青枯菌侵染不同抗病煙草品種的防御性酶活性及代謝組分差異分析

周星洋， 張功營， 董麗紅， 楊恩蘭， 萬樹青

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院/天然農(nóng)藥與化學(xué)生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 廣東 廣州 510642)

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青枯菌侵染不同抗病煙草品種的防御性酶活性及代謝組分差異分析

周星洋， 張功營， 董麗紅， 楊恩蘭， 萬樹青

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院/天然農(nóng)藥與化學(xué)生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 廣東 廣州 510642)

摘要：【目的】為煙草抗病育種和抗性鑒定提供生化代謝指標(biāo)?！痉椒ā坎捎们o部注射法對(duì)抗病品種粵煙97和感病品種長脖黃接種青枯雷爾菌Ralstonia solanacearum，并采用比色法和GC-MS法分別進(jìn)行相關(guān)防御性酶活性及代謝物質(zhì)的測(cè)定?！窘Y(jié)果】抗病品種粵煙97的PAL、SOD、POD、PPO活性，接菌組與對(duì)照組均分別高于感病品種長脖黃的接菌組與對(duì)照組；抗病品種粵煙97和感病品種長脖黃分別在接菌后第7天和第5天，PAL活性高于對(duì)照組，其余時(shí)間酶活性接菌組均低于對(duì)照組；抗病品種粵煙97和感病品種長脖黃在受青枯雷爾菌侵染前期，SOD、POD、PPO酶活性均提高，隨著時(shí)間延長酶活性均低于對(duì)照組。POD和PPO同工酶凝膠電泳表明：抗病品種粵煙97同工酶類型多于感病品種長脖黃；接菌后第3天，粵煙97的同工酶譜帶寬度與色度增強(qiáng)，而長脖黃無增強(qiáng)現(xiàn)象。說明抗病品種能快速應(yīng)對(duì)外界刺激，加速相關(guān)抗病物質(zhì)的形成。代謝物檢測(cè)表明：抗病品種粵煙97接菌組中肌肉肌醇、煙堿、蘋果酸、L-蘇氨酸等物質(zhì)的相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)高于對(duì)照組，而感病品種長脖黃接菌組中這些物質(zhì)均低于對(duì)照組，反映品種間抗青枯病能力的強(qiáng)弱可能與上述物質(zhì)有關(guān)。 【結(jié)論】煙草不同抗病品種葉片中PAL、SOD、POD、PPO酶活性的高低，以及上述代謝物質(zhì)含量的變化，可作為反映煙草抗青枯病的生化指標(biāo)。

關(guān)鍵詞：煙草； 青枯雷爾菌； 防御性酶； 酶活性； 同工酶； 代謝組分

煙草青枯病是一種由青枯雷爾菌Ralstoniasolanacearum引起的系統(tǒng)性侵染病害，現(xiàn)已成為世界各產(chǎn)煙區(qū)最主要的病害之一[1]。該病在我國河南、山東、江蘇、云南、廣西、廣東、福建等地普遍發(fā)生，煙株一旦染病，往往整株死亡，其危害是毀滅性的，給生產(chǎn)造成重大經(jīng)濟(jì)損失[2]。因此，研究青枯菌致病機(jī)理和尋找有效的防治青枯病的方法是當(dāng)前植物病理學(xué)研究的重要課題之一,其中抗病育種防治青枯病的生化機(jī)制最為重要。國內(nèi)外學(xué)者對(duì)大量的相關(guān)病害進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)植物在受病害侵襲過程中表現(xiàn)出一系列復(fù)雜的生理生化變化，包括體內(nèi)代謝的變化、細(xì)胞內(nèi)活性氧的積累與清除、抗病信號(hào)的產(chǎn)生與轉(zhuǎn)導(dǎo)、防衛(wèi)反應(yīng)的表達(dá)與調(diào)控等[3-4]。在這一復(fù)雜過程中，一些與植物抗病性相關(guān)的酶類起著很重要的調(diào)控作用[5-6]，如苯丙氨酸解氨酶(Phenylalanine ammonium lyase, PAL)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)、過氧化物酶(Peroxidase，POD)和多酚氧化酶(Polyphenol oxidase，PPO)等。同工酶譜分析作為一種認(rèn)識(shí)基因存在和表達(dá)的工具已被大量運(yùn)用于種質(zhì)分類與種間遺傳差異分析[7-9]，其規(guī)律性變化可以作為一種早期的鑒別手段，用來研究植物的抗病性問題。因此，筆者選擇了2個(gè)不同抗性的煙草品種，進(jìn)行青枯病菌的接種試驗(yàn)，在接菌后不同時(shí)段及時(shí)采樣，測(cè)定與病程相關(guān)的防御性酶活性以及代謝組分，從而了解煙草抗、感青枯病的變化過程，旨為煙草抗青枯病育種提供生化方面的依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

試驗(yàn)所用煙草品種：高度感病品種長脖黃及高度抗病品種粵煙97，均由廣東南雄煙草科學(xué)研究所提供；煙草青枯雷爾菌由廣東省農(nóng)科院何自福研究員惠贈(zèng)；病菌的保存與增殖參照匡傳富等[10]的方法。

儀器：LRH型生化培養(yǎng)箱(廣東省韶關(guān)市鑫騰科普有限公司)；FC—18R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(廈門儀達(dá)儀器有限公司)；DYCZ-24DN型垂直電泳槽(北京六一儀器廠)；DYY 11B三恒電泳儀(北京六一儀器廠)；10 μL微量進(jìn)量器(德國Eppendorf AG)；UV-8500PC型紫外-可見分光光度計(jì)(上海天美科學(xué)儀器公司)；1702-MP8型電子天平(德國Startorius公司)；島津GC-MS Q2010 Ultra(日本Shimadzu公司)。

1.2試驗(yàn)方法

選取長勢(shì)一致、3～4葉齡的健康煙草植株供試，將其移栽至裝有滅菌土的18 cm×23 cm的塑料盆中，每個(gè)處理為5株，設(shè)置3個(gè)重復(fù)，放置于室外環(huán)境下。待煙苗生長7 d后，接菌組參照黎定軍等[11]莖部注射法，用注射器將1 mL青枯雷爾菌液(5×108cfu·mL-1)從葉腋處注入煙莖基部的維管束里，并在接菌處注意保濕，對(duì)照組為清水處理的煙苗。分別在處理1、 3、 5、 7、 9、 11 d后，取同一葉位處的煙葉進(jìn)行相關(guān)生化指標(biāo)的測(cè)定，其中代謝組分差異分析選擇接菌后的第3天進(jìn)行。

1.2.1防御性酶活性測(cè)定PAL的提取及活性測(cè)定參照薛應(yīng)龍等[12]方法；SOD的提取與測(cè)定參照鄒琦[13]163-165的方法；POD的提取與測(cè)定參照張志良[14]的方法；PPO的提取與活性測(cè)定參照李靖等[15]的方法。PAL以每分鐘D290nm變化0.01所需要的酶量定義為1個(gè)酶活性單位(U)；POD和PPO分別以每分鐘D470 nm、D410 nm變化1.00所需要的酶量定義為1個(gè)酶活性單位(U)；SOD以每分鐘D560nm抑制50 % 所需要的酶量定義為1個(gè)酶活性單位(U)。

1.2.2POD和PPO同工酶電泳酶液制備: 取 0.1 g 樣品，加入 0.1 mol·L-1預(yù)冷的 Tris-HCl (pH 6.8) 緩沖液 1.5 mL，冰浴研磨，12 000 r·min-1、4 ℃條件下離心15 min，取上清液，于-70 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

電泳：采用不連續(xù)的聚丙烯酰胺凝膠垂直板電泳技術(shù)[13]131-135，上樣緩沖液不加 SDS 和β-巰基乙醇，電極緩沖液為pH 8.3 的 Tris-Gly 緩沖液，樣品不經(jīng)加熱處理。同工酶電泳采用聚丙烯酰胺為7.5% 的分離膠、4%的濃縮膠。樣品上樣量為 10 μL[V(樣品緩沖液)∶V(粗酶液)=1∶1]，于 4 ℃ 條件下電泳，濃縮膠80 V、電泳30 min，分離膠120 V、電泳1.5 h。以溴酚藍(lán)作指示劑，電泳結(jié)束后，取下膠進(jìn)行染色。

POD同工酶染色： 稱取0.1 g聯(lián)苯胺，加少量無水乙醇溶解，依次加入5 mol·L-1的醋酸溶液10 mL，1.5 mol·L-1的醋酸鈉溶液10 mL，水70 mL，最后加入3～5滴質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%的過氧化氫溶液。 將凝膠電泳膠帶放入裝有染色液的塑料小盆中，并輕輕晃動(dòng)，待條帶清晰后，立即用相機(jī)拍照記錄。

PPO同工酶染色：3份質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%鄰苯二酚溶液，1份0.05 mol·L-1磷酸緩沖液(pH6.8)，1份質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.06%對(duì)苯二胺溶液，混合均勻后，將膠帶放入染色液中3～5 min，即可見到棕紅色的多酚氧化酶酶帶。

1.2.3代謝組分差異分析煙草樣品前處理方法：參考Tikunov等[16]和Roessner等[17]建立的方法。

氣相色譜條件：進(jìn)樣口溫度250 ℃。升溫程序：初始溫度50 ℃，保持1 min，以5 ℃·min-1升溫速度升到150 ℃保持2 min，最后以10 ℃·min-1升溫速度升到250 ℃，保持10 min。以高純氦氣(體積分?jǐn)?shù)大于 99.999%)為載氣采用不分流進(jìn)樣方式，進(jìn)樣量1 μL，載氣流速1 mL·min-1。

質(zhì)譜條件：電子轟擊源(EI)，離子源溫度200 ℃，四極桿溫度150 ℃，接口溫度250 ℃，電子能量70 eV，溶劑延遲時(shí)間4 min；調(diào)諧方式為標(biāo)準(zhǔn)調(diào)諧，質(zhì)譜掃描方式為全掃描，掃描范圍為50～500 aum。使用NIST 2011譜庫進(jìn)行圖譜檢索。

1.3數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2003和SPSS11.5數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，酶活性數(shù)值均為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。應(yīng)用Duncan’s新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性分析。

2結(jié)果與分析

2.1幾種防御性酶活性變化

2.1.1PAL活性變化從圖1可知，抗病品種粵煙97的PAL活性在整個(gè)測(cè)定時(shí)期，接菌組與對(duì)照組均高于感病品種長脖黃?？共∑贩N粵煙97在接菌后第7 天酶活性顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，其余時(shí)間酶活性均低于對(duì)照組；感病品種長脖黃在接菌后第5 天，PAL活性顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，其余時(shí)間酶活性均低于對(duì)照組。

相同時(shí)間同一煙草品種不同柱子上方凡是有一個(gè)相同小寫字母者，表示該品種對(duì)照組和接菌組間差異不顯著 (P>0.05，Duncan’s法)。

圖1不同抗病煙草品種接種青枯雷爾菌后葉片PAL活性(以鮮質(zhì)量計(jì))的變化

Fig.1Changes of PAL activities (based on fresh mass) in leaves of resistant and susceptible tobacco cultivars after inoculation of Ralstonia solanacearum

2.1.2SOD活性變化從圖2可知，抗病品種粵煙97的SOD活性在整個(gè)測(cè)定時(shí)期，接菌組與對(duì)照組均高于感病品種長脖黃?？共∑贩N粵煙97在接菌后第3、 5、 7、 9 天，SOD活性均高于對(duì)照組，其中第7 天差異顯著(P<0.05)；感病品種長脖黃在接菌后第1、 3、 5 天，SOD活性均高于對(duì)照組，其中第5天差異顯著(P<0.05)。由此得知，抗、感品種在受到青枯菌侵害后，均能使SOD迅速被激活，從而起到清除或阻止病原菌所造成傷害的作用。

相同時(shí)間同一煙草品種不同柱子上方凡是有一個(gè)相同小寫字母者，表示該品種對(duì)照組和接菌組間差異不顯著 (P>0.05，Duncan’s法)。

圖2不同抗病煙草品種接種青枯雷爾菌后SOD活性(以鮮質(zhì)量計(jì))的變化

Fig.2Changes of SOD activities (based on fresh mass) in leaves of resistant and susceptible tobacco cultivars after inoculation of Ralstonia solanacearum

2.1.3POD活性變化從圖3可知，抗病品種粵煙97的POD活性在整個(gè)測(cè)定時(shí)期，接菌組與對(duì)照組均高于感病品種長脖黃?？共∑贩N粵煙97在接菌后第3 天，酶活性顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，其余時(shí)間酶活性均顯著低于對(duì)照組(P<0.05)；感病品種長脖黃在接菌后第3、 5 天，酶活性高于對(duì)照組，其中第5天差異顯著(P<0.05)，其余時(shí)間POD活性均低于對(duì)照組。

相同時(shí)間同一煙草品種不同柱子上方凡是有一個(gè)相同小寫字母者，表示該品種對(duì)照組和接菌組間差異不顯著 (P>0.05，Duncan’s法)。

圖3不同抗病煙草品種接種青枯雷爾菌后POD活性(以鮮質(zhì)量計(jì))的變化

Fig.3Changes of POD activities (based on fresh mass) in leaves of resistant and susceptible tobacco cultivars after inoculation of Ralstonia solanacearum

2.1.4PPO活性變化從圖4可知，抗病品種粵煙97對(duì)照組、接菌組的PPO活性均高于感病品種長脖黃的。接菌后第3 天，粵煙97和長脖黃的PPO活性略高于各自的對(duì)照組，其余時(shí)間均低于各自的對(duì)照組。

2.2接菌處理對(duì)不同品種煙草葉片中 POD 和 PPO 同工酶表達(dá)的影響

2.2.1對(duì)POD同工酶的影響從圖5A可看出，抗病品種粵煙97接菌后，整個(gè)測(cè)定期間POD同工酶譜帶未增加，但凝膠電泳譜帶寬度與色度均發(fā)生變化。接菌后第3 天，接菌組的同工酶譜帶較對(duì)照組譜帶寬，且顏色較深；接菌后第1、 11 天，接菌組POD同工酶譜帶色度比對(duì)照組弱；接菌后第5 天，接菌組POD同工酶譜帶條數(shù)比對(duì)照組少，且部分條帶顏色較淺；接菌后第7、 9 天，接菌組與對(duì)照組POD同工酶譜帶無明顯差異。從圖5B可看出，感病品種長脖黃在接菌后第1、 5、 7、 9天，接菌組POD同工酶譜帶顏色均比對(duì)照組顏色淺；接菌后第3、 11 天，同工酶譜帶寬度和顏色與對(duì)照基本無差別。對(duì)比圖5 A、圖5 B可知，抗病品種粵煙97的POD同工酶譜帶為6條，感病品種長脖黃的POD同工酶譜帶為2條，說明抗病品種粵煙97的POD同工酶類型多于感病品種長脖黃的POD同工酶類型。

相同時(shí)間同一煙草品種不同柱子上方凡是有一個(gè)相同小寫字母者，表示該品種對(duì)照組和接菌組間差異不顯著(P>0.05，Duncan’s法)。

圖4不同抗病煙草品種接種青枯雷爾菌后PPO活性(以鮮質(zhì)量計(jì))的變化

Fig.4Changes of PPO activities (based on fresh mass) in leaves of resistant and susceptible tobacco cultivars after inoculation of Ralstonia solanacearum

CK：對(duì)照組，TR：接菌組； A： 抗病品種粵煙97，B： 感病品種長脖黃。

圖5不同抗病煙草品種接種青枯雷爾菌后葉片POD同工酶譜帶

Fig.5Electrophoretic isoenzyme patterns of POD in leaves of resistant and susceptible tobacco cultivars after inoculation of Ralstonia solanacearum

2.2.2對(duì)PPO同工酶的影響從圖6A可以看出，抗病品種粵煙97接菌后第1、 7天，接菌組與對(duì)照組的PPO同工酶譜帶無明顯差異；接菌后第3天，PPO同工酶譜帶寬度與色度均高于對(duì)照組；接菌后第5天，PPO同工酶譜條帶數(shù)與色度均低于對(duì)照組；接菌后第9、 11天， 部分PPO同工酶譜帶色度略低于對(duì)照組。從圖6B可以看出，感病品種長脖黃接菌后第1、 9、 11天， PPO同工酶譜帶條數(shù)、色度與對(duì)照組無明顯差異；接菌后第3天，PPO同工酶譜帶色度均低于對(duì)照組；接菌后第5和7天，PPO同工酶譜帶色度略高于對(duì)照組。對(duì)比圖6 A、圖6 B可知，抗病品種粵煙97的PPO同工酶譜帶最多為6條，最少為4條，感病品種長脖黃的POD同工酶譜帶為2條，說明抗病品種粵煙97的PPO同工酶類型多于感病品種長脖黃的PPO同工酶類型。

CK:對(duì)照組,TR：接菌組；A：抗病品種粵煙97, B： 感病品種長脖黃。

圖6不同抗病煙草品種接種青枯雷爾菌后葉片PPO同工酶譜帶

Fig.6Electrophoretic isoenzyme patterns of PPO in leaves of resistant and susceptible tobacco cultivars after inoculation of Ralstonia solanacearum

2.3代謝組分差異分析

對(duì)不同抗病品種接菌處理后葉片提取物進(jìn)行GC-MS測(cè)定,得到總離子流圖(圖7)。從圖7可以直觀地看出不同抗病品種間存在明顯差異，接菌組與對(duì)照組間，峰的數(shù)量和強(qiáng)度也都存在差異。

通過島津質(zhì)譜工作站對(duì)總離子流圖的處理解析,峰面積歸一化法測(cè)量了各組分的百分含量。通過檢索和解析初步分離最多確定了70個(gè)化合物。鑒定的各組分及相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)見表1。

1：感病品種長脖黃對(duì)照組；2：感病品種長脖黃接菌組；3：抗病品種粵煙97對(duì)照組；4：抗病品種粵煙97接菌組。

圖7不同抗病煙草品種接種青枯雷爾菌后代謝組分的GS-MS總離子流圖

Fig.7Total ion chromatograms of metabolites of resistant and susceptible tobacco cultivars after inoculation of Ralstonia solanacearum

表1不同抗病煙草品種接種青枯雷爾菌后品種間代謝物差異比較1)

Tab.1Comparison of metabolites from resistant and susceptible tobacco cultivars after inoculation of Ralstonia solanacearum

序號(hào)t保留/min代謝物名稱相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)/%長脖黃對(duì)照組長脖黃接菌組粵煙97對(duì)照組粵煙97接菌組17.362硼酸………0.0629.377乳酸0.580.370.420.61310.108L-纈氨酸…0.65…0.27411.725草酸1.031.270.480.89512.118L-亮氨酸…0.26……612.691L-異亮氨酸…0.41…0.19713.571丙二酸…0.09…0.17813.892L-正纈氨酸…0.08……915.173絲氨酸1.150.680.842.861015.3082-氨基乙醇…0.10……1115.756甘油1.03………1215.772磷酸…0.972.513.661316.196L-蘇氨酸1.390.790.732.631416.432甘氨酸…0.120.16…1516.639丁二酸0.170.04…0.071617.330甘油酸0.160.050.711.411717.421煙堿6.935.381.884.071817.775壬酸………0.071919.153L-甲硫氨酸…0.08……2019.645L-天冬氨酸…0.140.190.362121.4552-哌啶羧酸………0.362221.568蘋果酸8.614.294.169.792322.288L-吡咯烷酮-5-羧酸1.971.170.704.562422.360赤蘚糖醇…0.08…0.122522.5394-氨基丁酸……1.63…2622.833L-苯丙氨酸0.912.01…0.882723.3584-羥基苯乙胺…0.32……2823.504十二烷醇…0.32……2923.992L-蘇糖酸1.940.773.1416.67

續(xù)表1 Tab.1 continued序號(hào)保留時(shí)間/min代謝物名稱相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)/%長脖黃對(duì)照組長脖黃接菌組粵煙97對(duì)照組粵煙97接菌組3024.223正十六烷………0.103124.432戊酸……1.911.523225.137L-谷氨酸0.391.090.840.723326.190L-天冬酰胺…0.631.740.243426.567碘十六烷0.10………3526.618D-來蘇糖1.940.180.110.133626.918核糖醇0.250.150.100.193727.276D-鼠李糖0.100.07…0.093827.334木糖醇………0.163927.540十四烷醇…0.16…0.104027.608L-阿拉伯糖…0.060.100.144127.669D-赤蘚糖0.390.080.350.274227.848核糖酸………0.124328.145D-葡萄糖醇…0.09……4428.567莽草酸0.15…0.070.084528.634酒石酸0.160.06……4628.730檸檬酸0.480.480.160.364728.965N-乙酰-L-賴氨酸…0.06……4829.157腺嘌呤…0.05……4929.578β-D-果糖0.550.361.572.025029.653阿拉伯糖醇0.170.08……5129.714а-D-果糖0.360.191.081.405229.826D-甘露糖……0.170.325329.832鯊肌醇0.260.15……5429.906D-(+)-塔羅糖0.680.581.842.655529.952L-賴氨酸…0.310.21…5630.120阿洛糖0.13…0.270.485730.160L-酪氨酸0.121.120.26…5830.391D-甘露醇0.260.090.620.275930.874D-木糖…0.07…0.426030.978順式-9-十六碳烯酸………0.046131.204棕櫚酸1.891.050.480.736231.229D-葡萄糖酸…0.08……6332.069肌肉肌醇10.110.9911.9022.176432.353D-半乳糖0.11……0.216532.981五羥基己醛0.38…0.12…6633.033色氨酸…0.11……6733.226硬脂酸1.650.720.360.456835.185D-甘露糖酸0.460.08…0.106935.242D-甘油-D-古洛糖-庚酸0.40………7037.256D-纖維二糖0.17………

1) 長脖黃為感病品種，粵煙97為抗病品種；“…”表示未檢測(cè)到。

從表1可以看出煙株被青枯雷爾菌侵染后代謝物差異較為明顯，粵煙97接菌后煙葉樣本中代謝物相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)高于其對(duì)照組，且長脖黃接菌后相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)低于其對(duì)照組的是乳酸、甘油酸、肌肉肌醇、L-蘇糖酸、蘋果酸、L-吡咯烷酮-5-羧酸、煙堿、絲氨酸、L-蘇氨酸、D-來蘇糖、核糖醇、β-D-果糖、D-(+)-塔羅糖、棕櫚酸、硬脂酸，說明煙草抗青枯病能力的強(qiáng)弱可能與這些物質(zhì)有關(guān)，或者與參與形成上述代謝物的酶活性有關(guān)；2個(gè)不同抗病品種接菌后共同產(chǎn)生或者相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)比對(duì)照增高的物質(zhì)分別為：L-纈氨酸、草酸、L-異亮氨酸、丙二酸、磷酸、L-天冬氨酸、赤蘚糖醇、L-苯丙氨酸、十四烷醇、L-阿拉伯糖、D-木糖，不同抗病品種煙草在受到青枯雷爾菌侵襲時(shí)均會(huì)刺激體內(nèi)代謝物含量的改變，其含量的增高說明上述代謝物可能參與抗病相關(guān)物質(zhì)的形成。

3討論與結(jié)論

與植物抗病相關(guān)的PAL、SOD、PPO和POD均屬于植物防衛(wèi)系統(tǒng)相關(guān)酶，因此可作為植物抗病的生化指標(biāo)。在植物體內(nèi)，PAL是苯丙烷類代謝途徑的關(guān)鍵酶和限速酶，催化L-苯丙氨酸解氨生成反式肉桂酸(合成各種酚類及木質(zhì)素的前體物質(zhì))，因而調(diào)控與植物抗病有關(guān)的酚類物質(zhì)和木質(zhì)素在植物體中的合成和積累[18]。研究表明，PAL活性與植物抗病性呈正相關(guān)[15, 19]。本研究中，在整個(gè)測(cè)定期間，抗病品種粵煙97的PAL活性均高于感病品種長脖黃，說明煙草品種抗病強(qiáng)弱，與體內(nèi)PAL活性呈正相關(guān)。SOD作為植物體內(nèi)活性氧清除系統(tǒng)重要保護(hù)酶之一，能清除超氧化物陰離子自由基，提高植物抗逆性[20]。本研究表明，抗病品種粵煙97在接菌后第3、 5、 7、 9 天，SOD活性均大于對(duì)照，感病品種長脖黃在接菌后第1、 3、 5 天，SOD活性均高于對(duì)照，抗病品種SOD活性在接菌組與對(duì)照組中均高于感病品種，說明在青枯雷爾菌侵染后抗病品種可高效地清除活性氧的傷害，感病品種由于本身SOD活性低，接菌后酶活性增長幅度較小而使其受到傷害。POD是一種應(yīng)激酶，其活性與植物抗病性有著密切的關(guān)系，在活性氧的清除和維持植物體內(nèi)活性氧的正常水平中起作用；POD 還能催化木質(zhì)素合成，木質(zhì)化的細(xì)胞壁機(jī)械性能加強(qiáng)，不透水氣，阻止?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)、水分、色素等的擴(kuò)散，使病原菌無法獲得營養(yǎng)而死亡[21-22]。研究表明，POD活性與植物的抗病性具有正相關(guān)關(guān)系[23-26]。PPO是一類廣泛分布于植物體內(nèi)的質(zhì)體金屬酶，能直接以O(shè)2為氧化底物將酚氧化成醌，從而抑制病蟲害的侵襲。PPO不僅參與酚類物質(zhì)的氧化，同時(shí)也參與木質(zhì)素的形成[27]。本研究發(fā)現(xiàn)抗病品種粵煙97的POD活性高于感病品種長脖黃，且POD同工酶譜分析表明，抗病品種粵煙97的譜帶條數(shù)均要多于感病品種長脖黃。接菌后抗病品種的POD活性迅速升高，而感病品種則較弱，2品種的POD活性隨著時(shí)間延長均降低，說明青枯雷爾菌侵染煙草后均能刺激體內(nèi)POD活性的提高，且抗病品種總體強(qiáng)于感病品種。抗病品種粵煙97和感病品種長脖黃接菌后第3 天，PPO活性略高于對(duì)照組，隨著時(shí)間延長酶活性均降低?？共∑贩N粵煙97中PPO活性高于感病品種長脖黃，可能與其抗病性強(qiáng)有關(guān)。

煙草植株受到病菌侵染時(shí)，引起相關(guān)酶活性的改變，繼而引起植株體內(nèi)代謝物質(zhì)的改變，形成的代謝物本身具有抗病作用或者進(jìn)一步通過轉(zhuǎn)化形成與抗病有關(guān)的次級(jí)代謝物。例如PAL酶活性高低會(huì)影響L-苯丙氨酸含量[28]，POD酶活性影響某些糖類、氨基酸類等與木質(zhì)素合成有關(guān)物質(zhì)的含量[29]。本研究發(fā)現(xiàn)，粵煙97與長脖黃在接菌處理3 d時(shí)，SOD、POD、PPO活性均比對(duì)照高，而PAL活性均低于對(duì)照組，因此植株體內(nèi)相關(guān)酶催化形成的物質(zhì)應(yīng)該有所提高，或者酶促反應(yīng)的底物應(yīng)該有所降低。代謝物檢測(cè)表明，2個(gè)抗病性不同的品種接菌后共同產(chǎn)生或者相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)相比對(duì)照增高的物質(zhì)分別為：L-纈氨酸、草酸、L-異亮氨酸、丙二酸、磷酸、L-天冬氨酸、赤蘚糖醇、L-苯丙氨酸、十四烷醇、L-阿拉伯糖、D-木糖，說明此類代謝物含量的變化可能與防御性酶活性有關(guān)；粵煙97接菌后煙葉樣本中代謝物相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)高于其對(duì)照組，但長脖黃接菌后相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)低于其對(duì)照組的物質(zhì)分別為：乳酸、甘油酸、肌肉肌醇、L-蘇糖酸、蘋果酸、L-吡咯烷酮-5-羧酸、煙堿、絲氨酸、L-蘇氨酸 、D-來蘇糖、核糖醇、β-D-果糖、D-(+)-塔羅糖、棕櫚酸、硬脂酸，說明此類代謝物含量的變化與防御性酶活性變化無關(guān)，可能與其他酶活性變化有關(guān)。研究表明，肌醇在植物體內(nèi)通過自身氧化途徑可以代謝為與植物細(xì)胞壁合成息息相關(guān)的多糖，從而提高植物抗病性[30]。煙堿作為一種防御性物質(zhì)，在煙草受到病蟲害侵襲時(shí)會(huì)刺激體內(nèi)產(chǎn)生大量煙堿[31]，此外，相關(guān)研究表明，在細(xì)胞質(zhì)中蘋果酸酶催化蘋果酸脫羧形成的丙酮酸參與莽草酸途徑，進(jìn)一步形成丙酮酸族氨基酸和一些與防御反應(yīng)有關(guān)的次生代謝物質(zhì)[32]。L-蘇糖酸作為L-抗壞血酸的一種降解產(chǎn)物，廣泛存在于植物體內(nèi)，其含量的增加，說明抗壞血酸積極參與抗氧化作用，保護(hù)機(jī)體免于自由基的威脅[33]。不同煙草品種抗青枯病的機(jī)理，不僅與其體內(nèi)防御性酶活性有關(guān)，可能還與某些代謝物或與其相關(guān)的酶活性變化有關(guān)。

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【責(zé)任編輯柴焰,莊延】

Differences of defensive enzyme activities and metabolites between resistant and susceptible tobacco cultivars infected by Ralstonia solanacearum

ZHOU Xingyang, ZHANG Gongying, DONG Lihong, YANG Enlan, WAN Shuqing

(College of Agriculture, South China Agricultural University/Key Laboratory of Natural Pesticide and Chemical Biology,Ministry of Education, Guangzhou 510642, China)

Abstract：【Objective】 In order to provide the biochemical and metabolic basis of tobacco breeding for disease resistance and resistance identification. 【Method】Resistant (Yueyan 97) and susceptible (Changbohuang) tobacco cultivars were inoculated with Ralstonia solanacearum by trunk injection. Defensive enzyme activities and metabolites were measured by using colorimetric method and GC-MS.【Result】The activities of phenylanine ammonia lyase (PAL), superoxide dismutase (SOD), peroxidase (POD) and polyphenol oxidase (PPO) in the resistant cultivar ‘Yueyan 97’ were higher than those in the susceptible cultivar ‘Changbohuang’ with the same inoculation treatment. The PAL activities of Yueyan 97 and Changbohuang were higher than that in control on the seventh and fifth days after inoculation, respectively. The PAL activities of both cultivars were lower compared to control at any other time. For both cultivars, SOD, POD and PPO activities increased compared to control in the earlier days, but were lower compared to control during the later time period. The types of POD and PPO isozymes in the resistant cultivar ‘Yueyan 97’ were higher than those in the susceptible cultivar ‘Changbohuang’. The width and color of isozyme bands of Yueyan 97 were enhanced at 3 d after inoculation, while those of Changbohuang were not enhanced. It suggested that the resistant cultivar could quickly respond to external stimuli and accelerate the formation of defense-related substances. Detection of metabolites showed that the relative contents of some substances in Yueyan 97 such as myo-inositol, nicotine, malic acid, and L-threonine were higher compared to control, but in Changbohuang were lower compared to control, suggesting that cultivar differences in resistance against R. solanacearum might be related to these substances.【Conclusion】 These four defensive enzyme activities and the contents of the above metabolites could be used as biochemical indexes for evaluating tobacco resistance against R. solanacearum.

Key words：tobacco； Ralstonia solanacearum； defensive enzyme； enzyme activity； isozyme；metabolite

中圖分類號(hào)：S432.42

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1001- 411X(2016)03- 0073- 09

基金項(xiàng)目：廣東省煙草專賣局(公司)科技項(xiàng)目(粵煙[2009]17號(hào))

作者簡(jiǎn)介：周星洋(1989—)，男，碩士研究生， E-mail: 569056710@qq.com；通信作者：萬樹青(1953—)，男，教授，博士，E-mail: wanshuqing@scau.edu.cn

收稿日期：2015- 09- 24優(yōu)先出版時(shí)間：2016-04-15

優(yōu)先出版網(wǎng)址：http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1110.s.20160415.1555.026.html

周星洋， 張功營， 董麗紅，等.青枯菌侵染不同抗病煙草品種的防御性酶活性及代謝組分差異分析[J].華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2016,37(3):73- 81.