中藥組方熱水提取正丁醇相的HPLC-MS分析

楊　海，耿傳信，周學(xué)鋒，趙　峽，鄒　曉

(1. 山東省青島市中心醫(yī)院，山東 青島 266042；2. 中國(guó)海洋大學(xué)醫(yī)藥學(xué)院,山東 青島 266003;3. 山東省青島市腫瘤醫(yī)院，山東 青島 266042)

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中藥組方熱水提取正丁醇相的HPLC-MS分析

楊海1,2，耿傳信3，周學(xué)鋒1，趙峽2，鄒曉1

(1. 山東省青島市中心醫(yī)院，山東 青島 266042；2. 中國(guó)海洋大學(xué)醫(yī)藥學(xué)院,山東 青島 266003;3. 山東省青島市腫瘤醫(yī)院，山東 青島 266042)

[摘要]目的分析中藥組方水煎液正丁醇相的化學(xué)組分。方法采用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法，以甲醇-水為流動(dòng)相，梯度洗脫，流速為1 mL/min，ESI正離子模式進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)，分子量掃描范圍為50～1 000 m/z。將檢測(cè)分子量數(shù)據(jù)與數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)比，對(duì)相似度得分在80以上的化合物進(jìn)行文獻(xiàn)及來(lái)源藥材成分檢索，鑒定化合物。結(jié)果共鑒定巫山淫羊藿黃酮甙、淫羊藿屬甙C、脫水淫羊藿素-3-鼠李糖甙、2-甲基-5-丙酮基-7-羥基色酮等16個(gè)化合物，并對(duì)化合物的藥材來(lái)源進(jìn)行歸屬。結(jié)論高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)為中藥組方的成分鑒定提供了一種高效快速的方法，為中藥組方的臨床應(yīng)用提供了理論依據(jù)。

[關(guān)鍵詞]中藥組方；水提??；正丁醇相；質(zhì)譜分析

中藥復(fù)方是中藥臨床應(yīng)用的主要形式，中藥物質(zhì)基礎(chǔ)研究是中藥現(xiàn)代化的基礎(chǔ)，對(duì)于闡明中藥有效成分及其藥理作用意義重大[1-2]。建立快速高效的中藥組方成分分析方法，進(jìn)而確定有效成分的協(xié)同作用是中藥研究的方向之一[3]。近年來(lái)由于液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)分析高效性、檢測(cè)靈敏性等特點(diǎn)，使得該技術(shù)在中藥組方中研究越來(lái)越廣。本研究對(duì)臨床應(yīng)用多年且療效確切的一組中藥驗(yàn)方采用HPLC-MS法進(jìn)行成分鑒定，旨在為該組方的臨床使用提供理論依據(jù)和參考。

1實(shí)驗(yàn)資料

1.1儀器與試藥液質(zhì)聯(lián)用色譜儀采用Agilent 1260 Infinity液相色譜系統(tǒng)，Agilent Technologies 6520 Accurate-Mass Q-TOF LC/MS 質(zhì)譜分析儀，安裝Agilent Masshunter軟件工作站；色譜柱采用Agilent Zorbox SB-C18(4.6mm×150 mm,5 μm)；R-410型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士Büchi公司)；DL-5低速大容量離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠(chǎng))；超純水儀(美國(guó)Milli-Q公司)；DZF-150型數(shù)顯小型恒溫真空干燥箱(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司)；SEC20/3+1型常溫二煎煎藥機(jī)(黃岡永安醫(yī)療器械有限公司)。供實(shí)驗(yàn)用藥材均采購(gòu)自芍花堂藥業(yè)股份有限公司，經(jīng)青島市中心醫(yī)院主管中藥師趙海鑒定；甲醇(色譜級(jí)，美國(guó)ACS公司)；石油醚、乙酸乙酯、正丁醇等試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。0.22 μm微孔濾膜(上海亞?wèn)|核級(jí)樹(shù)脂有限公司)。

1.2方法

1.2.1萃取按照中藥傳統(tǒng)水煎煮工藝進(jìn)行中藥方的提取。按組方放大20倍，取中藥復(fù)方共3.6 kg，加水煎煮3次。第1次加10倍量水，提取2 h；第2次加8倍量水，提取1.5 h；第3次加6倍量水，提取1 h。煎煮液過(guò)濾，合并，減壓濃縮至濃縮液2.5 L左右。濃縮液依次用等體積的石油醚，乙酸乙酯，正丁醇萃取3次，各相萃取液減壓濃縮干燥。選取正丁醇相進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。

1.2.2分析方法色譜條件：流動(dòng)相為甲醇(A)-水(B)溶液；洗脫梯度：5%A(0～5 min)，5%～90%A(5～50 min)，90%A(50～51 min)；流速 1 mL/min；柱溫40 ℃；自動(dòng)進(jìn)樣1 μL。質(zhì)譜條件：ESI正離子模式，分子量掃描范圍50～1 000 m/z，載氣流速12 L/min，載氣溫度：350 ℃，噴霧器壓力35 psi。

2結(jié)果

按“1.2.2”項(xiàng)下色譜及質(zhì)譜條件所得的中藥方正丁醇相的總離子流色譜圖見(jiàn)圖1。將圖1的m/z([M+H]+)數(shù)據(jù)與Aglient中藥質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索、對(duì)比，并通過(guò)查閱文獻(xiàn)及單味藥化學(xué)成分檢索，共鑒定17個(gè)化合物，鑒定結(jié)果見(jiàn)表1。

注：1. 巫山淫羊藿黃酮甙(wushanicariin)；2. 淫羊藿屬甙C(epimedoside C)；3. 脫水淫羊藿素-3-鼠李糖甙(anhydroicaritin-3-O-α-l-rhamnoside)；4. 2-甲基-5-丙酮基-7-羥基色酮(2-methyl-5-acetonyl-7-hydroxychromone)；5. 槲皮素(guercetol)；6. 4’-甲基茵陳色原酮(4’-methylcapillarisin)；7. 蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅱ(atractylenolide II)；8. 蒼術(shù)內(nèi)酯I(atractylenolide I)；9. 龍葵螺甙B(uttronin B)；10. 茯苓新酸C(poricoicacid C)；11. 16α-羥基齒孔酸甲酯(tumulosicacidmethylester)；12. 掌葉大黃二蒽酮A(palmidin A)；13. 掌葉大黃二蒽酮B(palmidin B)；14. α-澳洲茄堿(α-solasonine)；15. β-澳洲茄邊堿(β-solamargine)；16. 替告皂甙元(tigogenin)。

圖1　中藥組方正丁醇相總離子流(ESI陽(yáng)離子模式)色譜圖

3討論

近年來(lái)從經(jīng)典方劑、臨床驗(yàn)方、名老中醫(yī)優(yōu)秀處方等挖掘新藥、新組方是中藥研發(fā)的主要策略之一。本研究的中藥驗(yàn)方由山東省名老中醫(yī)提供，臨床應(yīng)用多年。該組方由黃芪、白術(shù)、仙鶴草等11味中藥組成，主要應(yīng)用于惡性腫瘤患者，特別是免疫力低下肺癌、胃腸道惡性腫瘤中晚期患者，能提高患者免疫力，改善生活質(zhì)量，聯(lián)合放化療能提高治療依從性、減少放化療不良反應(yīng)，起到減毒增效的作用[4]。

中藥組方藥效發(fā)揮通常是通過(guò)多靶點(diǎn)、多途徑協(xié)同作用[5-6]，對(duì)于整方的研究更能體現(xiàn)復(fù)方整體性及中醫(yī)整體觀(guān)理論，接近臨床應(yīng)用實(shí)際，因此本研究采用傳統(tǒng)的水煎煮工藝，確保分析結(jié)果與藥效相一致。由于中藥成分的復(fù)雜性，為確保各組分有效分離，本研究采取甲醇-水梯度洗脫的方法，并適當(dāng)延長(zhǎng)洗脫時(shí)間。

在進(jìn)行質(zhì)譜分析時(shí)本研究采取ESI正離子模式，將所得的化合物精確分子量與數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索、對(duì)比，將相似度在80以上對(duì)比結(jié)果再次進(jìn)行文獻(xiàn)檢索并將化合物的藥材來(lái)源進(jìn)行歸屬。同一精確荷質(zhì)比(M/Z)可能對(duì)應(yīng)多個(gè)藥材來(lái)源不同化合物分子式，該方法難以鑒定，為此本研究在同一色譜條件下采取單藥組分流出時(shí)間與組方成分流出時(shí)間對(duì)比的方式，從而可以確定成分的藥材來(lái)源，進(jìn)而確定結(jié)構(gòu)。

總之，運(yùn)用HPLC-MS法對(duì)中藥組方成分鑒定，研究方法可行，為該組方活性研究及擴(kuò)大臨床應(yīng)用提供數(shù)據(jù)支持，為發(fā)掘優(yōu)秀中醫(yī)處方提供方法學(xué)參考。

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[收稿日期]2015-07-10

[中圖分類(lèi)號(hào)]R284.2

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]B

[文章編號(hào)]1008-8849(2016)04-0435-03

doi:10.3969/j.issn.1008-8849.2016.04.034

[基金項(xiàng)目]國(guó)家十二五科技支撐計(jì)劃(2013BAB01B02)；青島中醫(yī)科研計(jì)劃(2014-zyy022)

[通信作者]鄒曉，E-mail：qdzx08@163.com