miR-504在原發(fā)性肝細(xì)胞癌中的表達(dá)及其臨床意義

童　霞　許曉梅　葉　穎　韓建雄

成都市第五人民醫(yī)院消化內(nèi)科(611130)

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miR-504在原發(fā)性肝細(xì)胞癌中的表達(dá)及其臨床意義

童霞*許曉梅葉穎韓建雄

成都市第五人民醫(yī)院消化內(nèi)科(611130)

背景：microRNA表達(dá)失調(diào)與腫瘤的形成相關(guān)。miR-504在多種腫瘤中表達(dá)，但在肝癌中的表達(dá)目前尚未見相關(guān)報(bào)道。目的：探討miR-504在原發(fā)性肝細(xì)胞癌(HCC)和肝癌細(xì)胞株中的表達(dá)及其與預(yù)后的關(guān)系。方法：收集85例HCC患者手術(shù)標(biāo)本，常規(guī)培養(yǎng)5株肝癌細(xì)胞株和永生化肝細(xì)胞株。以CCK8法檢測miR-504表達(dá)對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的影響，實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測miR-504表達(dá)，分析miR-504表達(dá)與HCC患者臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果：與正常肝細(xì)胞相比，5種肝癌細(xì)胞中miR-504表達(dá)顯著降低(P<0.05)。上調(diào)miR-504表達(dá)明顯抑制HepG2細(xì)胞增殖，而下調(diào)miR-504表達(dá)則促進(jìn)細(xì)胞增殖。HCC患者miR-504表達(dá)顯著低于相應(yīng)癌旁組織，且與腫瘤分化程度(P=0.002)、TNM分期(P=0.021)、甲胎蛋白(P=0.012)和門靜脈癌栓(P=0.003)密切相關(guān)，但與患者的性別、年齡、腫瘤大小、腫瘤數(shù)量無關(guān)。miR-504低表達(dá)者的生存時(shí)間較高表達(dá)者明顯縮短(P<0.05)。結(jié)論：miR-504在HCC中表達(dá)下調(diào)，其表達(dá)與患者的臨床預(yù)后相關(guān)，提示miR-504可作為判斷HCC患者預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測因子。

關(guān)鍵詞癌，肝細(xì)胞；miR-504；細(xì)胞增殖；預(yù)后

Expression and Clinical Significance of miR-504 in Primary Hepatocellular Carcinoma

TONGXia,XUXiaomei,YEYing,HANJianxiong.

DepartmentofGastroenterology,ChengduFifthPeople’sHospital,Chengdu(611130)

Background: Dysregulation of microRNA expression is involved in the carcinogenesis of many tumors, expression of miR-504 has been observed in many tumors, but its expression in primary hepatocellular carcinoma (HCC) has not been reported. Aims: To explore the expression and clinical significance of miR-504 in HCC tissues and cells. Methods: Tumor and para-cancerous tissue in 85 HCC patients were collected. Five liver cancer cell lines and immortalized liver cell line were conventionally cultured. Effect of miR-504 expression on HepG2 cells proliferation was determined by CCK8 assay. The expression of miR-504 was determined by real time fluorescent quantitative PCR. Relationships between expression of miR-504 and clinicopathological features and prognosis of HCC patients were analyzed. Results: Compared with normal liver cells, expression of miR-504 was significantly downregulated in five liver cancer cells (P<0.05). Up-regulation of miR-504 inhibited proliferation of HepG2 cells, and down-regulation of miR-504 promoted proliferation of HepG2 cells. miR-504 expression in tumor tissue was significantly decreased than that in corresponding para-cancerous tissue. Expression of miR-504 was correlated with tumor differentiation (P=0.002), TNM stage (P=0.021), alpha fetoprotein (P=0.012) and portal vein tumor thrombus (P=0.003), but not with gender, age, tumor size and tumor number. Survival in HCC patients with lower miR-504 expression was significantly shorter than that in patients with high expression (P<0.05). Conclusions: Expression of miR-504 is downregulated in HCC, and is correlated with the prognosis of patients, suggesting that miR-504 can be used as an independent predictor for prognosis of HCC patients.

Key wordsCarcinoma, Hepatocellular;miR-504;Cell Proliferation;Prognosis

原發(fā)性肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是全球死亡率居前列的惡性腫瘤，亦是我國常見的惡性腫瘤。HCC的發(fā)生、發(fā)展是包括原癌基因激活或(和)抑癌基因失活在內(nèi)的多階段多步驟過程。越來越多的研究表明，除HCC內(nèi)蛋白編碼基因的變異，miRNAs表達(dá)失調(diào)亦會(huì)促進(jìn)HCC的發(fā)生[1-3]。miRNAs是一類長約19～25個(gè)核苷酸的小分子非編碼RNA，進(jìn)化上具有保守性，能以不完全方式與mRNA分子的3’UTR區(qū)結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平上抑制靶基因表達(dá)，在細(xì)胞生長、增殖、發(fā)育和凋亡過程中發(fā)揮重要作用，與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)[4-5]。Kikkawa等[6]發(fā)現(xiàn)，miRNA-504(miR-504)通過靶向CDK6抑制下咽部鱗狀細(xì)胞癌的增殖；Hu等[7]發(fā)現(xiàn)miR-504表達(dá)與p53呈負(fù)相關(guān)，是腫瘤形成中的重要miRNAs；Zhao等[8]發(fā)現(xiàn)miR-504通過下調(diào)核呼吸因子1表達(dá)，導(dǎo)致鼻咽癌放射抵抗。然而，miR-504在HCC中的表達(dá)及其意義目前尚未見相關(guān)報(bào)道。本研究通過檢測HCC細(xì)胞和組織中miR-504表達(dá)，旨在分析其臨床意義，從而為miR-504用于HCC的診斷、治療提供理論依據(jù)。

材料與方法

一、資料來源

收集2009年1年—2011年1月成都市第五人民醫(yī)院肝膽外科行手術(shù)切除的85例HCC患者的腫瘤和癌旁組織標(biāo)本，診斷均由術(shù)后病理學(xué)確診。所有患者均簽署知情同意書，臨床資料完整。術(shù)前均未行放化療、介入治療等抗腫瘤治療。所有患者均接受一般情況、臨床癥狀和影像學(xué)檢查的隨訪，隨訪方式為電話、門診和住院隨訪。隨訪起點(diǎn)為病理確診日期，末次隨訪時(shí)間為2015年7月31日，至末次隨訪時(shí)，存活病例47例，死亡38例，無失訪病例。本研究方案經(jīng)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

二、細(xì)胞培養(yǎng)

永生化正常肝細(xì)胞株L02和5株肝癌細(xì)胞株(HepG2、MHCC97H、MHCC97L、PLC、MHCC-LM3)均購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所。使用含10% FBS的RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)L02細(xì)胞株；5株肝癌細(xì)胞株用含10% FBS的高糖DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)。細(xì)胞置于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

三、細(xì)胞增殖的檢測

采用LipofectamineTM2000(Invitrogen公司)將miR-504 mimics和inhibitor以及陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，以CCK8法(上海碧云天生物技術(shù)公司)檢測細(xì)胞增殖的變化。

四、實(shí)時(shí)熒光定量PCR

提取組織和細(xì)胞中的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。實(shí)時(shí)熒光定量PCR采用2×SYBR Green PCR Master Mix[寶生物工程 (大連) 有限公司]，取適量cDNA作為模板，引物濃度0.4 μmol/L，15 μL體系進(jìn)行擴(kuò)增，每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)平行復(fù)孔。由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成用于特異擴(kuò)增的miRNAs引物，直接使用目標(biāo)miRNAs的成熟序列，參照Sanger miRBase數(shù)據(jù)庫。以U6 snRNA作為內(nèi)參，上實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)儀。miR-504引物上游：5’-AGA CCC TGG TCT GCA CTC TAT C-3’，下游：5’-GCG AGC ACA GAA TTA ATA CGA C-3’；U6引物上游：5’-GCA AGG ATG ACA CGC AAA T-3’，下游：5’-GCG AGC ACA GAA TTA ATA CGA C-3’。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，采用2-△△Ct法計(jì)算基因表達(dá)。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料的比較采用t檢驗(yàn)或方差分析，計(jì)數(shù)資料的比較采用χ2檢驗(yàn)，生存分析采用Kaplan-Meier法。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

一、miR-504在肝癌細(xì)胞株中的表達(dá)

與永生化肝細(xì)胞株L02相比，miR-504在5株肝癌細(xì)胞株中的表達(dá)明顯降低(P<0.05)(圖1)。

*P<0.05

圖1miR-504在永生化肝細(xì)胞株L02和不同肝癌細(xì)胞株中的表達(dá)

二、HepG2細(xì)胞增殖

轉(zhuǎn)染miR-504 mimics后，miR-504表達(dá)上調(diào)了17.89倍，細(xì)胞增殖速度減慢；轉(zhuǎn)染miR-504 inhibitor后，miR-504表達(dá)下調(diào)了80.81%，細(xì)胞增殖加快(圖2)，組間細(xì)胞增殖差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

三、miR-504表達(dá)與HCC預(yù)后的關(guān)系

與癌旁組織相比，HCC組織中miR-504表達(dá)明顯降低(1.00±0.09對(duì)6.74±1.02，P<0.05)。

根據(jù)miR-504表達(dá)情況，將HCC患者分為miR-504高表達(dá)組 (2-△△Ct>1) 和低表達(dá)組 (2-△△Ct≤1)。

**P<0.01

miR-504表達(dá)與腫瘤分化程度(P=0.002)、TNM分期(P=0.021)、甲胎蛋白(P=0.012)和門靜脈癌栓(P=0.003)相關(guān)，而與患者的性別、年齡、HBV、腫瘤大小、肝硬化、腫瘤數(shù)量無關(guān)(表1)。

表1　miR-504表達(dá)與HCC患者臨床病理特征的相關(guān)性(n)

四、miR-504表達(dá)對(duì)患者生存時(shí)間的影響

Kaplan-Meier分析顯示，miR-504高表達(dá)者的生存時(shí)間較低表達(dá)者明顯延長(χ2=27.246，P<0.001)(圖3)。

圖3miR-504表達(dá)與HCC患者生存時(shí)間的關(guān)系(Kaplan-Meier法)

討論

HCC病情進(jìn)展極快，且具有發(fā)病隱匿的特點(diǎn)，多數(shù)患者診斷為HCC時(shí)已出現(xiàn)了肝內(nèi)或肝外轉(zhuǎn)移，從而喪失了接受根治性手術(shù)的機(jī)會(huì)；少部分患者由于早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷并接受及時(shí)治療而獲得了較長的生存時(shí)間[9]。因此，HCC的及時(shí)診斷是決定患者治療效果和生存時(shí)間的重要因素。目前已有多種分子標(biāo)記物用于HCC的診斷，但存在敏感性低、特異性不足的問題，因此尋找敏感性好、特異性高的腫瘤標(biāo)記物是目前肝癌研究領(lǐng)域中迫切需要解決的問題。

miRNAs與人體的生理活動(dòng)和疾病發(fā)生緊密相關(guān)，可作為癌基因或抑癌基因調(diào)控腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[10]。由于miRNAs在不同腫瘤中具有明顯差異的表達(dá)模式，因此有望將其作為腫瘤診斷標(biāo)記物或評(píng)估預(yù)后[11]。目前研究發(fā)現(xiàn)多種miRNAs參與調(diào)節(jié)HCC增殖、凋亡、分化、轉(zhuǎn)移等多種生物學(xué)過程，與HCC的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，這些異常表達(dá)的miRNAs包括miR-1、miR-21、miR-221、miR-222、miR-224、miR-301、let-7a、miR-139a、miR-143、miR-195、miR-26、miR-29和miR-199a/b-3p等[12]。研究報(bào)道m(xù)iR-504可靶向抑制抑癌基因p53[13-14]，提示其具有促癌作用；此外，結(jié)締組織生長因子(CTGF)可明顯下調(diào)miR-504表達(dá)，miR-504通過靶向作用于轉(zhuǎn)錄因子FOXP1促進(jìn)口腔鱗狀細(xì)胞癌的細(xì)胞遷移和侵襲[15]；但miR-504可靶向下調(diào)細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶CDK6，抑制下咽部鱗狀細(xì)胞癌增殖[6]。上述研究結(jié)果差異可能是由于miR-504表達(dá)的時(shí)序性和組織特異性所致。

然而，miR-504在肝癌中的作用及其機(jī)制目前國內(nèi)外尚未見相關(guān)報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)miR-504在HCC細(xì)胞中的表達(dá)顯著下降。上調(diào)miR-504表達(dá)可明顯降低細(xì)胞增殖能力，下調(diào)表達(dá)的作用則相反。為進(jìn)一步驗(yàn)證miR-504在HCC中的表達(dá)和臨床意義，對(duì)85例HCC患者腫瘤組織和癌旁組織中miR-504表達(dá)進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示腫瘤組織中miR-504表達(dá)顯著下調(diào)，且與腫瘤分化程度、TNM分期、甲胎蛋白和門靜脈癌栓密切相關(guān)，但與性別、年齡、HBV、腫瘤大小、肝硬化和腫瘤數(shù)量無關(guān)；miR-504低表達(dá)者的生存時(shí)間較高表達(dá)者明顯縮短。說明miR-504表達(dá)在正常肝臟中發(fā)揮重要作用，并與HCC患者預(yù)后相關(guān)。然而，關(guān)于miR-504在HCC中的生物學(xué)功能及其具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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(2015-08-26收稿；2015-09-19修回)

DOI:10.3969/j.issn.1008-7125.2016.04.003

*Email: 2892615414@qq.com