植物抗蟲基因工程的研究進(jìn)展

劉一杰，薛永常

（大連工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，遼寧大連 116000）

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植物抗蟲基因工程的研究進(jìn)展

劉一杰，薛永常

（大連工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，遼寧大連 116000）

摘 要：綜述近年來植物抗蟲基因研究的主要進(jìn)展，對植物抗蟲基因種類、目的基因來源及其編碼蛋白的抗蟲作用機(jī)理進(jìn)行較為系統(tǒng)的闡述，介紹植物抗蟲基因的主要轉(zhuǎn)化方法，針對目前植物抗蟲基因研究中存在的主要問題提出相應(yīng)的解決途徑，展望了植物抗蟲基因工程的未來發(fā)展方向。

關(guān)鍵詞：抗蟲基因；遺傳轉(zhuǎn)化；基因工程

文獻(xiàn)著錄格式:劉一杰，薛永常.植物抗蟲基因工程的研究進(jìn)展［J］.浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，57（6）: 873-878.

近年來，蟲害作為我國農(nóng)林減產(chǎn)的重要原因，越來越受到農(nóng)林從業(yè)者的廣泛重視。根據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織統(tǒng)計(jì)，全球每年因蟲害損失的糧食占世界糧食年總產(chǎn)量的14%左右，嚴(yán)重制約著世界農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展。農(nóng)作物蟲害除造成大量經(jīng)濟(jì)損失外，還會直接導(dǎo)致農(nóng)產(chǎn)品腐爛、霉變等，甚至產(chǎn)生對人體有毒有害的物質(zhì)。我國目前治理蟲害的主要方法是噴施農(nóng)藥或生物殺蟲劑，但此方法不僅造成嚴(yán)重的環(huán)境污染，導(dǎo)致害蟲的抗藥性增強(qiáng)，破壞植被低層生態(tài)平衡，而且農(nóng)產(chǎn)品還會存在對人體有害的大量農(nóng)藥殘留。因此，綠色高效的基因工程技術(shù)已成為當(dāng)前植物抗蟲研究的重要途徑。在提高植物蟲害綠色防控技術(shù)，推動農(nóng)藥使用量零增長等方面意義重大。

1 抗蟲基因種類及來源

1.1 源于微生物的抗蟲基因

1.1.1 Bt基因

蘇云金芽孢桿菌（Bacillusthuringiesis，Bt）的毒蛋白基因，簡稱Bt基因。在芽孢形成時，該基因編碼的δ-內(nèi)毒素（δ-endotoxin），也稱殺蟲晶體蛋白或晶體毒素，對直翅目、膜翅目、鱗翅目、雙翅目、同翅目、鞘翅目和食蟲目等多種昆蟲以及原生動物、線蟲、螨等具有特異性的殺滅作用。殺蟲晶體蛋白（130～160 ku）自身沒有生物活性，當(dāng)其被目標(biāo)昆蟲攝食后，在昆蟲中腸的堿性環(huán)境下被胰蛋白酶水解并激活，形成毒素核心肽段（40～ 70 ku），與昆蟲中腸上皮細(xì)胞的刷狀緣膜上高親和受體結(jié)合，毒素核心肽段部分插入細(xì)胞磷脂雙分子層，使細(xì)胞膜允許離子（Na+，K+等）及寡糖（蔗糖或麥芽糖等）自由通過，影響細(xì)胞滲透壓，導(dǎo)致細(xì)胞裂解死亡，最終滅殺敏感昆蟲。

蘇云金芽孢桿菌中編碼殺蟲晶體蛋白的基因稱為晶體蛋白質(zhì)基因，即Cry基因［1］。自1981年首條Cry基因被成功克隆測序以來［2］，截至2015年12月，已報(bào)道的Bt基因已經(jīng)達(dá)到813種，其中Cry共775種，分屬74個群，Cyt共38種，分屬3個群（http://www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil-Crickmore/Bt/toxins2.html）。近幾年，對鞘翅目和鱗翅目具有特異性滅殺作用的殺蟲晶體蛋白（CryⅤ）以及對線蟲具有特異性滅殺作用的殺蟲晶體蛋白（CryⅥ）也相繼被發(fā)現(xiàn)。

1987年，世界上首例Bt轉(zhuǎn)基因抗蟲煙草和番茄植株分別培育成功［3-5］。但早期的轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲植株抗蟲性普遍較低，殺蟲晶體蛋白的含量只占可溶性蛋白的1/1 000，遠(yuǎn)遠(yuǎn)達(dá)不到農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)種植的要求。1990年P(guān)erlak等［6］通過修飾Bt基因，使其在Bt轉(zhuǎn)基因棉花中的表達(dá)量大大提高，植株抗蟲性明顯增強(qiáng)，從而使Bt轉(zhuǎn)基因抗蟲技術(shù)在農(nóng)林業(yè)中的應(yīng)用成為可能。到目前為止，Bt基因已經(jīng)成功轉(zhuǎn)入玉米、水稻、馬鈴薯、番茄等農(nóng)作物以及楊樹、核桃、蘋果等經(jīng)濟(jì)林木。我國已開始大面積種植Bt轉(zhuǎn)基因抗蟲作物，并在增產(chǎn)增收、降低農(nóng)藥使用量方面獲得了顯著成效。

1.1.2 營養(yǎng)期殺蟲蛋白基因

營養(yǎng)期殺蟲蛋白（vegetative insecticidal proteins，VIPs）是一種新型高效的殺蟲毒蛋白。VIPs在蘇云金桿菌生長的對數(shù)期開始分泌在穩(wěn)定前期達(dá)到最高。目前，VIPs主要由殺蟲作用機(jī)理不同的VIP1，VIP2和VIP3 3種毒蛋白組成。其中VIP1A分為VIP1A（a）和VIP1A（b）2類，VIP2A分為VIP2A（a）和VIP2A（b）2類。VIP1A（a）與VIP2A（a）構(gòu)成二元毒素，對鞘翅目葉甲科昆蟲有特異性滅殺作用。編碼這2種蛋白的基因分別為vip1A和vip2A，約有12%的Bt中存在這2類基因［7］。VIP3A主要包括VIP3A（a），VIP3A（b）和VIP3A（c）。前2種蛋白對鱗翅目昆蟲有廣譜的滅殺活性，編碼蛋白的基因分別為vip3A（a）和vip3A（b）［8-9］。1996年Estruch等［10］發(fā)現(xiàn)并成功對vip3A（a）和vip3A（b）2組同源基因克隆測序。目前，VIP1和VIP22種毒蛋白未進(jìn)行細(xì)胞病理學(xué)和免疫化學(xué)試驗(yàn)，其對敏感昆蟲的滅殺作用機(jī)理也不了解。而VIP3對敏感昆蟲的滅殺作用機(jī)理研究已較為深入。通過細(xì)胞病理學(xué)研究表明，VIP3A蛋白滅殺敏感昆蟲的作用機(jī)理為VIP3A蛋白特異性的與昆蟲中腸內(nèi)的微絨毛結(jié)合，誘發(fā)昆蟲細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致細(xì)胞核溶解，最終殺滅敏感昆蟲，這與殺蟲晶體蛋白的作用機(jī)理完全不同［11］。2015年余曉嬌等［12］報(bào)道了BtNBIC-380菌株的vip3A（a）基因在枯草芽孢桿菌中表達(dá)的蛋白對棉鈴蟲具有滅殺活性。

1.1.3 分泌期殺蟲蛋白基因

分泌期殺蟲蛋白（secreted insecticidal protein，Sip），作為蘇云金芽孢桿菌分泌的一種新型的殺蟲蛋白，目前對其研究還比較少。對敏感昆蟲的滅殺作用機(jī)理也沒有相關(guān)的報(bào)道。但作為Bt殺蟲毒蛋白的重要組成部分，研究者們已經(jīng)開始對其進(jìn)行相關(guān)的研究并取得了部分成果。2012年劉艷杰等［13］從編號為QZL26的Bt野生菌株中成功克隆得到1 038 bp的堿基序列，生物信息學(xué)分析表明，其編碼的345個氨基酸與Sip1A氨基酸序列同源性達(dá)91.83%。2015年張金波等［14］從編號為DQ89的Bt菌株中成功提取并克隆得到sip基因（1 188 bp），并在大腸桿菌中完成表達(dá)。生測結(jié)果顯示，由該基因編碼的蛋白對鞘翅目葉甲科的大猿葉甲具有滅殺活性。針對目前昆蟲抗性增強(qiáng)，新型毒蛋白基因的研究意義重大。

1.1.4 源于其他微生物的抗蟲基因

異戊烯基轉(zhuǎn)移酶（isopentenyltransferases，IPT）是細(xì)胞分裂素合成中的關(guān)鍵酶。將根癌土壤桿菌的IPT基因?qū)霟煵?、番茄中表達(dá)后，可明顯減少煙草夜蛾對植株的損傷。但是，IPT基因的表達(dá)會影響植物生長發(fā)育。

作為第二代抗蟲基因膽固醇氧化酶基因，廣泛存在于鏈霉菌屬、紅球菌屬、假單胞菌屬和短桿菌屬等細(xì)菌中。其編碼的膽固醇氧化酶對敏感昆蟲有滅殺活性，將其基因?qū)霟煵莺头押蟀l(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因植株可以有效抵御煙草夜蛾的危害［15］。膽固醇氧化酶是膽固醇代謝過程中的關(guān)鍵酶，其對敏感昆蟲的滅殺作用機(jī)理是催化分解昆蟲體內(nèi)膽固醇，產(chǎn)生17-酮類固醇與過氧化氫，進(jìn)而導(dǎo)致昆蟲中腸細(xì)胞溶胞死亡，最終滅殺昆蟲。研究表明，膽固醇氧化酶對棉鈴象甲及煙草夜蛾等直翅目、鱗翅目、鞘翅目、同翅目和雙翅目的敏感昆蟲均有滅殺活性［16］。作為一種寬譜殺蟲基因，其可以有效彌補(bǔ)Bt基因抗蟲譜的不足。目前，國內(nèi)對該基因的研究報(bào)道較少［17］。

1.2 源于植物的抗蟲基因

1.2.1 蛋白酶抑制劑基因

蛋白酶抑制劑（proteaseinhibitor，PI）是一種主要存在于植物塊莖、種子等儲藏器官中低分子量的多肽或蛋白質(zhì)。該抑制劑的基因編碼區(qū)較短，一般沒有內(nèi)含子。PI對植物許多重要的生命活動均有調(diào)節(jié)作用，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，其對部分敏感昆蟲有滅殺活性。1987年Hilder等［18］首次成功培育了轉(zhuǎn)豇豆蛋白酶抑制劑基因的抗蟲煙草植株，使蛋白酶抑制劑基因在植物抗蟲基因工程方向應(yīng)用成為可能。蛋白酶抑制劑基因?qū)γ舾欣ハx的滅殺作用機(jī)理是蛋白酶抑制劑被敏感昆蟲侵食后，會與其消化道內(nèi)的蛋白消化酶結(jié)合，抑制其活性，導(dǎo)致昆蟲體內(nèi)蛋白消化酶過量分泌，影響昆蟲消化作用，最終導(dǎo)致昆蟲死亡。植物蛋白酶抑制劑根據(jù)與酶結(jié)合的活性位點(diǎn)不同分為絲氨酸蛋白酶抑制劑、半胱氨酸蛋白酶抑制劑和金屬羧肽酶蛋白酶抑制劑3類。前2種對敏感昆蟲的滅殺作用明顯，相比于其他抗蟲基因（如Bt基因，凝聚素基因等）具有抗蟲譜廣、敏感昆蟲不易產(chǎn)生耐受性、不污染環(huán)境和生物安全性高等優(yōu)點(diǎn)，因而被廣泛研究［19］。

目前蛋白酶抑制劑基因抗蟲技術(shù)已廣泛應(yīng)用于玉米、棉花等農(nóng)作物，并取得了較大進(jìn)展。2015年王江英等［20］成功克隆杜鵑紅山茶半胱氨酸蛋白酶抑制劑（CaCPI）基因轉(zhuǎn)入煙草植株并實(shí)現(xiàn)過量表達(dá)，研究結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)CaCPI基因的煙草植株對蚜蟲的滅殺活性明顯提高，接蟲5 d后蚜蟲累計(jì)死亡率達(dá)90.75%。

1.2.2 a-淀粉酶抑制劑基因

a-淀粉酶抑制劑基因是一種植物中普遍存在的基因，豆科植物和禾谷類植物的儲藏器官中均含有較為豐富的該基因。a-淀粉酶抑制劑基因在植物對抗病蟲害侵染的天然防御系統(tǒng)中至關(guān)重要［21］。a-淀粉酶抑制劑基因?qū)γ舾欣ハx的滅殺作用機(jī)理是該基因表達(dá)的a-淀粉酶抑制劑與敏感昆蟲消化道內(nèi)a-淀粉酶1∶1結(jié)合，有效抑制其活性，阻斷淀粉的水解反應(yīng)，使昆蟲體內(nèi)能量供給不足，通過刺激昆蟲生理反饋調(diào)節(jié)系統(tǒng)，導(dǎo)致昆蟲體內(nèi)消化酶過量分泌，產(chǎn)生厭食反應(yīng)，最終導(dǎo)致昆蟲死亡［22］。2009年王曉婧等［23］成功克隆了a-淀粉酶抑制劑基因sai （360 bp）并完成原核表達(dá)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，該基因表達(dá)的a-淀粉酶抑制劑能有效抑制棉鈴蟲體內(nèi)a-淀粉酶活性及其幼蟲的生長發(fā)育，而對小麥種子內(nèi)的a-淀粉酶活性沒有影響。2015年Bahagiawati等［24］研究了轉(zhuǎn)基因小麥中a-淀粉酶抑制劑與半胱氨酸蛋白酶抑制劑的協(xié)同作用可以有效減緩四紋豆象的生長發(fā)育。

1.2.3 植物凝聚素基因

植物凝聚素是一種活性蛋白，它具有一個或多個可與單糖或寡糖可逆性結(jié)合的非催化結(jié)構(gòu)域，這種結(jié)合不會改變糖基的共價結(jié)構(gòu)。研究發(fā)現(xiàn)，植物凝聚素對鱗翅目、鞘翅目、雙翅目和同翅目等昆蟲具有滅殺活性。由于缺乏相關(guān)研究，其對昆蟲的滅殺作用機(jī)理目前尚不明確，一般認(rèn)為植物凝聚素是通過與昆蟲消化道內(nèi)糖蛋白，如昆蟲中腸紋緣膜細(xì)胞、圍食膜表面或糖基化的消化酶等結(jié)合，阻礙昆蟲的營養(yǎng)吸收，抑制其生長發(fā)育，最終滅殺昆蟲。植物凝聚素在植物界廣泛分布，植物種子和營養(yǎng)器官中的含量最為豐富。

菜豆凝集素是第一種被報(bào)道具有抗蟲作用的植物凝集素，但是其對豆象幼蟲具有滅殺活性的結(jié)論是基于一個錯誤的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，1991年Huesing等［25］發(fā)現(xiàn)這種滅殺活性是由于含有a-淀粉酶抑制劑的緣故。目前，植物凝聚素基因已成功應(yīng)用于植物抗蟲基因領(lǐng)域，如雪花蓮凝聚素基因［26］、豌豆凝聚素基因［27］、半夏凝聚素基因［28］和麥胚凝聚素基因等。雖然植物凝聚素基因?qū)γ舾欣ハx滅殺活性顯著，但部分植物凝聚素如麥胚凝聚素對哺乳動物同樣存在毒性，而雪花蓮凝聚素和豌豆凝聚素對哺乳動物毒性較小，是抗蟲基因工程的重點(diǎn)研究方向。目前雪花蓮凝聚素已成功轉(zhuǎn)入水稻、馬鈴薯、葡萄、甘蔗、番茄、油菜、煙草、向日葵等經(jīng)濟(jì)作物，均表現(xiàn)出較好的抗蟲性［29］。1999年毛雪等［30］通過生測明確鑒定了棉花凝聚素、天南星凝聚素、蓖麻凝聚素以及伴刀豆凝聚素對棉蚜和麥長管蚜的滅殺活性。2015年高勇等［31］對半夏凝聚素結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析和分子模擬，同年，崔彥芹等［32］成功將半夏凝聚素基因pta導(dǎo)入水稻，并獲得相應(yīng)的轉(zhuǎn)基因陽性植株。

1.2.4 源于植物的其他種類抗蟲基因

研究發(fā)現(xiàn)植物中提取的核糖體滅活蛋白、幾丁質(zhì)酶、色氨酸脫羥酶、番茄素、過氧化物酶和豌豆脂肪氧化酶、多酚氧化酶、脂氧化酶等都對敏感昆蟲有滅殺活性。這幾種酶雖然表現(xiàn)出了不同的抗蟲效果，但其對敏感昆蟲的滅殺機(jī)理尚不明確，抗蟲譜及生物安全性還有待實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

1.3 源于昆蟲自身的抗蟲基因

昆蟲神經(jīng)激素是影響昆蟲生長、繁殖、變態(tài)、代謝和行為等生命活動的重要因素。近幾年，研究者已將昆蟲神經(jīng)激素應(yīng)用到蟲害防治中來。但轉(zhuǎn)昆蟲神經(jīng)激素基因抗蟲植物的研究還相對較少。1996年姚斌等［33］成功將改造后的昆蟲特異性神經(jīng)毒素AalT基因轉(zhuǎn)入煙草中并表達(dá)，獲得了對棉鈴蟲有滅殺活性的抗蟲植株。1999年毛利群等［34］成功將昆蟲特異性神經(jīng)毒素基因tox34改造后轉(zhuǎn)入煙草并表達(dá)，生測結(jié)果顯示，該植株對棉鈴蟲的幼蟲有很好的滅殺活性。此外，蝎β型昆蟲毒素對部分敏感昆蟲有明顯的滅殺活性［35］。

2 植物抗蟲基因的遺傳轉(zhuǎn)化方法

植物基因工程研究過程中，將外源基因?qū)胫参锸荏w細(xì)胞，使之發(fā)生永久性的定向遺傳變異是其關(guān)鍵步驟之一。經(jīng)過研究者的不斷探索，目前發(fā)展比較成熟的植物基因遺傳轉(zhuǎn)化方法主要有:農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、基因槍法、顯微注射法、電擊法、聚乙二醇法、花粉管通道法、激光法等多種方法。其中，農(nóng)桿菌介導(dǎo)法和基因槍法是目前應(yīng)用最廣泛的2種方法。

2.1 農(nóng)桿菌介導(dǎo)法

農(nóng)桿菌中存在一種染色體外自主復(fù)制的雙鏈環(huán)狀DNA分子，簡稱Ti質(zhì)粒。這段環(huán)形雙鏈DNA分子上包含可轉(zhuǎn)移DNA區(qū)（T-DNA）、結(jié)合轉(zhuǎn)移區(qū)、毒性區(qū)和復(fù)制起始區(qū)四部分。其中T-DNA可將外源基因?qū)胫参锸荏w細(xì)胞，使其攜帶的目的基因完成表達(dá)，并利用植物細(xì)胞全能性，通過組織培養(yǎng)獲得完整轉(zhuǎn)基因植株，這種方法叫作農(nóng)桿菌介導(dǎo)法。此方法利用天然存在的植物基因遺傳轉(zhuǎn)化體系，通過基因工程手段達(dá)到轉(zhuǎn)基因的目的。農(nóng)桿菌介導(dǎo)法與其他方法相比具有操作簡單、技術(shù)成熟、轉(zhuǎn)化效率高、培養(yǎng)周期短、基因沉默現(xiàn)象少、穩(wěn)定表達(dá)性好等諸多優(yōu)點(diǎn)，此方法還可將大段DNA片段完整轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞中，因此應(yīng)用最為廣泛。但是此方法也有不足之處，由于T-DNA可以在植物基因的任何區(qū)域插入，有可能導(dǎo)致有益基因失活，目前主要用于雙子葉植物基因的遺傳轉(zhuǎn)化，在禾本科植物方面的應(yīng)用仍存在諸多局限［36］。

2.2 基因槍法

基因槍法，又稱基因槍轟擊技術(shù)。其原理是將表面附著核酸分子的金屬（金、鎢等）微粒通過高壓噴射導(dǎo)入受體細(xì)胞，使外源基因與受體細(xì)胞的基因整合表達(dá)的過程。這種方法是1987年由康奈爾大學(xué)的Sanford等［37］提出的一種直接將外源基因?qū)胧荏w細(xì)胞的物理方法。所用惰性金屬微粒不影響植物細(xì)胞正常的生理活動。這種方法具有操作簡便、無宿主限制、獲得轉(zhuǎn)基因植株的周期短、可控性高等優(yōu)點(diǎn)，因此成為除農(nóng)桿菌介導(dǎo)法外最為常用的方法。但此方法也有自身的缺點(diǎn)，如轉(zhuǎn)化效率低、容易出現(xiàn)基因沉默和費(fèi)用較高等。

2.3 聚乙二醇法

聚乙二醇法，也稱PEG法。其原理是使用聚乙二醇、多聚-L-鳥氨酸、磷酸鈣等高pH值的化學(xué)試劑處理去壁的原生質(zhì)體作為轉(zhuǎn)化受體，通過改變細(xì)胞膜通透性使外源DNA分子進(jìn)入受體細(xì)胞完成遺傳轉(zhuǎn)化的一種化學(xué)方法。這種方法因重復(fù)性好、結(jié)果較穩(wěn)定、成本低等優(yōu)點(diǎn)在發(fā)明初期被廣泛應(yīng)用，但此方法由于存在原生質(zhì)體培養(yǎng)難度大、轉(zhuǎn)化效率低、易受基因型限制等明顯的缺點(diǎn)，因此植物抗蟲基因工程方面應(yīng)用較少。

2.4 顯微注射法

顯微注射法是一種使用顯微注射器將遺傳物質(zhì)直接導(dǎo)入受體細(xì)胞，再通過組織培養(yǎng)獲得轉(zhuǎn)基因植株的方法。此方法具有基因?qū)霚?zhǔn)確，克服遠(yuǎn)緣雜交困難等優(yōu)點(diǎn)，但由于其操作難度大、工作效率低、表達(dá)不穩(wěn)定等缺點(diǎn)，自基因槍法出現(xiàn)以來，該方法在植物轉(zhuǎn)基因工程方面逐漸被替代，此方法在動物基因工程方面仍被廣泛應(yīng)用。

2.5 電擊法與激光法

電擊法的原理是在高壓電脈沖下，原生質(zhì)體質(zhì)膜會出現(xiàn)瞬時可逆的小孔，外源基因可從小孔進(jìn)入原生質(zhì)體完成基因轉(zhuǎn)化，通過后期培養(yǎng)獲得轉(zhuǎn)基因植株。激光法與電擊法相似，原理是用固定波長的激光束聚焦后打在受體細(xì)胞表面，引起細(xì)胞膜瞬時可逆性穿孔，外源基因從小孔進(jìn)入受體細(xì)胞完成基因轉(zhuǎn)化，經(jīng)培養(yǎng)后得到完整轉(zhuǎn)基因植株。這2種方法的優(yōu)點(diǎn)是對受體細(xì)胞無毒、受體材料廣泛、轉(zhuǎn)化效率高、可用于瞬間表達(dá)等。但由于操作復(fù)雜，容易對受體細(xì)胞造成物理性損傷，因此發(fā)展較為緩慢。

2.6 花粉管通道法

花粉管通道法，也稱子房注射法，是利用植物有性生殖受精過程中，花粉管形成的從外界到達(dá)子房的通道，將外源基因注入胚囊，轉(zhuǎn)化未形成正常細(xì)胞壁的卵子、合子或早期胚胎細(xì)胞的方法。這種方法免除組織培養(yǎng)的復(fù)雜過程，直接獲得轉(zhuǎn)化后的植株種子，是一種在活體植株上完成基因轉(zhuǎn)化的新途徑。這種外源基因?qū)爰夹g(shù)是由周光宇等［38］建立并發(fā)展起來的。目前國內(nèi)種植面積最廣的轉(zhuǎn)基因抗蟲棉就是用這種方法培育的。此方法的優(yōu)點(diǎn)有易操作、可在活體植株上完成基因轉(zhuǎn)化、受體材料廣泛等。但其也有一定的缺陷，如轉(zhuǎn)化效率較低，植株受精時間及規(guī)律難以控制，外源DNA的結(jié)構(gòu)、濃度及大小對轉(zhuǎn)化結(jié)果影響較大等。除此之外，植物基因的遺傳轉(zhuǎn)化方法還有很多。在研究過程中，除了選擇適合研究對象的單一轉(zhuǎn)化方法外，還可以多種方法結(jié)合使用，實(shí)現(xiàn)基因轉(zhuǎn)化方法的優(yōu)缺點(diǎn)互補(bǔ)。

3 存在問題及應(yīng)對措施

3.1 外源基因的表達(dá)量低

一般而言，抗蟲基因的表達(dá)量與抗蟲效果正相關(guān)?？瓜x基因表達(dá)量不高是實(shí)驗(yàn)過程中普遍存在的問題［39］。目前減少此問題的方法:選擇與受體植物同源性較低的基因，盡量篩選單拷貝個體，避免多拷貝外源基因造成的“基因沉默”現(xiàn)象；采用植物中相應(yīng)的啟動子和增強(qiáng)子構(gòu)建嵌合基因進(jìn)行調(diào)控；利用基質(zhì)結(jié)合區(qū)提高基因表達(dá)量；采用葉綠體轉(zhuǎn)化；在載體上嵌入去甲基化基因序列防止甲基化等。

3.2 昆蟲抗性增強(qiáng)

昆蟲抗性是植物抗蟲轉(zhuǎn)基因工程中存在的嚴(yán)重問題，目前抗蟲基因已廣泛應(yīng)用于農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)中，昆蟲抗性問題也隨之顯現(xiàn)［40］。目前，為了避免或延緩敏感昆蟲的抗性，主要有以下幾種方法:同時應(yīng)用2種或多種抗蟲基因，不僅可有效提高抗蟲性，還可拓寬抗蟲譜［41］；選擇特異的啟動子和損傷誘導(dǎo)啟動子，減少殺蟲時間，盡量縮短敏感昆蟲的適應(yīng)期［42］；建立避難所等［43］。

3.3 生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)性

每一種新型轉(zhuǎn)基因抗蟲植株的引入，都會對其所處生物群落的結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生影響。短時間內(nèi)可能會造成某一物種種群數(shù)量的急劇下降，降低生物多樣性，破壞生態(tài)系統(tǒng)原有的平衡。還有可能引起目標(biāo)害蟲向其他宿主的遷移，對其天敵的種群數(shù)量產(chǎn)生影響。如，墨西哥玉米污染事件和Bt轉(zhuǎn)基因玉米對美國黑脈金斑蝶負(fù)面影響事件等。此外，轉(zhuǎn)基因植株與其他野生植株雜交，引起基因漂移，可能會產(chǎn)生競爭力更強(qiáng)的有害物種，如加拿大抗除草劑油菜事件。目前，對于轉(zhuǎn)基因植物的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)還沒有具體的解決辦法，我國的生物安全研究也多是從生物技術(shù)應(yīng)用角度出發(fā)，因此，建立完備的轉(zhuǎn)基因抗蟲植株生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)防控體系，也是今后轉(zhuǎn)植物抗蟲基因工程研究的重要方向。

4 展望

植物抗蟲基因工程在30多年的發(fā)展歷程中已經(jīng)取得了豐碩的科研成果，轉(zhuǎn)基因抗蟲棉花、玉米、水稻、番茄、馬鈴薯和楊樹等在農(nóng)林業(yè)的廣泛種植，說明這項(xiàng)技術(shù)在逐步走向成熟。探索新型高效的抗蟲基因、明確其抗蟲機(jī)制，增強(qiáng)抗蟲基因的遺傳表達(dá)穩(wěn)定性，發(fā)展新型基因?qū)爰夹g(shù)，采用多種方法避免或減緩敏感昆蟲抗性，完善轉(zhuǎn)基因抗蟲植株的生態(tài)安全保障措施等，將是植物抗蟲基因工程未來的發(fā)展方向。

雖然目前植物抗蟲基因工程各方面還存在諸多問題，但隨著新理論、新技術(shù)、新方法的不斷完善，將會有更多新型優(yōu)良的抗蟲作物從實(shí)驗(yàn)室走向大田。在未來的發(fā)展中，植物抗蟲基因工程必定會在提高植物蟲害綠色防控，推動農(nóng)藥使用量零增長等方面做出巨大貢獻(xiàn)。

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（責(zé)任編輯：張 韻）

中圖分類號：Q943.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：0528-9017（2016）06-0873-06

DOI：10.16178/j.issn.0528-9017.20160624

收稿日期:2016-01-04

作者簡介:劉一杰（1990—），女，河北承德人，碩士研究生，研究方向?yàn)榉肿由飳W(xué)，E-mail: liuyi-1990@163.com。

通信作者:薛永常（1966—），男，教授，博士，研究方向?yàn)榉肿由飳W(xué)，E-mail: xueych@dlpu.edu.cn。