食品專業(yè)教學(xué)中聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)機(jī)理的教學(xué)技巧

韓穎穎 劉寶林 周國燕 李維杰

摘要：對于初學(xué)者或非生物專業(yè)學(xué)生來講，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）的機(jī)理和指數(shù)擴(kuò)增機(jī)理比較抽象而難以理解。本文就食品專業(yè)本科生和研究生教學(xué)中如何技巧性地講授這一反應(yīng)的機(jī)理進(jìn)行了圖文并茂有層次的闡述，包括問題的引入、復(fù)制的原理、指數(shù)擴(kuò)增的依據(jù)以及如何在食品微生物檢測中應(yīng)用幾個(gè)方面。

關(guān)鍵詞：食品專業(yè)教學(xué)；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；教學(xué)技巧

中圖分類號(hào)：G642.4 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1674-9324（2016）13-0194-02

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）是種在體外快速擴(kuò)增特定DNA序列的方法，又稱基因的體外擴(kuò)增。PCR技術(shù)類似于DNA的天然復(fù)制過程，通過兩端的寡核苷酸引物確定其特異性。因PCR反應(yīng)具有微觀抽象的特點(diǎn)，所以對于包括食品專業(yè)學(xué)生在內(nèi)的跨專業(yè)學(xué)生或初學(xué)者來講理解起來有些難度，本文就如何技巧性地講授PCR原理和應(yīng)用進(jìn)行探討，以便為廣大食品專業(yè)教師提供參考。

一、從食品科學(xué)中常見的問題入手

將食品與生物學(xué)相結(jié)合的連接點(diǎn)是食品微生物。所以在講授中，先從食品微生物中常見問題入手，使學(xué)生有可以接受的切入點(diǎn)。

食品微生物研究中常遇到是微生物量的檢測問題，包括益生菌是否達(dá)標(biāo)，或有害微生物是否超標(biāo)。但如何對這些微生物進(jìn)行定量是長久以來關(guān)注的問題，比較常用的是菌落計(jì)數(shù)方法。但此方法處理較繁瑣，且易受到操作和人為方面的影響。而PCR可以為菌落的定量提供更加精確的指標(biāo)。通過這樣的引入，學(xué)生可以帶著問題去探討PCR反應(yīng)的機(jī)理。

二、從DNA復(fù)制原理入手講授PCR的基本原理

在PCR基本原理講授時(shí)要從學(xué)生較易理解的角度進(jìn)行問題的探討。首先為什么可以用PCR對微生物進(jìn)行定量呢？首先要談的是，每種生物細(xì)胞（核）內(nèi)都有一種物質(zhì)叫做基因或DNA。對微生物內(nèi)DNA量的鑒定，就可反應(yīng)某種微生物在食品中的量。

首先從DNA結(jié)構(gòu)和復(fù)制講起。DNA是雙螺旋結(jié)構(gòu)（如圖1A），為便于理解PCR反應(yīng)，可將DNA結(jié)構(gòu)以平面結(jié)構(gòu)方式展示（圖1B）。從圖1B可以看到，DNA兩條鏈通過堿基配對以氫鍵結(jié)合在一起。其中腺嘌呤（A）—胸腺嘧啶（T）配對，鳥嘌呤（G）—胞嘧啶（C）配對。能夠配對的堿基叫做互補(bǔ)堿基。

在生物細(xì)胞內(nèi)，為實(shí)現(xiàn)細(xì)胞分裂，DNA每天都在進(jìn)行著復(fù)制。DNA復(fù)制的起始是通過一段短的寡核苷酸引物引導(dǎo)進(jìn)行的，尤其是反向復(fù)制的一條新鏈，必須有多條引物來引導(dǎo)（由于DNA的聚合須按照5到3的方向，在拓樸異構(gòu)酶等將DNA雙鏈打開后，以3到5方向?yàn)槟０搴铣傻膯捂溈芍苯影凑?‘到3‘的方向合成；另一條鏈以5‘到3‘方向的母鏈為模板，所以須按照5‘到3‘的方向合成一小段一小段的DNA，最后通過連接酶連接起來），遵循A—T、G—C互補(bǔ)原則，按照模板鏈的堿基順序在新的鏈上添加核苷酸合成新的DNA鏈。

正是因?yàn)轶w內(nèi)DNA復(fù)制的發(fā)現(xiàn)，1971年Khorana提出，如果體外有單鏈DNA、引物、dNTP和DNA聚合酶，那么在體外也可進(jìn)行DNA復(fù)制反應(yīng)。此設(shè)想很容易理解，但由于引物合成在當(dāng)時(shí)比較困難，沒有實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，應(yīng)用需求也不明確，所以后來被人淡忘。

1983年引物合成技術(shù)已經(jīng)成熟。Mullis是Cetus公司專門做DNA測序的研究人員，其正為測序時(shí)DNA模板濃度太低而發(fā)愁。在一個(gè)曲折回復(fù)的山路上行駛時(shí)，Mullis想到了體外DNA復(fù)制可擴(kuò)大模版的量。

DNA復(fù)制需單鏈DNA模板，但DNA一般以雙鏈形式存在。DNA單鏈在細(xì)胞內(nèi)的形成靠異構(gòu)酶等來完成，而在體外可通過加熱使其變性的方法進(jìn)行。Mullis的此設(shè)想被其同事以實(shí)驗(yàn)完成驗(yàn)證。雖然Mullis因此獲得1993年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)，但卻給分子生物學(xué)技術(shù)帶來一次新的技術(shù)革命。

PCR就是通過特定引物與模板的結(jié)合，在引物的3端以DNA聚合酶實(shí)現(xiàn)引物的延長，這樣一個(gè)與模板互補(bǔ)的單鏈就完成了合成過程。如果在互補(bǔ)雙鏈DNA的特定區(qū)域兩端設(shè)計(jì)引物，兩個(gè)引物分別與兩個(gè)單鏈模板互補(bǔ)，那么就可實(shí)現(xiàn)對這個(gè)特定區(qū)域的擴(kuò)增。

為什么DNA復(fù)制這么重要呢？因?yàn)镈NA復(fù)制可使基因這種微觀的概念以宏觀的形式展示給世人（如圖2）。同時(shí)如Mullis所遇到的，即使是微觀的DNA測序，也需要一定的DNA模板濃度。

三、PCR指數(shù)擴(kuò)增原理的講授技巧

在PCR原理講解中其指數(shù)擴(kuò)增（2n）較難以理解?？赏ㄟ^以下單個(gè)雙鏈模板的擴(kuò)增過程來展示PCR的指數(shù)擴(kuò)增原理（圖3）。具體來說，第一輪擴(kuò)增反應(yīng)過后，把模板鏈計(jì)算在內(nèi)，產(chǎn)物增加1倍，為21；第二輪反應(yīng)之后，產(chǎn)物在21基礎(chǔ)上又增加1倍，變成最初產(chǎn)物的22倍。如此循環(huán)，在第n個(gè)反應(yīng)完成之后，產(chǎn)物變成原來產(chǎn)物的2n。

四、PCR在食品微生物檢測中的應(yīng)用講解

講授完P(guān)CR原理后，教師要將學(xué)生思路拉回到第一個(gè)問題，PCR在有害微生物和有益微生物檢測中如何應(yīng)用？

首先，我們可通過PCR對食品中的有害和有益微生物進(jìn)行定性。生物物種DNA序列并非完全相同，如果根據(jù)每種微生物DNA序列設(shè)計(jì)合成特定的引物，通過擴(kuò)增與否可推斷檢測樣品中是否含有此微生物。如細(xì)菌的rDNA（編碼核糖體RNA的DNA）可作為對細(xì)菌進(jìn)行定性的指標(biāo)。

其次，我們可通過PCR對各種微生物進(jìn)行定量，其實(shí)就是通過對產(chǎn)物量的鑒定來推斷初始模板的量。如定性實(shí)驗(yàn)中所講，我們可設(shè)計(jì)特定微生物的特異的引物，將樣品中的微生物混合DNA進(jìn)行擴(kuò)增，特定循環(huán)數(shù)目結(jié)束后，哪種細(xì)菌特異DNA擴(kuò)增產(chǎn)物的量多，哪種細(xì)菌的初始量就多，反之亦然。

其實(shí)PCR在定量方面，還有很多其他更加復(fù)雜的定量應(yīng)用方法，如有兩份樣本，哪份量比較多，哪份量比較少。這時(shí)如何定量？在此情況下可選一個(gè)內(nèi)參，即將數(shù)量比較恒定的細(xì)菌作為內(nèi)參，如可疑菌為沙門氏菌時(shí)，可用普通的金黃色葡萄球菌為內(nèi)參。以PCR方法將兩份樣品中的金黃色葡萄球菌的量均一后，再比較兩份樣本中沙門氏菌DNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的量。通過此方法，可對兩份樣本中沙門氏菌的量進(jìn)行定量。

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