固相萃取-超高效液相色譜法測定養(yǎng)殖水體中磺胺類抗生素

崔先鋒，胡愛軍，劉伶俐，蔡小玲，皮玉梅，劉依平，何 詠，洪 波

（1.澧縣農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測中心，湖南 澧縣 415500；2.湖南省水產(chǎn)科學研究所，湖南 長沙 410004）

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固相萃取-超高效液相色譜法測定養(yǎng)殖水體中磺胺類抗生素

崔先鋒1，胡愛軍1，劉伶俐2，蔡小玲1，皮玉梅1，劉依平1，何 詠2，洪 波2

（1.澧縣農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測中心，湖南 澧縣 415500；2.湖南省水產(chǎn)科學研究所，湖南 長沙 410004）

摘 要：建立了固相萃取-超高效液相色譜法串聯(lián)測定養(yǎng)殖水體中8種磺胺類抗生素的分析方法。水樣預處理后調(diào)pH值至6.0，以乙腈-二氯甲烷為提取液，添加氯化鈉，以PEP柱與ODS-C18柱進行富集凈化，采用超高效液相色譜進行定性定量分析，結(jié)果表明：8種磺胺類抗生素在水體中的檢出限為0.01～0.03 mg/L，添加回收率為60.0%～89.0%，相對標準偏差為2.52%～7.10%。利用上述方法對不同水庫（網(wǎng)箱）和池塘水樣進行了檢測，水體中磺胺類藥物含量由高到低排序依次為：池塘養(yǎng)殖基地＞無公害養(yǎng)殖池塘＞網(wǎng)箱養(yǎng)殖基地。

關(guān)鍵詞：固相萃??；超高效液相色譜；磺胺類；水體

養(yǎng)殖水體是水生生物的集聚場所，具有生物密度高、組成多樣、水色深、顆粒懸濁物多、抗生素藥物組成復雜等特點。水中抗生素的存在會直接引發(fā)水產(chǎn)品藥物殘留量超標事件，給人們的健康帶來極大的隱患，同時也嚴重影響我國水產(chǎn)品進出口貿(mào)易的發(fā)展[1]。目前，對水體中抗生素藥物的處理能力十分有限，大多采用吸附凈化[2]、化學處理[3]與UV輻照[4]等方法，但上述方法受到水體容量、經(jīng)濟成本、環(huán)境影響等因素的限制難以廣泛推廣。

根據(jù)養(yǎng)殖水體特點，常用的水樣前處理技術(shù)有固相萃取[5]、液液萃取[6]、分散液液微萃取[7]等。相較于其他方法，固相萃取具有簡單、快捷、富集與凈化能力強等特點，已較好應用于水樣中抗生素[8]與農(nóng)藥[9]的測定。該研究將固相萃取技術(shù)和超高效液相色譜法串聯(lián)起來，建立了養(yǎng)殖水體中磺胺類的測定方法，用以解決磺胺類部分組分回收率低以及高效液相色譜儀樣品分析時間過長等問題。

1　材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1主要儀器和試劑 儀器耗材：ACQuity型超高效液相色譜儀 （PDA檢測器，美國Waters公司），20-SPE型固相萃取裝置（美國Agilent公司），ODS-C18柱，PEP柱，PLEXA PCX柱，PRS柱。藥品試劑：乙腈（色譜純），乙酸乙酯（色譜純），二氯甲烷（色譜純），環(huán)己烷（色譜純），甲醇（色譜純），氯化鈉（分析純），2%乙酸緩沖液。

1.1.2標準物質(zhì) 磺胺嘧啶（SD）、磺胺噻唑（ST）、磺胺甲基嘧啶（SM1）、磺胺二甲基嘧啶（SM2）、磺胺甲基異噁唑（SMZ）、磺胺多辛（SDM）、磺胺異噁唑（SIZ）、磺胺喹噁啉（SQ）均購于國家標準物質(zhì)研究中心，純度均大于98.0%。

1.2試驗方法

1.2.1樣品采集、預處理 分別采集多個代表性的池塘養(yǎng)殖用水，用5 L清潔的玻璃瓶混勻后低溫保存。試驗前將水樣用溶劑過濾器過濾。

1.2.2固相萃取條件優(yōu)化 （1）pH值。由于磺胺類藥物在不同酸堿度條件下其結(jié)構(gòu)存在較大差異，在經(jīng)過多種組合比較后，分別將水樣pH值調(diào)節(jié)為4.5、6.0、7.0、8.0、10.0，比較不同pH值條件下水樣中磺胺類藥物的提取率。（2）提取液。根據(jù)養(yǎng)殖水體中磺胺類抗生素的特性，分別選取提取液Ⅰ（乙腈＋乙酸乙酯=20＋40 mL）和提取液Ⅱ（乙腈＋二氯甲烷=20＋40 mL）作為提取溶劑，比較兩種提取液的萃取效果。（3）氯化鈉用量。取3份100 mL空白水樣，分別添加0、5、10 g氯化鈉，加入一定量混合標準溶液，比較不同氯化鈉添加量對水樣中磺胺類藥物添加回收率的影響。（4）萃取柱。分別采用PEP柱、Plexa柱、ODS-C18柱、PRS柱4款凈化柱進行萃取試驗，比較不同萃取柱對水樣中磺胺類藥物的回收效果。

1.2.3樣品處理 量取100 mL待測水樣，調(diào)節(jié)pH值，轉(zhuǎn)移至250 mL分液漏斗中，添加提取液和氯化鈉，混搖2 min，靜置分層；用雞心瓶收集下層有機混合相；再加入提取液重復提取1次，合并兩次的萃取液，于40℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，用5 mL甲醇溶液（5%）溶解瓶內(nèi)殘留物。以5 mL的甲醇活化萃取柱，將樣液轉(zhuǎn)移至柱中，用3 mL甲醇溶液復溶瓶內(nèi)殘留物，液體一并轉(zhuǎn)移至柱中；整個固相萃取過程流速控制在1 mL/min，待柱內(nèi)近干時用15 mL甲醇洗脫串聯(lián)柱；洗脫液于40℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，用流動相溶解過濾，待超高效液相色譜檢測。

1.2.4色譜檢測條件 色譜柱：BEH–C18柱（150 mm×4.6 mm，2.1 μm）；檢測波長：270 nm；色譜柱溫：35℃；進樣體積：10 μL。流動相梯度洗脫條件見表1。

表1　梯度洗脫條件

1.2.5方法鑒定 以最優(yōu)固相萃取條件對8種磺胺類藥物的混合標準溶液進行測定分析，考察方法的檢出限和精密度。

1.2.6方法應用 采集了長沙地區(qū)網(wǎng)箱養(yǎng)殖基地、池塘養(yǎng)殖基地、無公害養(yǎng)殖池塘3種不同類型養(yǎng)殖水域的4個水樣，按該研究建立的方法進行檢測分析。

2　結(jié)果與討論

2.1pH值的確定

由表2可知，磺胺二甲基嘧啶在pH值為4.5時提取率最高，磺胺喹噁啉在pH值為6.0和10.0時均有較高的提取率，其余6種磺胺物質(zhì)提取的最適pH值均為6.0。因此，綜合考慮以6.0作為試驗水樣的提取pH值，水樣中各磺胺類藥物的提取率均在60%以上。

表2　不同pH值對水樣中磺胺類藥物提取率的影響 （%）

2.2提取液的選擇

對比兩種提取液發(fā)現(xiàn)，提取液Ⅰ中乙酸乙酯會出現(xiàn)在液體的上層影響提取液的收集，同時由于乙酸乙酯只能從乙腈與水樣的混合液中反萃取少量的乙腈也影響提取效率；而采用提取液Ⅱ進行提取時，二氯甲烷能從乙腈水溶液中反萃取乙腈后出現(xiàn)在液體的下層，方便萃取液的收集和再次萃取，樣品分析圖譜中無溶劑峰和基質(zhì)干擾峰影響，提取效率較高。故而選用乙腈+二氯甲烷作為前處理的最佳提取液。使用時，先添加20 mL乙腈，與水樣混勻，再加入20 mL二氯甲烷，萃取1次之后，再加入20 mL二氯甲烷重復提取1次；合并兩次萃取液，進行下一步操作。

2.3氯化鈉用量選擇

Cu2+、Fe3+、Zn2+、Mg2+等金屬離子大量存在時會影響目標化合物的回收率，而適量的Cl-能結(jié)合部分金屬離子，有利于提高樣品的回收率。結(jié)果顯示，不添加氯化鈉時，二氯甲烷層會出現(xiàn)渾濁，樣品的回收率為20.3%～40.2%；添加5 g氯化鈉時，二氯甲烷與乙腈混合液和水相分層清晰，有機相透亮，樣品的回收率為70.6%～90.4%；添加10 g氯化鈉時，高濃度的鹽溶液與有機相分界面上出現(xiàn)少量的氯化鈉顆粒物，且上層的水相與分液漏斗接觸面會形成大量的氣泡影響分層效果及回收率，試驗回收率僅在65%上下。因此，添加5 g氯化鈉最為適宜。

2.4固相萃取柱的選擇

磺胺類化合物大多為弱極性， PEP柱、Plexa柱、ODS-C18柱、PRS柱4款凈化柱均有一定富集能力。從表3中可以看出，磺胺噻唑和磺胺喹噁啉采用PEP柱凈化時回收效率最高，其他6種磺胺類藥物的凈化效果均以O(shè)DS-C18柱的最好，回收率在61%以上。因此，選用PEP與ODS-C18串聯(lián)柱形式進行樣品凈化效果最理想，如圖1所示，減少了樣品基質(zhì)的干擾，提高了方法的靈敏度，保證高效回收。

圖1　PEP柱串聯(lián)ODS-C18柱凈化的樣品圖譜（1∶ SD； 2∶ST； 3∶ SM1； 4∶ SM2； 5∶ SMZ； 6∶ SDM； 7∶ SIZ； 8∶ SQ）

表3　不同固相萃取柱對養(yǎng)殖水體中磺胺類的回收率（%，n=3）

2.5標準曲線的制作、檢出限、精密度及回收率

從表4中可以看出，8種磺胺類藥物的檢出限為0.01～0.03 mg/L。方法的精密度、回收率試驗結(jié)果如表5所示，采用試驗優(yōu)化的方法進行測定，8種磺胺類藥物的平均回收率為73%，平均相對標準偏差（RSD）為4.24%，能滿足實驗室對養(yǎng)殖水體磺胺類殘留物檢測技術(shù)的要求。

表4　線性方程、相關(guān)系數(shù)及線性范圍（S/N=3）

表5　8種磺胺類藥物的回收率試驗（n=3）

2.6水和土壤環(huán)境樣品的測定

由表6可知，不同區(qū)域養(yǎng)殖水域內(nèi)磺胺類抗生素的總含量在0.25～20.26 mg/L之間，由高到低排序依次為池塘養(yǎng)殖基地＞無公害養(yǎng)殖池塘＞網(wǎng)箱養(yǎng)殖基地2＞網(wǎng)箱養(yǎng)殖基地1。這樣的結(jié)果與養(yǎng)殖水域的面積、餌料用量、養(yǎng)殖密度、水體交換與自凈能力等因素有關(guān)。普通池塘養(yǎng)殖基地因施用含抗生素的餌料和藥物，使水樣中抗生素含量較高；無公害養(yǎng)殖池塘能規(guī)范餌料與藥物的用量，較好地控制了水體中抗生素的含量。網(wǎng)箱養(yǎng)殖基地不以單一的投喂方式作為餌料來源，自然供給也能為養(yǎng)殖生物提供食物補充；同時，由于單位面積內(nèi)水體的交換頻率高、物種密度低、治療類抗生素用量少，所以水體中抗生素含量較低；其中，網(wǎng)箱養(yǎng)殖基地1較網(wǎng)箱養(yǎng)殖基地2水域面積更大、自然水源補給更充裕，故其水體中抗生素含量更低。

表6　不同養(yǎng)殖區(qū)域內(nèi)磺胺類抗生素含量

3　結(jié) 論

研究建立了養(yǎng)殖水體中8種磺胺類抗生素殘留物的超高效液相色譜檢測方法。實踐表明，該方法簡便可行、準確快速、回收率較高，能滿足實驗室對養(yǎng)殖水體磺胺類殘留物新檢測技術(shù)的要求。

采用固相萃取-高效液相色譜法測定養(yǎng)殖水體中8種磺胺類殘留量，以乙腈-二氯甲烷為提取劑，提取后殘留雜質(zhì)較少，提取效率高；以PEP柱與ODS-C18柱進行富集凈化，有效地提高了磺胺類藥物檢測方法的靈敏度，除磺胺甲基異噁唑與磺胺多辛未完全分離外，其余組分均較好地分離，樣品圖譜峰形對稱，組分重現(xiàn)性好；調(diào)節(jié)pH值至6.0，引入氯化鈉增強液液萃取效率，極大地促進了樣品的處理效果。該方法中8種磺胺類抗生素的添加回收率為60.0%～89.0%，檢出限為0.01～0.03 mg/L，適用于養(yǎng)殖水體中磺胺類藥物多組分殘留的分析測定。

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（責任編輯：成 平）

Determination of Sulfonamide Antibiotics in Aquaculture Water by Solid-phase Extraction and Ultra Performance Liquid Chromatography

CUI Xian-feng1，HU Ai-jun1，LIU Ling-li2，CAI Xiao-ling2，PI Yu-mei1，LIU Yi-ping1，HE Yong2，HONG Bo2
（1. Agricultural Products Quality and Safety Testing Center of Lixian County， Lixian 415500， PRC；2. Fisheries Research Institute of Hunan Province， Changsha 410153， PRC）

Abstract：An analytical method was developed for the determination 8 kinds of sulfona mides antibiotics in aquaculture water. Adjusting pH value to 6.0, using acetonitrile - methylene chloride as extracting liquid, after adding sodium chloride, the pretreatment water sample was purified and concentrated by PEP and ODS-C18 after pretreatment， then qualitative and quantitative analysis were performed by UPLC. The results showed that the detective limitation values for 5 sulfona mides antibiotics in aquaculture water were obtained from 0.01 mg/L to 0.03 mg/L respectively, the recoveries were 60.0%-89.0% for water samples, and the relative standard deviation were 2.52%-7.10%. Taking above-mentioned method, sulfonamide antibiotics content in different reservoir (net cage) and the pond water sample were detected. The experimental results confirmed that sulfonamide antibiotics content were arranged form high to low as follows: aquaculture pond, pollution-free aquaculture pond and net cage culture pond.

Key words：solid phase extraction; ultra performance liquid chromatography; sulfonamides; water

通訊作者：洪 波

作者簡介：崔先鋒（1976-），男，湖南澧縣縣人，助理水產(chǎn)工程師，主要從事農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測工作。

收稿日期：2016-02-25

DOI:10.16498/j.cnki.hnnykx.2016.04.025

中圖分類號：S949

文獻標識碼：A

文章編號：1006-060X（2016）04-0083-04