥濃度的增加而逐漸降低。結(jié)論：槲寄生凝集素能夠在體外抑制ICC-9810細(xì)胞的生長(zhǎng)，并通過(guò)下調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)量而促進(jìn)細(xì)胞的凋亡，而且這種作用隨槲寄生凝集素濃度的增加而加強(qiáng)。

主題詞膽管腫瘤槲寄生細(xì)胞遷移抑制細(xì)胞凋亡

槲寄生是一種古老的中藥，屬桑寄生科，被證明具有抑制肝癌、胰腺癌、肺癌等多種腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用[1-3]。但是，榭寄生是否同樣具有抗膽管細(xì)胞癌的作用，至今尚無(wú)研究表明。為了證明槲寄生同膽管癌的關(guān)系，我們進(jìn)行了以下實(shí)驗(yàn)，現(xiàn)報(bào)道如下。

材料與方法

1材料DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)GIBCO公司，胎牛血清購(gòu)自杭州四季青公司；Hoechst染色液、四甲基偶氮唑鹽(MTT)試劑盒、細(xì)胞質(zhì)蛋白抽提試劑盒和BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)研究所；槲寄生凝集素購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。人肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞系ICC-9810購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。

2細(xì)胞培養(yǎng)將ICC-9810培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素的DMEM培養(yǎng)基中，37℃ 孵箱中培養(yǎng)，隔天傳代。

3分組及干預(yù)情況對(duì)照組：培養(yǎng)ICC-9810細(xì)胞，培養(yǎng)液中加入PBS作為對(duì)照； A組：培養(yǎng)液中加入槲寄生凝集素1 ng/ml；B組：培養(yǎng)液中加入槲寄生凝集素10 ng/ml；C組：培養(yǎng)液中加入槲寄生凝集素100 ng/ml；干預(yù)48 h后，收集細(xì)胞并進(jìn)行檢測(cè)。

4MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期ICC-9810細(xì)胞，按每孔2.5×103個(gè)細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板進(jìn)行分組培養(yǎng)，每孔總反應(yīng)體積為200μl。待細(xì)胞貼壁后換液并根據(jù)分組不同按上述方法給予干預(yù)，干預(yù)48 h后每孔加5 g/L的MTT 20μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，吸凈每孔中液體，再加入100 μl的二甲基亞砜，在37℃的水浴搖床上孵育10 min。待MTT結(jié)晶充分溶解后置酶標(biāo)光度儀測(cè)定各孔在490 nm波長(zhǎng)處吸光度的OD值。

5細(xì)胞抑制率計(jì)算依據(jù)MTT檢測(cè)結(jié)果，通過(guò)以下公式計(jì)算細(xì)胞抑制率：抑制率=(對(duì)照組-實(shí)驗(yàn)組)/對(duì)照組×100%。

6Annexin/PI 法檢測(cè)細(xì)胞凋亡藥物干預(yù)48 h后，消化并收集細(xì)胞，4℃的PBS洗滌兩次，再用250μl結(jié)合緩沖液重懸，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至1×106/ml。吸取細(xì)胞懸液100μl置于5 ml的流式管之中，并加入5μl的Annexin V/FITC和5 μl 20 μg/ml的碘化丙錠溶液；混勻后置于室溫避光孵育15 min；反應(yīng)管中加入400 μl已稀釋好的結(jié)合緩沖液，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，488 nm的氬離子激光器作為光源，PI 發(fā)紅色熒光。

7Western-blot 檢測(cè)Bcl-2蛋白表達(dá)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期 ICC-9810細(xì)胞，將其接種于6孔板，調(diào)整細(xì)胞濃度為每孔1×105，12 h后分別應(yīng)用不同濃度的槲寄生凝集素進(jìn)行干預(yù)，48 h之后終止培養(yǎng)，并收集細(xì)胞提取蛋白，紫外吸收法測(cè)定蛋白濃度。SDS-PAGE分離蛋白后轉(zhuǎn)膜，把轉(zhuǎn)上蛋白的聚偏二氟乙烯(PVDF)膜放于含有5%的脫脂奶粉Tris鹽緩沖液中封閉1h，再TBST 漂洗。分別加入抗人Bcl-2的一抗在4℃ 孵育過(guò)夜，之后TBST漂洗3次，每次10 min。加入相應(yīng)的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫下孵育1h后，漂洗充分，最后采用電化學(xué)發(fā)光法顯像，于暗室中X 射線曝光壓片，再顯影定影，最終得到目的蛋白條帶。 該過(guò)程重復(fù)3次，并選用β-αctin 作為內(nèi)參。結(jié)果應(yīng)用Image-pro Plus 6.0軟件進(jìn)行灰度分析。各實(shí)驗(yàn)組結(jié)果同對(duì)照組的灰度值進(jìn)行比對(duì)，得出相對(duì)于對(duì)照組的倍數(shù)變化情況。

8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法計(jì)量資料通過(guò)均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差的方式表達(dá)，應(yīng)用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。組間比較采用ANOVA的方法進(jìn)行，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1MTT檢測(cè)結(jié)果及腫瘤抑制率對(duì)比干預(yù)48 h后，MTT法檢測(cè)ICC-9810細(xì)胞的OD值，對(duì)照組為0.765±0.098；A組為0.604±0.075；B組為0.413±0.051；C組為：0.233±0.034(圖1)。各組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。計(jì)算各實(shí)驗(yàn)組的腫瘤抑制率，A組的腫瘤抑制率為：21.05%，B組為：46.01%；C組為：69.54%(圖1)。各組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖1　各組MTT值及腫瘤抑制率比較

2槲寄生凝集素對(duì)細(xì)胞凋亡的影響正常狀態(tài)下培養(yǎng)ICC-9810細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)僅有少量細(xì)胞處于凋亡狀態(tài)(7.9%±1.8%)。而培養(yǎng)液中加入槲寄生凝集素后，ICC-9810細(xì)胞的凋亡細(xì)胞比例出現(xiàn)升高，且凋亡細(xì)胞比例隨給藥濃度的增加呈升高趨勢(shì)。其中A組的凋亡細(xì)胞比例為：27.8%±3.96%，B組凋亡細(xì)胞比例為：47.3%±5.46%，C組凋亡細(xì)胞比例為：59.1%±6.38%(圖2)。各組間對(duì)比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖2　流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡情況

3Bcl-2蛋白表達(dá)情況正常狀態(tài)下，ICC-9810細(xì)胞中Bcl-2呈高表達(dá)狀態(tài)，而給予槲寄生生物凝集素后，Bcl-2蛋白表達(dá)出現(xiàn)降低，且蛋白表達(dá)降低程度隨著給藥濃度的增加而呈現(xiàn)出遞減趨勢(shì)(圖3)。對(duì)比各組間灰度變化情況， A組較對(duì)照組灰度變化0.775±0.134倍，B組較對(duì)照組灰度變化0.469±0.068倍， C組灰度較對(duì)照組變化0.181±0.031倍(圖4)。對(duì)比各組間灰度變化情況，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖3　Bcl-2蛋白表達(dá)情況

圖4　較對(duì)照組各組Bcl-2倍數(shù)變化情況

討論

槲寄生是桑寄生科灌木植物的總稱，是一種半寄生的植物。中醫(yī)認(rèn)為槲寄生有祛風(fēng)濕，補(bǔ)肝、補(bǔ)腎、強(qiáng)健筋骨、安胎、養(yǎng)血等作用，被用于風(fēng)濕痹痛，腰膝酸軟、胎動(dòng)不安等癥狀的治療[4]。此外，槲寄生還被發(fā)現(xiàn)具有抗腫瘤作用[5]。其抗腫瘤活性成分包括多糖、植物凝集素、多酚、生物堿等，其中凝集素是表現(xiàn)槲寄生各生物活性的最重要成分，并被用作為抗腫瘤的一種輔助治療藥物[6-9]。英國(guó)衛(wèi)生最近也已經(jīng)通過(guò)將槲寄生提取物作為一種化療藥物應(yīng)用于臨床中?，F(xiàn)在市場(chǎng)上主要有Isorel、Helixor、Iscdor、Eurixor等多種槲寄生提取物制劑[9]。專家預(yù)測(cè)槲寄生也有望成為繼紫杉醇后又一種植物源抗癌藥物[9]。雖然近年來(lái)的研究不斷表明，槲寄生能夠抑制肝癌、胃癌、肺癌、胰腺癌等的生長(zhǎng)[1-3]，但其是否同樣能夠抑制膽管癌的進(jìn)展，尚無(wú)研究表明。我們通過(guò)MTT這一簡(jiǎn)便檢測(cè)細(xì)胞增殖活力的方法，發(fā)現(xiàn)應(yīng)用槲寄生凝集素后，細(xì)胞活力明顯下降，而且隨著給藥濃度的增加進(jìn)一步減低，其腫瘤抑制率也呈遞增趨勢(shì)。這說(shuō)明槲寄生凝集素同樣能夠明顯抑制膽管癌細(xì)胞的增殖。但槲寄生凝集素抗究竟通過(guò)何種途徑抑制了膽管癌細(xì)胞的增殖，我們進(jìn)一步對(duì)細(xì)胞的凋亡進(jìn)行了檢測(cè)。

凋亡是細(xì)胞的一種程序性的死亡，與各種生理及病理刺激所引起的細(xì)胞死亡不同，凋亡在細(xì)胞形態(tài)上特征性表現(xiàn)為以細(xì)胞皺縮繼而細(xì)胞碎片形成，之后被吞噬細(xì)胞所清除[9]。而腫瘤凋亡細(xì)胞比例的增加，直接表現(xiàn)為腫瘤生長(zhǎng)的抑制。我們通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，槲寄生凝集素能夠促進(jìn)ICC-9810細(xì)胞的凋亡細(xì)胞比例增加，而且隨著槲寄生凝集素濃度的增加，凋亡細(xì)胞比例逐漸增加。

微觀層面而言，凋亡的核心是通過(guò)多種信號(hào)通路引起caspase介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)蛋白酶激活，其中線粒體途徑是引起細(xì)胞凋亡的最主要的途徑之一[10]。該途徑在激活過(guò)程中的關(guān)鍵是細(xì)胞色素C釋放到胞漿中，引起caspase 9激活從而啟動(dòng)caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)。而細(xì)胞色素C由線粒體的釋放則由Bcl-2所調(diào)節(jié)。當(dāng)Bcl-2家族決定細(xì)胞將要死亡時(shí)，bax和bak形成聚合體進(jìn)而穿透線粒體外膜導(dǎo)致細(xì)胞色素C及多種其他多種線粒體膜間隙蛋白的釋放[11]。在本研究中我們發(fā)現(xiàn)，槲寄生凝集素能夠下調(diào)Bcl-2蛋白的表達(dá)，且隨給藥濃度的增加其表達(dá)量也逐漸減低。這樣的結(jié)果說(shuō)明槲寄生凝集素是通過(guò)下調(diào)Bcl-2蛋白的表達(dá)從而促進(jìn)ICC-9810的凋亡。

綜上所述，槲寄生凝集素能夠在體外抑制ICC-9810細(xì)胞的增殖，并通過(guò)下調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)途徑而促進(jìn)細(xì)胞的凋亡，而且這種作用隨槲寄生凝集素濃度的增加作用增強(qiáng)。

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(收稿：2015-05-08)

【中圖分類號(hào)】R735.8

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

doi：10.3969/j.issn.1000-7377.2016.02.010