苯并芘對孕早期小鼠胎盤絨毛組織的影響及蘆丁的防護作用研究

高秀霞,劉　琨，陳　娟,侯海燕

(1. 武警后勤學院附屬醫(yī)院，天津 300162；2. 武警遼寧省總隊大連醫(yī)院，遼寧 大連 116000)

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苯并芘對孕早期小鼠胎盤絨毛組織的影響及蘆丁的防護作用研究

高秀霞1,劉琨2，陳娟1,侯海燕1

(1. 武警后勤學院附屬醫(yī)院，天津 300162；2. 武警遼寧省總隊大連醫(yī)院，遼寧 大連 116000)

[摘要]目的探討苯并芘(BaP)對孕早期小鼠胎盤絨毛組織細胞的影響及蘆丁的防護機制。方法選取性成熟ICR小鼠150只(雌鼠100只、雄鼠50只)，隨機分為空白組，模型組及蘆丁低、中、高劑量組，每組30只(雌鼠20只、雄鼠10只)，雌雄分開飼養(yǎng)。模型組予BaP 2 mg/(kg·d)灌胃；蘆丁低、中、高劑量組予BaP 2 mg/(kg·d)的同時分別灌胃蘆丁0.5，1，2 g/(kg·d)；空白組灌胃相同體積的0.9%氯化鈉注射液與橄欖油。各組連續(xù)灌胃15 d后雌雄鼠同籠，第2天發(fā)現(xiàn)精液栓為受孕，挑出受孕小鼠繼續(xù)灌胃7 d后處死，取胎盤組織測定bax與bcl-2 mRNA表達水平及細胞色素P450(CYP450)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)、超氧化物歧化酶(SOD)活性。結果模型組bax mRNA表達水平及bax/bcl-2比值均明顯高于空白組(P均<0.05)；蘆丁各劑量組bax mRNA表達水平及bax/bcl-2比值均明顯高于空白組(P均<0.05)，但均低于模型組(P均<0.05)，且隨著蘆丁劑量的增加二者逐漸降低(P均<0.05)。模型組bcl-2 mRNA表達水平明顯低于空白組(P均<0.05)；蘆丁各劑量組bcl-2 mRNA表達水平均低于空白組(P均<0.05)，但均高于模型組(P均<0.05)，且隨著蘆丁劑量的增加其表達水平逐漸升高(P均<0.05)。bax與bcl-2 mRNA表達水平間呈負相關性(r=-0.825，P=0.021)。蘆丁各劑量組CYP450活性均明顯高于空白組(P均<0.05)，但低于模型組(P均<0.05)，且隨著蘆丁劑量的增加其活性逐漸降低(P均<0.05)；蘆丁各劑量組GSH-PX、SOD活性均明顯低于空白組(P均<0.05)，但均高于模型組(P均<0.05)，且隨著蘆丁劑量的增加二者活性逐漸升高(P均<0.05)。結論蘆丁能通過提高抗氧化酶活力與抑制凋亡基因表達來保護BaP所致的胎盤絨毛組織細胞損傷，提高生育能力。

[關鍵詞]苯并芘；蘆??；胎盤絨毛組織；凋亡；妊娠

苯并芘(BaP)是多環(huán)芳烴類化合物(PAHs)中的代表，形成于能源物質(zhì)與肉類食物的不完全燃燒，其能導致細胞發(fā)生凋亡，其致凋亡機制是通過肝臟代謝過程中經(jīng)細胞色素P450酶(CYP450)作用而產(chǎn)生大量氧化性極強的中間產(chǎn)物二氫二醇環(huán)氧苯并芘(BPDE)與大量的氧自由基[1]。胎盤是母體與胚胎進行物質(zhì)交換的場所，其功能降低后會影響胚胎發(fā)育。Detmar等[2]通過大鼠暴露于低濃度的BaP研究顯示，BaP誘發(fā)凋亡是通過增加胎盤與胎膜內(nèi)皮細胞上的凋亡相關基因的表達來實現(xiàn)的。其致凋亡具體路徑是其與DNA形成加合物后作用于芳香烴受體(AhR)，進一步活化bax基因而發(fā)揮作用[3]。蘆丁(RU)是黃酮類化合物中的代表物質(zhì)，微溶于水，易溶于熱乙醇、乙醚等有機溶劑，是黃酮類化合物中抗氧化能力最強的，長期服用有調(diào)節(jié)血脂、血糖及其抗腫瘤等功效[4]。為明確蘆丁能否抑制BaP所誘導的胎盤絨毛組織凋亡及其保護作用機制，筆者進行了相關研究，現(xiàn)將結果報道如下。

1實驗資料

1.1實驗動物及分組選取性成熟ICR小鼠150只(雌鼠100只、雄鼠50只)，北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，周齡6～8周，體質(zhì)量30～34 g，動物合格證號SCXK-(京)2012-0002。用隨機數(shù)字法分為空白組、模型組及蘆丁低、中、高劑量組，每組30只(雌鼠20只、雄鼠10只)。

1.2實驗方法雌、雄鼠分開飼養(yǎng)，飼養(yǎng)溫度控制在20～26 ℃，12 h光照，12 h黑暗，顆粒飼料喂養(yǎng)(雌鼠給予高蛋白飼料)，自由飲水飲食。模型組雌鼠予BaP(美國Sigma公司產(chǎn)品) 2 mg/(kg·d)灌胃；蘆丁低、中、高劑量組雌鼠予BaP 2 mg/(kg·d)的同時分別灌胃蘆丁(美國Sigma公司產(chǎn)品)0.5，1，2 g/(kg·d)；空白組雌鼠灌胃相同體積的0.9%氯化鈉注射液與橄欖油(西班牙品利公司產(chǎn)品)。BaP用橄欖油配成混懸液，蘆丁用生理鹽水配成混懸液，兩種制劑均配好后避光4 ℃保存，現(xiàn)用現(xiàn)配。連續(xù)灌胃15 d后雌雄鼠同籠，第2天發(fā)現(xiàn)有精液栓為懷孕第1天[5]，將已受孕的小鼠按上述方法再連續(xù)灌胃7 d(ICR小鼠孕周期為20 d，早孕為7 d[5])，最后一次灌胃后頸椎脫臼法處死小鼠并立即放于冰臺(-4～0 ℃)上，無菌條件下取出胎盤組織，檢測相關指標。

1.3bax與bcl-2 mRNA表達水平測定采用RT-PCR法測定。稱取10 mg新鮮胎盤組織并按Trizol試劑盒(美國Invitrogen公司產(chǎn)品)說明書提取出總RNA。以下步驟試劑盒為日本TaKaRa公司產(chǎn)品，RNA純度與完整性符合要求后按試劑盒說明以(oligo) dT為引物逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，以2 μL的cDNA為模板按試劑盒說明進行PCR擴增，GAPDH為內(nèi)參照。反應條件：94 ℃ 60 s、Tm(根據(jù)不同的退火溫度定)50 s、72 ℃下90 s，連續(xù)進行40個循環(huán)。擴增產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠(20 g/L)電泳槽中跑40 min，取出凝膠并在紫外燈(260 nm)下進行照相。用quantity one軟件對照片中各個目的基因的條帶密度與寬度進行分析，以管家基因GAPDH為內(nèi)參照計算各個樣本的基因條帶密度的相對值，Marker由小到大依次是100，250，500，750，1 000，2 000 bp，引物由日本TaKaRa公司合成，聚丙烯酰胺凝膠電泳采用PCGE級純化，基因序列如下：bax引物(335 bp、Tm 59 ℃)上游：5’-CCGGCGAATTGGAGATGAACTG-3’,下游：5’-TGGTCACTGTCTGCCATGTGGG-3’；bcl-2引物(741 bp、Tm 56 ℃)上游：5’-CGGAGGAAGTAGACTGATATTAACAAAG-3’,下游：5’- CCGAACTCAAAGAAGGCCACA-3’；GAPDH引物(239 bp、Tm：52 ℃)上游：5’-ATTGTCAGCAATGCATCCTG-3’,下游：5’-TTCAGCTCTGGGATGACCTTGCC-3’。

1.4CYP450酶活性檢測[6]試劑盒為德國Promegen公司產(chǎn)品。將取出的新鮮胎盤組織用0 ℃ 0.9% NaCl沖洗直至為清亮液體流下為止，每克胎盤組織加0.2 mmol/L的PBS溶液(pH=7.4)5.0 mL，在0～4 ℃下10 000～15 000 r/min離心15 min，取上清液，再用超速低溫離心機(美國Beckman公司產(chǎn)品)100 000 r/min離心60 min，抽取上清液，保留沉淀，繼續(xù)加入0.2 mmol/L PBS緩沖液(pH=7.4)，每克組織所得微粒體沉淀物加緩沖液1.0 mL后混勻。將10 mg/mL的微粒體蛋白混懸液0.3 mL加入5.7 mL的PBS混懸液(pH=7.4)后充分混勻，分裝在2只比色杯中，置于UA-265雙光道雙光束紫外分光光度計(日本島津公司產(chǎn)品)中并在400～500 nm基線間進行掃描。取數(shù)毫克連二亞硫酸鈉保險粉加入兩比色杯中并混勻，將CO輕輕充入樣品杯中并掃描400～500 nm的差異光譜，以450 nm和490 nm處吸光度值為基礎計算出CYP450酶活性。

1.5GSH-PX、SOD酶活性檢測將取出的新鮮胎盤組織在4 ℃下10 000～15 000 r/min勻漿(勻漿時間10 s/次，間隙30 s，連續(xù)3～4次)，按試劑盒(南京建成生物技術公司產(chǎn)品)說明稱取組織后先測定蛋白含量(雙縮脲法)，再按試劑盒說明，采用BioPhotometer型生物分光光度計(德國Eppendorf公司產(chǎn)品)測定并按照公式計算出GSH-PX、SOD活性值。

1.6胎盤絨毛組織細胞觀察將取出的新鮮胎盤組織用0.9% NaCl溶液沖洗干凈后浸泡于10%多聚甲醛(美國Sigma公司)中，石蠟包埋后制成石蠟切片，將石蠟塊按5 μm的厚度切片附于經(jīng)多聚賴氨酸附膜的載玻片上，每隔10張切片染色1張。將切片在40 ℃水中展平，平鋪于載玻片上。將載玻片放入60 ℃烤箱中烤片，按照試劑盒(天津灝洋生物制品科技公司)說明進行染色，封片后在顯微鏡下觀察，進行400×的顯微照相。

2結果

2.1各組受孕情況模型組成功受孕9只(45%)，蘆丁低劑量組成功受孕8只(40%)，蘆丁中劑量組成功受孕10只(50%)，蘆丁高劑量組成功受孕11只(55%)，空白組成功受孕10只(50%)。

2.2各組小鼠胎盤絨毛組織中bax、bcl-2 mRNA表達水平比較模型組bax mRNA表達水平及bax/bcl-2比值均明顯高于空白組(P均<0.05)；蘆丁各劑量組bax mRNA表達水平及bax/bcl-2比值均明顯高于空白組(P均<0.05)，但均低于模型組(P均<0.05)，且隨著蘆丁劑量的增加二者逐漸降低(P均<0.05)。模型組胎盤絨毛組織中bcl-2 mRNA表達水平明顯低于空白組(P均<0.05)；蘆丁各劑量組bcl-2 mRNA表達水平均低于空白組(P均<0.05)，但均高于模型組(P均<0.05)，且隨著蘆丁劑量的增加其表達水平逐漸升高(P均<0.05)。bax和bcl-2 mRNA表達水平間呈負相關性(r=-0.825，P=0.021)。見表1。

表1　各組小鼠胎盤絨毛組織中bax、bcl-2 mRNA

注:①與模型組比較，P<0.05；②與蘆丁低劑量組比較，P<0.05；③與蘆丁中劑量組比較，P<0.05；④與蘆丁高劑量組比較，P<0.05。

2.3各組小鼠胎盤絨毛組織中CYP450、GSH-PX、SOD活性比較蘆丁各劑量組CYP45活性均明顯高于空白組(P均<0.05)，但均低于模型組(P均<0.05)，且隨著蘆丁劑量的增加其活性逐漸降低(P均<0.05)；蘆丁各劑量組GSH-PX、SOD活性均明顯低于空白組(P均<0.05)，但均高于模型組(P均<0.05)，且隨著蘆丁劑量的增加二者活性逐漸升高(P均<0.05)。見表2。

2.4各組小鼠胎盤絨毛組織細胞凋亡情況HE染色400倍光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，模型組中可見細胞排列紊亂，部分細胞形態(tài)異常，細胞呈空泡狀，或胞核深染，胞質(zhì)濃縮，染色質(zhì)成團塊狀，其數(shù)量明顯高于其他4組，見圖1；蘆丁低劑量組表現(xiàn)與模型組近似，但核固縮、破裂細胞較模型組減少，見圖2；蘆丁中、高劑量組細胞排列較以上2組整齊，核固縮、核碎裂、核溶解、細胞膜皺縮、破裂的細胞較少，見圖3及圖4；空白組細胞排列有序，細胞形態(tài)多數(shù)正常，異常細胞數(shù)量較少，見圖5。

表2　各組小鼠胎盤絨毛組織中CYP450、

注:①與模型組比較，P<0.05；②與蘆丁低劑量組比較，P<0.05；③與蘆丁中劑量組比較，P<0.05；④與蘆丁高劑量組比較，P<0.05。

圖1　模型組胎盤絨毛組織細胞凋亡情況(HE，400×)

圖2　蘆丁低劑量組胎盤絨毛組織細胞凋亡情況(HE，400×)

圖3　蘆丁中劑量組胎盤絨毛組織細胞凋亡情況(HE，400×)

3討論

蘆丁主要來源于姜科植物山奈的根莖，有些水果、蔬菜中也含有山奈酚，目前很多實驗室已從茶葉、蜂膠、柚子等植物中提取到它的純品，其有一定的抑癌功效[7]。黃酮類物質(zhì)除了有較強的抗氧化能力外，還能降低BaP所誘導的CYP450活性增強(這是其他抗氧化劑所沒有的)，從而降低代謝產(chǎn)物BPDE的產(chǎn)生，減輕氧化損傷[8]，因此可選擇蘆丁對抗BaP氧化損傷。

圖4　蘆丁高劑量組胎盤絨毛組織細胞凋亡情況(HE，400×)

圖5　空白組胎盤絨毛組織細胞凋亡情況(HE，400×)

bax基因本身發(fā)揮凋亡作用必須與bcl-2基因配合才能完成，當bax形成同源二聚體時發(fā)揮促進凋亡作用，而bcl-2基因表達量升高，與bcl-2基因結合形成異源二聚體時發(fā)揮抑制凋亡作用[9]。本實驗結果顯示，模型組bax mRNA表達水平及bax/bcl-2比值均明顯高于空白組；蘆丁各劑量組bax mRNA表達水平及bax/bcl-2比值均明顯高于空白組，但均低于模型組，且隨著蘆丁劑量的增加二者逐漸降低。模型組胎盤絨毛組織中bcl-2 mRNA表達水平明顯低于空白組；蘆丁各劑量組bcl-2 mRNA表達水平均低于空白組，但均高于模型組，且隨著蘆丁劑量的增加其表達水平逐漸升高。bax和bcl-2 mRNA表達水平間呈負相關性。模型組發(fā)生細胞核固縮與溶解、細胞形態(tài)異常的細胞明顯高于其他組，而蘆丁各劑量組有所減少。提示BaP能通過升高胎盤絨毛組織bax mRNA表達量與降低bcl-2 mRNA表達量而誘導胎盤絨毛組織細胞發(fā)生凋亡；BaP可使bax/bcl-2比值升高，而蘆丁可通過降低bax mRNA表達量并升高bcl-2 mRNA表達量而抑制細胞凋亡，且蘆丁2 g/(kg·d)抑制效果最強。

CYP450是一個大家族，其家族成員目前已知有14個，人體內(nèi)有30個同工酶，主要分布于肝臟，參與藥物與毒物的代謝，一般發(fā)揮解毒效應，但在有些條件下代謝產(chǎn)物毒性較強，在代謝BaP過程中就主要發(fā)揮增毒效應。BaP在肝臟中的CYP450作用過程中產(chǎn)生大量活性氧物質(zhì)造成過氧化損傷，該酶活性強弱在染毒早期反映其染毒程度強弱，染毒程度越高活性越強，而晚期該酶耗盡，活力降低[10]。朱淑萍等[11]通過妊娠早期大鼠BaP灌胃致畸胎動物模型證實大鼠孕早期經(jīng)BaP毒染能使胎盤絨毛組織中CYP450活性升高，而晚期活性降低。本研究結果顯示，蘆丁各劑量組CYP45活性均明顯高于空白組，但均低于模型組，且隨著蘆丁劑量的增加其活性逐漸降低，與上述結論一致。

BaP經(jīng)CYP450代謝可以產(chǎn)生大量活性氧，機體需要啟動抗氧化防御體系來保護機體免受其損害。SOD 和GSH-PX是主要的抗氧化酶，SOD 主要促使過氧化物游離基轉(zhuǎn)化成過氧化氫和氧，從而清除炎癥過程中伴隨產(chǎn)生的過氧化物游離基；GSH-PX可催化脂質(zhì)過氧化物(LPO)分解生成相應的醇,防止LPO均裂和引發(fā)脂質(zhì)過氧化作用的鏈式支鏈反應,減少LPO的生成以保護機體免受損害[8，12]。本研究結果顯示蘆丁各劑量組GSH-PX、SOD活性均明顯低于空白組，但均高于模型組，且隨著蘆丁劑量的增加二者活性逐漸升高。

綜上所述，蘆丁能升高胎盤絨毛組織抗氧化酶活性并且降低CYP450活性，糾正氧化與抗氧化失衡，并能通過降低bax mRNA表達水平和升高bcl-2 mRNA表達水平來抑制凋亡。但本研究僅針對妊娠期間胚胎對外界環(huán)境污染物最為敏感的早期進行了研究，對孕中期及晚期還未研究，且蘆丁是否能像維生素E一樣應用于妊娠前期與妊娠期婦女的日常保健而預防不良妊娠結局的發(fā)生，均值得進一步研究。

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Effort of BaP on placental villus tissue in the early pregnancy mice and study on the protection of Rutin

GAO Xiuxia1, LIU Kun2, CHEN Juan1, HOU Haiyan1

(1.Affiliated Hospital of Armed Police Logistics Institute, Tianjin 300162, China; 2.Dalian Hospital of PAP Corps of Liaoning Province, Dalian 116000, Liaoning, China)

Abstract:Objective It is to explore the effort of BaP on cells of placental villus tissue in the early pregnancy mice and to study the protection mechanism of Rutin.Methods 150 viripotent ICR mice(100 male mice, 50 female mice) were randomly divided into five groups: blank group, model group, low, middle and high dose of BaP groups, every group had 30 mice(20 male mice,10 female mice), all the female and male mice were separated and raised respectively. The mice in model group was lavaged with BaP 2 mg/(kg·d), the ones in ow, middle and high dose of BaP groups were lavaged with BaP 2 mg/(kg·d) and Rutin [0.5,1.0,2.0 g/(kg·d)] respectively, blank group was lavaged with normal saline(0.9%)+olive oil. After treating for 15days, male mice were mated with female mice, on the second day, gestational age was determined based on the presence of a vaginal plug, continued lavaging for 7 days.The mice were euthanized to detect the gene of bax and bcl-2 in the level of mRNA and the activity of cytochrome 450,GSH-PX and SOD in placental villus. Results The expression level of bax mRNA and bax/bcl-2 in model group were higher than that in blank group (P<0.05), the expression level and ratio in every Rutin group were higher than that in blank group, but lower than that in model group (P all<0.05), and with the dose increasing the decreasing was more significant (P<0.05). The expression level of bcl-2 mRNA in model group were lower than that in blank group (P<0.05), the expression level in every Rutin group was lower than that in blank group, but higher than that in model group (P all<0.05), and with the dose increasing the increasing was more significant (P<0.05). The expression of bax and bcl-2 mRNA were negatively related (r=-0.825,P=0.021). The activity of cytochrome P450 in every Rutin group was higher than that in blank group, but lower than that in model group (P<0.05), with the dose increasing, its activity decreased gradually (P<0.05), The activity of GSH-PX, SOD in every Rutin group was lower than that in blank group, but higher than that in model group (P<0.05), with the dose increasing, their activity increased gradually (P<0.05). Conclusion Rutin can protect cell injury in placental villus tissue induced by BaP and improve fertility by increasing activity of antioxidant enzyme and inhibiting expression of apoptotic genes.

Key words:BaP; Rutin; placental villus; apotosis; pregnancy

[收稿日期]2015-08-10

[中圖分類號]R-332

[文獻標識碼]A

[文章編號]1008-8849(2016)02-0122-05

doi:10.3969/j.issn.1008-8849.2016.02.003

[基金項目]天津市應用基礎與前沿技術研究計劃項目(15JCQNJC 2300)

[作者簡介]高秀霞，女，博士研究生在讀，主治醫(yī)師，主要從事婦科內(nèi)分泌及不孕癥診治工作。