豬偽狂犬病病毒新流行株主要糖蛋白的分子特征分析

向柯宇， 潘　慧， 吉藝寬， 王　雨， 張寶石， 羅永文， 琚春梅

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院/廣東省動(dòng)物源性人獸共患病預(yù)防與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510642)

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豬偽狂犬病病毒新流行株主要糖蛋白的分子特征分析

向柯宇， 潘慧， 吉藝寬， 王雨， 張寶石， 羅永文， 琚春梅

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院/廣東省動(dòng)物源性人獸共患病預(yù)防與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510642)

摘要：【目的】進(jìn)一步了解豬偽狂犬病毒新流行株的遺傳特征?！痉椒ā繉?duì)從安徽某豬場(chǎng)分離的1株豬偽狂犬病病毒(PRV)AH株進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析及主要糖蛋白gB、gC、gD、gE的序列分析?！窘Y(jié)果】PRV AH株與國(guó)內(nèi)2011年以來(lái)的流行毒株非常相似，但與Bartha株及其他國(guó)外毒株遺傳關(guān)系較遠(yuǎn)；國(guó)內(nèi)流行毒株與Bartha株及其他國(guó)外毒株相比，其主要糖蛋白均存在明顯的連續(xù)氨基酸的缺失和插入，且部分突變位點(diǎn)位于這些糖蛋白的重要功能區(qū)。【結(jié)論】從分子水平上解析了PRV新流行株與疫苗株Bartha株的遺傳差異，為進(jìn)一步深入研究Bartha株疫苗免疫失敗的原因提供了理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：偽狂犬病病毒； 新流行株； 糖蛋白； 分子特征

偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)屬皰疹病毒科，α皰疹病毒亞科，對(duì)世界養(yǎng)豬業(yè)危害巨大。疫苗免疫是防控豬偽狂犬病的重要措施。在我國(guó)，許多豬場(chǎng)采用Bartha株疫苗預(yù)防豬偽狂犬病且取得了顯著效果，但自2011年以來(lái)，許多Bartha株疫苗免疫豬場(chǎng)重新爆發(fā)了豬偽狂犬病疫情[1]。將新流行株接種Bartha株疫苗免疫的豬和羊，結(jié)果顯示豬和羊均發(fā)病，表明Bartha株疫苗對(duì)新毒株不能提供完全保護(hù)[1-5]。

偽狂犬病毒的糖蛋白不僅在病毒的侵入、釋放以及細(xì)胞間擴(kuò)散等過程中起重要作用，而且也是參與機(jī)體免疫反應(yīng)的主要靶蛋白[6]。因此，對(duì)這些糖蛋白進(jìn)行深入分析有助于了解新毒株的致病性及免疫原性。本研究在成功分離豬偽狂犬病毒新流行株的基礎(chǔ)上，對(duì)其進(jìn)行了遺傳進(jìn)化分析及主要糖蛋白gB、gC、gD、gE的序列分析，以期從分子水平上解析現(xiàn)階段豬偽狂犬病疫情爆發(fā)的可能原因。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1病料和細(xì)胞病料采自安徽某豬場(chǎng)流產(chǎn)胎兒的腦組織，經(jīng)PCR檢測(cè)為PRVgE陽(yáng)性。PK-15細(xì)胞由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)微生物學(xué)與免疫學(xué)教研室保存。

1.1.2試劑LATaq酶、DNA Marker、瓊脂糖、pMD18-T載體均為TaKaRa公司產(chǎn)品，DMEM培養(yǎng)液為Gibco公司產(chǎn)品，胎牛血清為Hyclone公司產(chǎn)品。

1.1.3試驗(yàn)動(dòng)物5周齡的雌性昆明小鼠購(gòu)自南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2方法

1.2.1病毒的分離將病料在DMEM中充分研磨后，于4 ℃ 條件下6 800 r·min-1離心15 min，收集上清液。將上清液用0.22 μm的濾器過濾，接種至PK-15單層細(xì)胞中，觀察到細(xì)胞出現(xiàn)明顯病變時(shí)，將細(xì)胞反復(fù)凍融3次后收集病毒，通過PCR鑒定病毒。

1.2.2致病性試驗(yàn)將30只5周齡的昆明小鼠分成6組，分別接種 10-1、10-2、10-3、10-4稀釋度的PRV AH病毒液100 μL，另外2組分別接種未稀釋的病毒液100 μL作陽(yáng)性對(duì)照和 DMEM 100 μL作陰性對(duì)照，每天對(duì)小鼠的臨床癥狀和死亡情況進(jìn)行觀察，最后計(jì)算出病毒的LD50。

1.2.3引物設(shè)計(jì)參照GenBank發(fā)布的PRV序列(GI:32187339)設(shè)計(jì)4對(duì)引物分別擴(kuò)增PRVgB、gC、gD、gE基因序列，引物由生工生物工程股份有限公司合成。

1.2.4PCR擴(kuò)增用LATaq酶擴(kuò)增gB、gC、gD、gE4段基因序列，其引物見表1。

表1擴(kuò)增主要糖蛋白基因的引物序列

Tab.1Primer sequences of genes encoding the major glycoproteins

基因上游引物(5'→3')下游引物(5'→3')gBCCGCTGTTCTTCTTGCTGGTGCGTCAGT-GAGTTgCGGGGGGCCATTCGCAGCGGGGGCGTCACAGgDGCCATGCTGCTCGCACTGCGGAGGCTACGGgEGGGGTTGAGACCAT-GCGGCGGTTCTCCCGGTATT-TA

PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性45 s，退火溫度條件下 45 s，72 ℃延伸2 min，循環(huán)30次；72 ℃末次延伸10 min，4 ℃保存。gB、gC、gD、gE基因的PCR擴(kuò)增最適退火溫度分別為：50、56、58、55 ℃。

1.2.5遺傳進(jìn)化分析用MEGA5.0軟件將PRV AH和部分國(guó)內(nèi)外經(jīng)典的PRV毒株的gC、gE基因序列進(jìn)行比對(duì)分析，并采用鄰位相連法繪制系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.6主要糖蛋白的序列分析將PRV AH與PRV其他毒株的gB、gC、gD、gE氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)分析，以解析新流行株與其他毒株的差異。

2結(jié)果與分析

2.1病毒分離

將流產(chǎn)胎兒腦組織樣品接種到PK-15單層細(xì)胞上，在接種48 h后觀察到了明顯細(xì)胞病變，提取病變細(xì)胞總DNA為模板，利用PRVgE特異性引物進(jìn)行PCR檢測(cè)，結(jié)果顯示可以擴(kuò)增出gE特異性條帶(圖略)，證實(shí)病料中含有偽狂犬病毒，并命名為PRV AH。

2.2致病性試驗(yàn)

所有接種10-1和10-2稀釋度病毒液的小鼠都在72～84 h內(nèi)死亡，有3只接種10-3稀釋度病毒液的小鼠在72～84 h內(nèi)死亡。接種10-4稀釋度病毒液的小鼠未發(fā)生死亡。所有接種死亡的小鼠都表現(xiàn)典型的偽狂犬病癥狀，如神經(jīng)癥狀和奇癢癥狀，小鼠在接種不同稀釋度的病毒液后的死亡情況見表2。在PK-15細(xì)胞中測(cè)得PRV AH分離株的TCID50為10-7.4/0.1 mL。經(jīng)寇氏法測(cè)得病毒對(duì)小鼠的LD50為104.3TCID50。

表2分離株P(guān)RV AH對(duì)小鼠的致病性試驗(yàn)

Tab.2The pathogenicity of PRV AH to mice

病毒稀釋度病毒滴度t死亡/h死亡率原液107.4TCID5072～845/510-1106.4TCID5072～845/510-2105.4TCID5072～845/510-3104.4TCID5072～843/510-4103.4TCID50…0/5空白0…0/5

2.3遺傳進(jìn)化分析

分別以PRVgC和gE基因?qū)π铝餍兄昱c其他毒株進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析。在PRVgC基因的遺傳進(jìn)化分析中，采用了30株國(guó)內(nèi)不同年代或不同地點(diǎn)分離的PRV毒株和5株國(guó)外分離的PRV毒株，結(jié)果表明,除2008年分離的7株毒株外，其他國(guó)內(nèi)毒株都位于同一個(gè)分支，且2011年P(guān)RV重新大流行以來(lái)新分離毒株的遺傳關(guān)系更近，這些毒株與國(guó)外毒株及疫苗毒株Bartha株遺傳關(guān)系較遠(yuǎn)(圖1)，這與Fonseca等[7]的結(jié)果相符。本研究中所分離的毒株P(guān)RV AH與2011年P(guān)RV重新大流行以來(lái)分離的PRV毒株位于同一分支，因此歸屬于新流行株。

圖1PRV gC基因的遺傳進(jìn)化分析

Fig.1Phylogenetic analysis based on PRV gC

PRVgE基因的遺傳進(jìn)化分析結(jié)果與gC基因的相似。在PRVgE基因的遺傳進(jìn)化分析中，采用了14株國(guó)內(nèi)不同年代或不同地點(diǎn)分離的PRV毒株和9株國(guó)外PRV毒株，結(jié)果顯示，所有國(guó)內(nèi)毒株與國(guó)外毒株(P-PrV-Malaysia株除外)分屬于不同分支，說明國(guó)內(nèi)分離毒株遺傳關(guān)系較近，而與國(guó)外毒株存在較大差異(圖2)。

圖2PRV gE基因的遺傳進(jìn)化分析

Fig.2Phylogenetic analysis based on PRV gE

2.4PRV主要糖蛋白的序列分析

將PRV國(guó)內(nèi)分離株的主要糖蛋白序列與Bartha株及國(guó)外分離株進(jìn)行比較，結(jié)果顯示,國(guó)內(nèi)株都存在明顯的氨基酸的缺失或插入。在糖蛋白gB區(qū)域，所有國(guó)內(nèi)株在75～78氨基酸處存在4個(gè)氨基酸的缺失，在93～94氨基酸處存在2個(gè)氨基酸的插入(圖3)。在糖蛋白gC區(qū)域，國(guó)內(nèi)毒株(除2008年分離的7株毒株外)在62～69氨基酸處都存在8個(gè)連續(xù)氨基酸的插入(圖4)。與Bartha株相比較，多數(shù)國(guó)內(nèi)株在糖蛋白gD 的275～276氨基酸處存在2個(gè)氨基酸的插入，而PRV Ea株在275～279氨基酸處存在5個(gè)連續(xù)氨基酸的插入(圖5)。在糖蛋白gE區(qū)域，不同分離株的區(qū)別主要位于48氨基酸和495～498氨基酸處，如與國(guó)外經(jīng)典毒株Kaplan株和Becker株相比較，國(guó)內(nèi)新分離株(除HNHB株外)在496～498位置均存在1～3個(gè)氨基酸的插入，部分國(guó)內(nèi)株在48氨基酸處還存在1個(gè)氨基酸的插入(圖6)。

圖3　不同PRV毒株gB氨基酸的序列比對(duì)分析

圖4　不同PRV毒株gC氨基酸的序列比對(duì)分析

圖5　不同PRV毒株gD氨基酸的序列比對(duì)分析

Fig.5Comparison of gD glycoprotein amino acid sequences of different PRV strains

圖6　不同PRV毒株gE氨基酸的序列比對(duì)分析

Fig.6Comparison of gE glycoprotein amino acid sequences of different PRV strains

3討論

PRV AH株從安徽某Bartha株疫苗免疫豬場(chǎng)的流產(chǎn)胎兒腦組織中分離得到，經(jīng)動(dòng)物試驗(yàn)測(cè)得其毒力較強(qiáng)，對(duì)小鼠LD50可達(dá)104.3TCID50。為了了解PRV AH株和國(guó)內(nèi)外其他PRV毒株的關(guān)系，我們分別以PRVgC和gE基因進(jìn)行了遺傳進(jìn)化分析，結(jié)果顯示PRV AH株和2011年造成國(guó)內(nèi)PRV大流行的毒株十分相似。

偽狂犬病毒的糖蛋白不僅在病毒的侵入、釋放以及細(xì)胞間傳播等過程中起重要作用，而且也是參與機(jī)體免疫反應(yīng)的主要靶蛋白。因此，對(duì)這些糖蛋白進(jìn)行深入分析有助于了解新毒株的致病性及免疫原性等。對(duì)PRV gB、gC、gD、gE糖蛋白的序列分析表明，國(guó)內(nèi)不同時(shí)期分離的毒株，特別是新毒株序列基本相似，但與Bartha株存在明顯差異，主要表現(xiàn)為多個(gè)連續(xù)氨基酸的插入或缺失，且部分差異區(qū)域位于這些糖蛋白的重要功能區(qū)。

在PRV gB糖蛋白N端的 59～126氨基酸序列存在3個(gè)連續(xù)的抗原表位區(qū)，這一區(qū)域的氨基酸序列具有高柔韌性、易接近性和親水性，具有抗體結(jié)合位點(diǎn)(ABD)的特征[8]。在本研究中，與Bartha株相比，所有國(guó)內(nèi)毒株均存在4個(gè)氨基酸的缺失(75～78氨基酸)和2個(gè)氨基酸的插入(93～94氨基酸)，這些突變都在59～126氨基酸區(qū)域，可能會(huì)影響抗原-抗體的結(jié)合。

PRVgC基因在誘導(dǎo)感染動(dòng)物體液免疫和細(xì)胞免疫中起著重要作用。在豬群，無(wú)論是野毒感染還是弱毒疫苗免疫，機(jī)體誘導(dǎo)產(chǎn)生的PRV中和抗體主要是針對(duì)gC糖蛋白。此外，gC糖蛋白是介導(dǎo)病毒與靶細(xì)胞的黏附所必須，主要通過其表面的3個(gè)肝素結(jié)合區(qū)域(HBDs)與靶細(xì)胞表面硫酸乙酰肝素糖胺聚糖鏈結(jié)合。HBDs 區(qū)域同時(shí)也是gC糖蛋白 N端的抗體結(jié)合區(qū)域(44～290氨基酸)的一部分，用gC特異性抗體結(jié)合該區(qū)域可干擾病毒的黏附作用[9]。在本研究中，與Bartha株相比，國(guó)內(nèi)新毒株的gC氨基酸序列在ABD區(qū)域均存在8個(gè)連續(xù)氨基酸的插入，這可能會(huì)改變?cè)搮^(qū)的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，從而影響gC抗體與其有效結(jié)合。這可能也是造成Bartha株疫苗對(duì)當(dāng)前PRV流行株免疫效果低下的原因之一。

PRV gD糖蛋白可介導(dǎo)細(xì)胞間的融合，主要通過與細(xì)胞表面被稱為皰疹病毒侵入介質(zhì)(Herpesvirus entry mediators, Hve)的受體發(fā)生結(jié)合，以穩(wěn)定病毒與細(xì)胞的相互作用。gD糖蛋白也是誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體的靶蛋白之一，這種抗體可減少PRV侵入細(xì)胞，從而在抗病毒免疫中發(fā)揮重要作用[10]。在本研究中，與Bartha株相比，國(guó)內(nèi)PRV新毒株的gD氨基酸序列在267～276氨基酸處存在(Pro-Arg)5序列，而在Bartha株是 (Pro-Arg)4序列，且在這一區(qū)域脯氨酸的連續(xù)間隔排列可以在蛋白表面形成嚴(yán)格的親水結(jié)構(gòu)，從而有利于蛋白之間的相互作用[11]。這些特殊氨基酸序列在PRV感染中的具體作用尚不清楚。國(guó)內(nèi)毒株在gD蛋白中的這些突變是否會(huì)影響其與Bartha株疫苗抗體的有效結(jié)合尚需進(jìn)一步證實(shí)。

PRV gE糖蛋白在介導(dǎo)細(xì)胞融合、病毒擴(kuò)散和釋放等方面起著重要作用[12-13]，同時(shí)gE基因也與PRV的毒力相關(guān)[14-15]。在本研究中，國(guó)內(nèi)毒株gE氨基酸序列的主要區(qū)別在于48位和496～498位存在不同數(shù)量氨基酸的插入，這些插入可能會(huì)導(dǎo)致病毒毒力的改變。

綜上所述，與Bartha株相比，國(guó)內(nèi)PRV毒株的主要免疫原性蛋白gB、gC、gD均存在明顯差異，這也可能是影響B(tài)artha株疫苗在國(guó)內(nèi)豬場(chǎng)免疫效果不佳的原因之一。在2011年后國(guó)內(nèi)分離的PRV毒株中，除gE蛋白外，糖蛋白gB、gC、gD無(wú)明顯突變，且與國(guó)內(nèi)經(jīng)典毒株Ea、Fa、SA215等基本相似。因此，國(guó)產(chǎn)疫苗，如由Ea株致弱的HB-98毒株，可能可以提供更好的免疫保護(hù)，但國(guó)產(chǎn)疫苗生產(chǎn)工藝等方面仍需改進(jìn)以提高疫苗的質(zhì)量。此外，疫苗的免疫效果很大程度上取決于豬群本身的狀況，例如疾病、營(yíng)養(yǎng)缺乏和藥物濫用等因素導(dǎo)致動(dòng)物機(jī)體的免疫抑制也可能導(dǎo)致疫苗免疫失敗。

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【責(zé)任編輯柴焰】

Molecular characteristics of major glycoproteins of the novel pseudorabies virus causing a severe epidemic in China

XIANG Keyu，PAN Hui，JI Yikuan，WANG Yu，ZHANG Baoshi，LUO Yongwen，JU Chunmei

(College of Veterinary Medicine, South China Agricultural University /Key Laboratory of Zoonosis Prevention and Control of Guangdong Province， Guangzhou 510642， China)

Abstract：【Objective】 In order to study the genetic characteristics of the novel epidemic pseudorabies virus (PRV).【Method】A PRV strain named PRV AH was isolated from a pig farm in Anhui Province, the phylogenetic tree was constructed and the glycoproteins gB，gC，gD and gE of this strain were analyzed. 【Result】 PRV AH was very similar to an epidemic strain which had caused a severe PRV outbreak in China since 2011, but was distantly related to Bartha or other foreign strains. Compared with Bartha and other foreign strains, all PRV strains in China had obvious deletions and insertions of continuous amino acids in the glycoproteins, and some mutations were found in the critical functional regions of the glycoproteins.【Conclusion 】This study analyzes the genetic differences between the novel epidemic PRV strain and Bartha strain at the molecular level, which provides a theoretical basis for further clarification of the immunization failure of Bartha-K61 vaccine.

Key words：pseudorabies virus; novel epidemic strain； glycoprotein; molecular characteristics

中圖分類號(hào)：S852.65

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1001- 411X(2016)03- 0023- 06

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金(31001074)

作者簡(jiǎn)介：向柯宇(1990—)，男，碩士研究生，E-mail：1020928367@qq.com；通信作者：琚春梅(1976—)，女，副教授，博士，E-mail：juchunmei @scau.edu.cn

收稿日期：2015- 09- 11優(yōu)先出版時(shí)間：2016-04-15

優(yōu)先出版網(wǎng)址：http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1110.s.20160415.1555.014.html

向柯宇，潘慧，吉藝寬，等.豬偽狂犬病病毒新流行株主要糖蛋白的分子特征分析[J].華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)， 2016, 37(3):23- 28.