灰樹花液體搖瓶發(fā)酵的關(guān)鍵控制技術(shù)

李　蓉　張金鈺　葉長(zhǎng)文　吳銀華　陳　麗（. 浙江省慶元縣食用菌科學(xué)技術(shù)研究中心，浙江省麗水食用菌技術(shù)創(chuàng)新服務(wù)平臺(tái)，浙江省食用菌工程技術(shù)研究中心，浙江 慶元 33800；. 浙江省慶元縣委統(tǒng)戰(zhàn)部，浙江 麗水 33800）

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灰樹花液體搖瓶發(fā)酵的關(guān)鍵控制技術(shù)

李蓉1張金鈺2葉長(zhǎng)文1吳銀華1陳麗1
（1. 浙江省慶元縣食用菌科學(xué)技術(shù)研究中心，浙江省麗水食用菌技術(shù)創(chuàng)新服務(wù)平臺(tái)，浙江省食用菌工程技術(shù)研究中心，浙江 慶元 323800；2. 浙江省慶元縣委統(tǒng)戰(zhàn)部，浙江 麗水 323800）

關(guān)鍵字灰樹花；液體發(fā)酵；控制技術(shù)

灰樹花具有增強(qiáng)機(jī)體免疫力，抑制腫瘤、病毒，降低血壓等功效。其子實(shí)體可通過(guò)固體栽培獲得，但生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，產(chǎn)量有限，無(wú)法滿足灰樹花深加工產(chǎn)品的加工需求。而液體深層發(fā)酵因不受子實(shí)體栽培季節(jié)的影響，不消耗林木資源，且培養(yǎng)周期短，成本低，產(chǎn)量高，有效成分的含量易于控制，已受到廣泛關(guān)注。

從灰樹花深層發(fā)酵液和菌絲體中提取的多糖，與子實(shí)體中提取的多糖具有同樣的抑制腫瘤、提高機(jī)體免疫功能的作用。游明樂(lè)等研究表明，多種食用真菌液體發(fā)酵產(chǎn)物中的蛋白質(zhì)、氨基酸、核苷類、多糖類及甘露醇等含量遠(yuǎn)高于天然或人工栽培的大型真菌子實(shí)體或菌核[1]。研究液體發(fā)酵法制備灰樹花液體菌絲體對(duì)快速獲取有效成分[2]，加快灰樹花制種速度，提高菌種產(chǎn)量，對(duì)實(shí)現(xiàn)其工廠化生產(chǎn)，加快其在保健、醫(yī)藥等方面開發(fā)利用，促進(jìn)農(nóng)業(yè)、食品、醫(yī)藥工業(yè)的發(fā)展，具有一定的現(xiàn)實(shí)意義。

本文對(duì)灰樹花搖瓶發(fā)酵中的兩個(gè)重要過(guò)程和關(guān)鍵控制因素進(jìn)行探討，旨在為優(yōu)化其液體發(fā)酵提供依據(jù)。

1　液體發(fā)酵培養(yǎng)基制備過(guò)程的關(guān)鍵控制技術(shù)

方維明等采用搖瓶發(fā)酵法對(duì)灰樹花液態(tài)發(fā)酵的碳氮營(yíng)養(yǎng)需求，及發(fā)酵條件對(duì)菌絲體的生物量和多糖產(chǎn)量的影響規(guī)律進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)灰樹花菌絲生長(zhǎng)碳源以葡萄糖、蔗糖、玉米淀粉最佳；酵母粉為發(fā)酵中的最佳氮源，其次為酵母膏、蛋白胨[3]。顧順明研究表明，無(wú)論是生物量還是多糖含量，玉米粉作為碳源時(shí)灰樹花的深層發(fā)酵效果最佳；豆餅粉作為氮源時(shí)菌絲體生物量最高，酵母粉次之；麩皮作為氮源時(shí)菌絲體粗多糖含量最高，蛋白胨、豆餅粉次之[4]。孫克研究了影響灰樹花菌絲體生長(zhǎng)的各營(yíng)養(yǎng)因素主次順序?yàn)榈鞍纂恕⒂衩诐{、葡萄糖、磷酸二氫鉀，綜合考慮灰樹花所需營(yíng)養(yǎng)的最佳組合為葡萄糖3%、蛋白胨0.5%、磷酸二氫鉀0.4%、玉米漿1.5%[5]。卜慶梅等經(jīng)過(guò)液體菌種制備試驗(yàn)、栽培袋制備試驗(yàn)、出菇試驗(yàn)，確定灰樹花液體發(fā)酵的最佳培養(yǎng)基為麥麩5%，玉米粉1%，葡萄糖2%，磷酸二氫鉀0.2%，硫酸鎂0.1%，維生素B10.002%[6]。

綜上所述，灰樹花搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基的制備中碳源、氮源、礦質(zhì)元素的選擇及含量至關(guān)重要。碳作為構(gòu)成細(xì)胞物質(zhì)的主要元素、菌絲體生長(zhǎng)所需的能量來(lái)源，建議選擇葡萄糖、玉米粉。氮作為細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中蛋白質(zhì)和核酸的主要元素，建議選擇蛋白胨或酵母浸出膏。礦質(zhì)磷元素一般在菌絲體生長(zhǎng)、繁殖和代謝活動(dòng)中起著重要的作用。

玉米粉、麥麩有利于灰樹花菌絲球的形成，一般在培養(yǎng)的第3天即有菌絲球形成，第5天菌絲球生物量達(dá)到最大值。但玉米粉、麥麩會(huì)使發(fā)酵后發(fā)酵液粘性增大，菌絲球無(wú)法過(guò)濾，對(duì)測(cè)定菌絲生物量、多糖和蛋白含量有較大影響，作者采用不同含量的玉米粒浸泡進(jìn)行液體發(fā)酵。圖1為玉米粉含量對(duì)―慶灰151‖菌絲生物量的影響。

圖1　玉米粒含量對(duì)―慶灰151‖菌絲生物量的影響

2　發(fā)酵過(guò)程的關(guān)鍵控制技術(shù)

搖瓶發(fā)酵過(guò)程控制包括接種量、發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度、搖瓶轉(zhuǎn)速、搖瓶裝液量、雜菌防控等因素。

2.1接種量

孫金旭等對(duì)灰樹花真菌發(fā)酵條件所做的優(yōu)化研究表明，小接種量不利于菌體的生長(zhǎng)及多糖的產(chǎn)生，隨著接種量的增大，培養(yǎng)10天后的菌體及多糖產(chǎn)量逐漸增加；接種量10%時(shí)，菌體及多糖產(chǎn)量達(dá)到最大，之后，隨接種量增大而降低[7]。楊箐等研究表明，灰樹花最佳種子培養(yǎng)基為馬鈴薯-葡萄糖-蛋白胨培養(yǎng)基，在接種量為10%的條件下進(jìn)行深層發(fā)酵，灰樹花菌絲體干重和胞外多糖的含量分別為5.325 g/L和0.53 g/L[8]。顧順明等以不同接種量對(duì)種子培養(yǎng)基菌絲生物量的影響進(jìn)行研究，結(jié)果表明，100 mL種子培養(yǎng)基中，菌絲生物量隨著接種母種圓餅（6 mm直徑）數(shù)量增加呈增加趨勢(shì)，9個(gè)菌餅時(shí)達(dá)最高。表明灰樹花發(fā)酵時(shí)接種量愈大，菌絲體得率愈高。但從具體可操作性考慮，一般取5%～10%。[4]

2.2發(fā)酵時(shí)間

灰樹花發(fā)酵過(guò)程，前期是菌絲體生長(zhǎng)，之后開始產(chǎn)生多糖，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，多糖產(chǎn)量下降。孫克等研究表明灰樹花發(fā)酵是一個(gè)pH不斷下降的過(guò)程，在一級(jí)種子接入搖瓶后的2天內(nèi)，pH變化持平，對(duì)應(yīng)菌體量的變化也較小。此后3天pH開始穩(wěn)步下降，菌體量也迅速增加。發(fā)酵4天后，菌體香氣濃郁；發(fā)酵5天時(shí)進(jìn)入停滯期，這時(shí)發(fā)酵液的粘度較大，溶氧量下降很快，菌體生長(zhǎng)基本停止，菌體干重達(dá)1.42 g/100mL[5]。雷德柱和于淑娟研究灰樹花菌絲球時(shí)發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵早期菌絲充滿活力，富有彈性，不容易被剪切、刮落，即使被刮落也能迅速恢復(fù)生長(zhǎng)，因此核占菌絲球的體積比較??；發(fā)酵中期，菌絲生長(zhǎng)速度下降，并開始分化，菌絲容易被刮落，菌絲彈性和長(zhǎng)度下降，核占菌絲球的體積比上升；發(fā)酵后期，菌絲高度液泡化，彈性迅速下降，菌絲球變得非常光滑，進(jìn)而從動(dòng)力學(xué)方面初步解釋菌絲球在不同時(shí)期變化的形態(tài)[9]。

2.3發(fā)酵溫度

不同的灰樹花品種菌絲生長(zhǎng)的最適溫度不同，溫度梯度試驗(yàn)研究表明，盡管在最適生長(zhǎng)溫度下菌絲生長(zhǎng)最快，但是菌絲相對(duì)較細(xì)，菌落稀疏；而低于菌絲生長(zhǎng)最適溫度以下2～3 ℃時(shí)，菌絲長(zhǎng)速雖稍慢，但菌絲粗壯，菌落致密。目前已認(rèn)定的3個(gè)灰樹花品種，菌絲發(fā)酵最適溫度：慶灰151、慶灰152為25～31 ℃，小黑汀為22～31 ℃。

2.4搖瓶轉(zhuǎn)速

搖床轉(zhuǎn)速是發(fā)酵過(guò)程的重要參數(shù)，直接影響發(fā)酵基質(zhì)的傳遞速度和溶氧量。崔鳳杰等研究了攪拌轉(zhuǎn)速和通氣量對(duì)灰樹花深層發(fā)酵培養(yǎng)的影響，表明低攪拌轉(zhuǎn)速（60 r/min和80 r/min）下菌球直徑較大，緊密；隨著轉(zhuǎn)速提高，菌球直徑下降并趨于松散，攪拌速度在一定范圍（60～100 r/min）內(nèi)與發(fā)酵液最終粘度呈正相關(guān)[10]。選取不同搖瓶轉(zhuǎn)速（50、100、150、200、250、300 r/min）進(jìn)行發(fā)酵研究，接種后置于25 ℃、裝液量100 mL（500 mL三角瓶）條件下振蕩培養(yǎng)10天，測(cè)定灰樹花菌體及多糖的產(chǎn)量在轉(zhuǎn)速150 r/min下為高。

2.5搖瓶裝液量

搖瓶裝液量是影響發(fā)酵過(guò)程溶氧量的一個(gè)重要因素。孫金旭和顧順明的研究同時(shí)表明500 mL三角瓶中裝液100 mL為搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)灰樹花的適宜裝液量。

2.6雜菌控制

灰樹花發(fā)酵過(guò)程防控雜菌污染也是關(guān)鍵。要做到無(wú)菌接種。同時(shí)，在搖菌過(guò)程中在三角瓶塞上覆蓋一層軟質(zhì)紙后再用橡皮筋固定，可以大大減少雜菌污染幾率。

3　結(jié)　論

灰樹花液體發(fā)酵技術(shù)的應(yīng)用越來(lái)越受到人們的重視，科學(xué)配制發(fā)酵培養(yǎng)基，合理控制發(fā)酵過(guò)程中的接種量、發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度、搖瓶轉(zhuǎn)速、搖瓶裝液量和防止雜菌污染等，是確?；覙浠ㄒ后w發(fā)酵成功的技術(shù)關(guān)鍵。

參考文獻(xiàn)

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“2016最具投資價(jià)值食用菌企業(yè)top10”頒獎(jiǎng)儀式在四川金堂舉行

2016年3月11日，在四川金堂恒大酒店舉行的第三屆四川（金堂）食用菌博覽會(huì)期間，―2016最具投資價(jià)值的食用菌企業(yè)top10‖頒獎(jiǎng)儀式在中國(guó)食品土畜進(jìn)出口商會(huì)食用菌分會(huì)二屆三次會(huì)員擴(kuò)大會(huì)議上舉行，來(lái)自國(guó)內(nèi)外100多人參加見證了此次活動(dòng)。

中國(guó)綠寶集團(tuán)有限公司、北京金珠滿江農(nóng)業(yè)有限公司、天水眾興菌業(yè)科技股份有限公司、福建萬(wàn)辰生物科技股份有限公司、江蘇華綠生物科技股份有限公司、河南景翔生物科技股份有限公司、南通三盛鑫生物科技股份有限公司、湖北裕國(guó)菇業(yè)股份有限公司、安徽中祝農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司、廣東星河生物科技股份有限公司,共10家企業(yè)榮膺―2016最具投資價(jià)值的食用菌企業(yè)top10‖。九州證券有限公司執(zhí)行總經(jīng)理萬(wàn)偉先生，中國(guó)食品土畜進(jìn)出口商會(huì)食用菌分會(huì)秘書長(zhǎng)、易菇網(wǎng)顧問(wèn)劉自強(qiáng)先生，易菇網(wǎng)總裁張升明先生為獲獎(jiǎng)單位頒發(fā)了獎(jiǎng)牌和證書。

為加強(qiáng)食用菌企業(yè)對(duì)資本市場(chǎng)的了解，熟悉資本市場(chǎng)的運(yùn)作，提升公眾對(duì)食用菌上市公司的關(guān)注，易菇網(wǎng)特發(fā)起舉辦此次活動(dòng)，選取近幾年公開報(bào)道在主板市場(chǎng)、創(chuàng)業(yè)板市場(chǎng)、新三板上市食用菌企業(yè)作為評(píng)選對(duì)象，自2016年1月29日至2月18日期間進(jìn)行公眾投票，歷時(shí)21天，此活動(dòng)引起業(yè)內(nèi)人士的廣泛關(guān)注，票選信息在網(wǎng)絡(luò)和手機(jī)媒體中被廣泛傳播，參與投票人數(shù)達(dá)12 509人。

（摘編自2016.3.12《易菇網(wǎng)》http://www.emushroom.net/news/201603/12/25470.html）

中圖分類號(hào)：S646

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B

文章編號(hào)：2095-0934（2016）02-115-03