油梨組織培養(yǎng)研究進(jìn)展

羅小燕 申志力 李娟 陳杰忠 趙春香

摘 要 介紹油梨組織培養(yǎng)的國內(nèi)外研究現(xiàn)狀，包括油梨組織培養(yǎng)的莖尖培養(yǎng)、胚培養(yǎng)、愈傷組織培養(yǎng)和原生質(zhì)體培養(yǎng)等方法，總結(jié)油梨組織培養(yǎng)的條件和目前存在的問題，并提出今后的展望。

關(guān)鍵詞 油梨；組織培養(yǎng)；研究進(jìn)展

中圖分類號(hào) S667.9 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Abstract The advance of avocado tissue culture was introduced， including stem tip culture， embryo culture，callus culture and protoplast culture. Culture conditions and main problems in avocado tissue culture were summarized and the development direction in the future was stated.

Key words Avocado； Tissue culture； Research progress

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.08.030

油梨（Persea americana Mill.）又稱牛油果、樟梨、鱷梨屬于樟科熱帶、亞熱帶常綠喬木，是世界上熱帶亞熱帶著名的水果之一[1]。油梨原產(chǎn)于中美洲及墨西哥濕潤地區(qū)，根據(jù)其生長的環(huán)境，油梨主要分為3個(gè)品種群：墨西哥系、西印度系和危地馬拉系[2-7]。而‘Hass油梨品種是目前世界上種植最廣的商業(yè)品種，因其穩(wěn)產(chǎn)、高產(chǎn)、質(zhì)優(yōu)而受到栽培者和消費(fèi)者的歡迎[8]，且以其為主要研究材料進(jìn)行的相關(guān)研究較多[8-12]。油梨營養(yǎng)豐富，富含維生素、蛋白質(zhì)、脂肪，以及富含鈣、鎂、鈉等礦質(zhì)元素；并且對(duì)人體具有醫(yī)療保健作用[13-15]。其種子也富含維生素、蛋白質(zhì)、脂肪，鈉、鉀等礦質(zhì)元素；有較高利用價(jià)值[16-17]。

近年來我國從國外引進(jìn)不少油梨品種[10，18]，油梨產(chǎn)業(yè)的發(fā)展可豐富我國的水果供應(yīng)。油梨?zhèn)鹘y(tǒng)的繁殖方式是實(shí)生苗繁殖，而油梨果實(shí)單一種子，多胚率不高，繁殖材料難得，繁殖系數(shù)低，幼苗生長期長，育苗耗時(shí)[19-20]，限制了油梨的種植和產(chǎn)業(yè)發(fā)展。

油梨的種植和產(chǎn)業(yè)發(fā)展也受病害等因素的影響，如根腐病、炭疽病、日斑病等[21-23]。在自然界中，很多植物受病害侵染而引起病害，造成生長不良，輕則減產(chǎn)或產(chǎn)品質(zhì)量下降，重則造成毀種絕收。在生產(chǎn)上很多果樹都是利用嫁接、分株和扦插等無性繁殖來育苗，這些繁殖體會(huì)將已經(jīng)感染的病毒傳染給后代，代代相傳，長期積累，復(fù)合感染。而莖尖分生組織培養(yǎng)或者熱處理結(jié)合的莖尖培養(yǎng)是脫病毒的主要技術(shù)，以組織培養(yǎng)技術(shù)為基礎(chǔ)的離體快速繁殖是應(yīng)用最廣和最有效的一種育苗技術(shù)。

植物組織培養(yǎng)是利用植物細(xì)胞具有全能性，在無菌的條件下，把離體的植物器官誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織、不定芽、不定根，最后形成完整植株的一種技術(shù)。油梨組織培養(yǎng)技術(shù)具有增殖倍數(shù)大，培養(yǎng)周期短，繁殖快，可脫除病毒，經(jīng)濟(jì)效益好等優(yōu)點(diǎn)；近年來發(fā)展很快[24]。筆者對(duì)近年來國內(nèi)外研究學(xué)者在油梨組織培養(yǎng)方面的研究成果，對(duì)油梨的無性系繁殖、無病害苗木培育、種質(zhì)資源保存和生理生化等方面的研究方法和技術(shù)進(jìn)行了總結(jié)，以期為該領(lǐng)域今后的研究提供參考。

1 油梨外植體組織培養(yǎng)

油梨組織培養(yǎng)技術(shù)所使用的外植體包括莖段（帶頂芽和腋芽）、合子胚和原生質(zhì)體等。根據(jù)所使用的外植體和培養(yǎng)途徑，油梨組織培養(yǎng)技術(shù)可歸類為莖尖培養(yǎng)、胚培養(yǎng)、原生質(zhì)體培養(yǎng)和愈傷組織誘導(dǎo)等。

1.1 莖尖培養(yǎng)

利用莖尖作為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)是油梨無病毒苗的培育方法之一，可以快速繁殖大量的優(yōu)良苗木[25]。離體條件下木本植物不定芽的誘導(dǎo)主要受到基因型、外植體來源和培養(yǎng)基中不同激素配比的影響[25]。木本果樹的老熟枝條作外植體通常攜帶病菌較多，初分化和再分化難，嚴(yán)重影響組織培養(yǎng)的成功率；因而，油梨莖尖培養(yǎng)多以成年油梨樹的半木質(zhì)化嫩枝條或幼胚苗的莖尖作為外植體進(jìn)行培養(yǎng)。

Schaffer等[26]認(rèn)為利用幼嫩莖段為外植體進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)N元素的形式和濃度對(duì)其誘導(dǎo)和增殖效果影響顯著；同時(shí)指出培養(yǎng)環(huán)境中CO2的濃度對(duì)其有一定影響。梁日高等[27]利用7年生的油梨莖段為外植體發(fā)現(xiàn)最適宜的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為1/2 MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+30 g/L白糖+6 g/L卡拉膠（kappa-Carrageenan）（1/2 MS指MS培養(yǎng)基中的大量元素減半），最適宜的增殖培養(yǎng)基是MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+30 g/L白糖+6 g/L卡拉膠；最適宜的生根培養(yǎng)基是1/2 MS+IBA 1.0 mg/L+30 g/L白糖+6 g/L卡拉膠（1/2 MS指MS培養(yǎng)基中的大量元素減半）。且指出可用自來水代替無菌水，白砂糖代替分析純蔗糖，卡拉膠代替瓊脂粉。Barrera-Guerra等[28]利用嫩枝的莖段和幼苗的莖段段作為外植體在MS培養(yǎng)基中進(jìn)行誘導(dǎo)、增殖和生根培養(yǎng)；并且在培養(yǎng)基中添加四環(huán)素（Tetracyclines）、慶大霉素（Gentamicin）、利福平（Rifampicin）等抗生素以更加徹底地滅菌和減少污染，結(jié)果發(fā)現(xiàn)油梨莖尖培養(yǎng)的周期更長，生根率更低。Vega[29]認(rèn)為西印度系的the‘Colin V-33油梨品種的莖尖培養(yǎng)誘導(dǎo)率成功較高，并且提出6-BA和GA3對(duì)莖尖培養(yǎng)影響較大。一般認(rèn)為，采用不同部位（上、中、下）的莖段作外植體時(shí)其誘導(dǎo)率不同，如以‘Nauclea diderrichii幼苗枝條上端的莖段為外植體時(shí)其誘導(dǎo)效果最佳[30]；而針對(duì)油梨不同部位莖段誘導(dǎo)效果則有待做進(jìn)一步的探討。

許多研究表明利用油梨莖段為外植體， 其污染率較大， 原因主要是難以獲得無菌外植體。而利用油梨實(shí)生幼胚苗的莖段，生長勢(shì)較旺盛，帶菌較少，是油梨莖尖組織培養(yǎng)的優(yōu)良材料。

1.2 胚培養(yǎng)

油梨果實(shí)具單一種子，多胚率不高，合子胚（由植物的雌雄配子融合形成的合子繼而發(fā)育形成的有性胚）往往只有一個(gè)。在油梨果實(shí)的整個(gè)發(fā)育過程中其幼果不斷脫落，果實(shí)接近成熟時(shí)其種胚才能存活；若不采取種胚離體培養(yǎng)，就會(huì)降低油梨育種工作的效率[31]。油梨種胚組織培養(yǎng)分為未成熟胚和成熟胚組織培養(yǎng)。油梨種胚培養(yǎng)有助于克服雜交育種中合子胚退化或敗育性等問題，種胚培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展推動(dòng)油梨育種工作的進(jìn)行。目前較多的報(bào)道是利用未成熟的合子胚作為外植體，通過合子胚的早期離體培養(yǎng)能夠獲得雜種后代；在油梨優(yōu)良種質(zhì)保存以及防止種質(zhì)退化等方面有較大的應(yīng)用價(jià)值[32]。較多的學(xué)者利用合子胚為外植體進(jìn)行油梨完整植株誘導(dǎo)，并結(jié)合離體低溫保存技術(shù)進(jìn)行種質(zhì)保存技術(shù)研究。

一般認(rèn)為胚齡是影響油梨幼胚培養(yǎng)成功的關(guān)鍵因素之一。Sken等[31]利用不同胚齡的油梨種胚作為外植體，研究發(fā)現(xiàn)油梨極幼小的種胚在各種的培養(yǎng)基中基本不能生長，在培養(yǎng)基中添加生長調(diào)節(jié)劑效果不明顯；只有6～7周齡或以上的胚才能大量存活且在培養(yǎng)基中添加植物生長調(diào)節(jié)劑其生長速度加快。Rohim等[11]以‘Hass油梨品種種胚為外植體，發(fā)現(xiàn)胚齡是影響胚培養(yǎng)的重要因素，胚齡越小其誘導(dǎo)率越低；胚齡在180～210 d的合子胚誘導(dǎo)率達(dá)100%。因?yàn)橛屠鏄O幼小的種胚在各種培養(yǎng)基中基本不能生長，只有6～7周齡或以上的胚才能大量存活。利用油梨未成熟合子胚來誘導(dǎo)形成體細(xì)胞胚胎并在合適的條件下進(jìn)行“胚性生長”，從而進(jìn)行正常的胚胎發(fā)育并完成其胚胎發(fā)育過程后誘導(dǎo)形成苗[33-34]。一般，油梨合子胚培養(yǎng)較多采用MS（Murashige Skoog）培養(yǎng)基，也有研究者采用B5、1/2 MS等培養(yǎng)基。由于幼胚生長在一個(gè)高滲透壓環(huán)境下，離體培養(yǎng)時(shí)需要高鹽濃度培養(yǎng)基；需要增加蔗糖的濃度[35]。為了探討蔗糖濃度、凝膠劑濃度和培養(yǎng)基類型等對(duì)油梨幼胚培養(yǎng)的影響，Witjaksono Litz等[36]利用油梨未成熟合子胚為外植體，發(fā)現(xiàn)在MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)效果最佳，且添加6～7 g/L凝膠劑和30 g/L蔗糖效果最佳。同時(shí)，在油梨胚培養(yǎng)中為改善其生長環(huán)境除了使用蔗糖外，也有采用脯氨酸（Proline）、谷氨酸鹽（Glutamic acid）等作氮源以增加培養(yǎng)基的銨態(tài)氮濃度。Encina等[37]應(yīng)用二步培養(yǎng)法（在固體、液體培養(yǎng)基交替培養(yǎng)）進(jìn)行胚培養(yǎng)，添加脯氨酸和谷氨酸鹽改善其誘導(dǎo)效果。Raharjo等[20]利用‘Hass油梨品種未成熟合子胚作外植體，其研究發(fā)現(xiàn)在體細(xì)胞胚胎誘導(dǎo)和增殖培養(yǎng)階段添加肌醇（Inositol）、毒秀錠（Picloram）和硫胺素鹽酸（Thiamine hydrochloride）等物質(zhì)有利于促進(jìn)培養(yǎng)物的生長。

溫度和光照條件也是影響胚培養(yǎng)的因素之一，不同果樹品種對(duì)溫光的要求各不相同。對(duì)于油梨種胚組織培養(yǎng)較多的研究學(xué)者認(rèn)為（25±1）℃較合適[34，36-39]，也有人認(rèn)為在27 ℃較適宜[20]。在油梨合子胚培養(yǎng)過程中有的采用光培養(yǎng)，有的采用暗培養(yǎng)，也有人進(jìn)行光暗交替培養(yǎng)。Márquez-Martín等[38]利用光暗交替培養(yǎng)技術(shù)提高油梨合子胚誘導(dǎo)率。

油梨合子胚培養(yǎng)利于克服胚退化和種胚敗育性等問題，提高育種工作的效率。但油梨合子胚培養(yǎng)，會(huì)出現(xiàn)單極生長（只有莖段生長或根生長），頂端或節(jié)點(diǎn)容易壞死等現(xiàn)象[40]。油梨胚胎培養(yǎng)物會(huì)隨著時(shí)間的延長和形態(tài)的改變失去其胚胎的完整性；依據(jù)品種的不同，一般在誘導(dǎo)培養(yǎng)3個(gè)月之后出現(xiàn)此現(xiàn)象[34]。出現(xiàn)兩極生長（莖段和根正常生長）現(xiàn)象的概率大概是0.002%～5%或6%，其概率的大小依品種而異[41]。為解決這一問題Raharjo[11]結(jié)合微芽嫁接技術(shù)培育完整油梨植株，以‘Hass、‘Booth-7、‘Lima Late、‘Lula和‘Waldin4個(gè)品種的油梨未成熟合子胚培養(yǎng)發(fā)育形成的莖段或由莖尖誘導(dǎo)培養(yǎng)形成的莖段為接穗，以‘Bernecker油梨品種實(shí)生苗為砧木進(jìn)行嫁接。發(fā)現(xiàn)嫁接后的成活率達(dá)59%～100%，頂端嫁接和腹嫁接的成活率達(dá)68%～72%；且在嫁接后20～25 d開始生長，其成活率可達(dá)52%～76%。

油梨種胚培養(yǎng)技術(shù)有利于培育無病毒苗木，Sánchez-Romero等[42]提倡油梨育種工作中應(yīng)廣泛使用合子胚誘導(dǎo)技術(shù)；因?yàn)槲闯墒煊屠娣N胚是優(yōu)良的外植體，因其污染率較小、取材較方便和誘導(dǎo)成功率較大。不同油梨品種發(fā)育程度不同的合子胚，對(duì)培養(yǎng)條件的要求不同，這有待研究者進(jìn)一步探討。

1.3 愈傷組織培養(yǎng)

為了獲得最佳的油梨組培材料，有人利用莖段或葉子為外植體并結(jié)合愈傷組織誘導(dǎo)技術(shù)來培育完整的油梨植株。Young等[43]利用‘Lula和‘Waldin油梨品種實(shí)生苗的葉子、腋芽和莖段作為外植體來誘導(dǎo)愈傷組織。發(fā)現(xiàn)油梨葉片的存活率和愈傷組織的誘導(dǎo)率可通過選擇適當(dāng)部位的外植體和調(diào)整其在培養(yǎng)基中的放置位置來優(yōu)化， 合適的培養(yǎng)溫度和適當(dāng)使用生長激素可增強(qiáng)愈傷組織的誘導(dǎo)；適當(dāng)使用GA3和提高培養(yǎng)的溫度可促進(jìn)腋芽的伸長。在光照條件下和使用1.0 mg/L BA可以促進(jìn)愈傷組織分化出芽；但是，利用油梨葉片誘導(dǎo)愈傷組織時(shí)間周期長，成功誘導(dǎo)率也較低，而利用接近葉腋部位的葉柄和帶腋芽的莖段效果較好。

彭民璋等[44]以‘Hass油梨品種的種胚為外植體，誘導(dǎo)形成愈傷組織作為保存材料并研究采用冷藏（8 ℃）、利用多效唑延長繼代時(shí)間、減少繼代次數(shù)等方法；發(fā)現(xiàn)低溫（8 ℃）保存，貯存時(shí)間長約6個(gè)月時(shí)愈傷組織依然具有再分化能力。用0.4 mg/L多效唑?qū)τ屠嬗鷤M織進(jìn)行處理，愈傷組織保存8個(gè)月后依然具有較強(qiáng)的脫氫酶活性和較高的植株再生頻率。Guzma′n-Garc1′a等[45]使用緩慢冷卻法和熔滴玻璃化法，發(fā)現(xiàn)用熔滴玻璃化法處理60 min油梨種胚的再生恢復(fù)能力可達(dá)77.78%～100%；同時(shí)指出原始材料是種質(zhì)離體低溫保存的關(guān)鍵且胚性愈傷組織和體細(xì)胞胚在融化之后依然會(huì)保持較高的再生能力。進(jìn)行離體低溫種質(zhì)保存的好處在于：（1）利于保存從作物改良研究中發(fā)現(xiàn)的優(yōu)良胚系，（2）備份異地種質(zhì)庫[41]。在國內(nèi)外曾有研究者利用離體低溫保存技術(shù)解決此問題， 油梨種質(zhì)離體低溫保存對(duì)于油梨種質(zhì)的保存和培育優(yōu)良品系種群具有重要作用。此外，研究油梨種質(zhì)離體低溫保存技術(shù)，有利于發(fā)展培育優(yōu)良無病害的植株建立優(yōu)質(zhì)油梨種質(zhì)資源庫。

1.4 原生質(zhì)體培養(yǎng)

在國外利用油梨原生質(zhì)體作為外植體誘導(dǎo)，培育油梨完整植株也有相關(guān)報(bào)道。植物原生質(zhì)體在適宜的條件下具有再生成與其親本相近個(gè)體的全能性，可經(jīng)離體培養(yǎng)得到再生植株。借助原生質(zhì)體培養(yǎng)及誘導(dǎo)融合技術(shù)可獲得雜種和多倍體植株， 可有效克服植物有性雜交不親和現(xiàn)象；利于提高果實(shí)產(chǎn)量，改善果實(shí)品質(zhì)，培育新品種[46]。

原生質(zhì)體再生實(shí)驗(yàn)已在蕓香科[47]和薔薇科的蘋果[48]、酸櫻桃[49]和梨子[50]得到應(yīng)用。利用油梨未成熟合子胚進(jìn)行原生質(zhì)體的分離和培養(yǎng)也有報(bào)道。Grosser等[51]利用‘T362油梨品種未成熟合子胚和珠心胚作為外植體通過原生質(zhì)體分離提純、培養(yǎng)、誘導(dǎo)愈傷和再生植株；發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基類型、培養(yǎng)基濃度、培植的密度等對(duì)原生質(zhì)體培養(yǎng)影響顯著，以MS培養(yǎng)基效果較好。研究認(rèn)為影響原生質(zhì)體培養(yǎng)的因素主要有植物基因型、原生質(zhì)體的栽植密度、培養(yǎng)基類型和激素等[46]。

原生質(zhì)體培養(yǎng)技術(shù)要求較高，難度大，而且在我國油梨原生質(zhì)體培養(yǎng)少有報(bào)道。目前還需要經(jīng)過探索和研究，進(jìn)一步形成和完善適合不同油梨基因型的高效培養(yǎng)體系，以縮短原生質(zhì)體培養(yǎng)的周期和促進(jìn)育種工作的進(jìn)行。

1.5 培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基

油梨組織培養(yǎng)過程中，溫度、光照和pH等環(huán)境因子對(duì)組織培養(yǎng)有顯著影響。研究認(rèn)為，油梨組織培養(yǎng)的最佳溫度為（25±1）℃，光照強(qiáng)度為2 000～3 000 lx，光照時(shí)數(shù)為10～16 h/d，pH為5.7～6.0，蔗糖的濃度為25～45 g/L，以30 g/L效果最佳，凝膠劑多使用瓊脂粉[11，20，26-30，34，36-39，44，4，52-53]。但是，Raharjo等[20]把油梨組織培養(yǎng)物放于（27±1）℃環(huán)境下，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)效果更好。Pitekelabou等[30]認(rèn)為把培養(yǎng)物置于（27±2）℃環(huán)境下，培養(yǎng)效果也較好。

培養(yǎng)基類型也是油梨組織培養(yǎng)的重要影響因子之一，大部分學(xué)者以MS、1/2 MS和B5為基本培養(yǎng)基[27-28]；也有人以WPM、改良MS（大量元素減半）為基本培養(yǎng)基[27，30]。為探討培養(yǎng)基類型對(duì)組織培養(yǎng)的影響，Rohim等[11]以‘Hass油梨品種合子胚為外植體，以MS和B5為基本培養(yǎng)基，發(fā)現(xiàn)MS培養(yǎng)基培養(yǎng)效果最佳?？偟膩碚f，在油梨組織培養(yǎng)中，供試品種及其外植體類型不同，不同的培養(yǎng)基類型和培養(yǎng)條件產(chǎn)生的影響不同，效果最佳的為MS培養(yǎng)基。

2 存在的問題

2.1 污染

組織培養(yǎng)過程中造成的污染可分為外源性污染和內(nèi)源性污染， 外源性污染只要操作嚴(yán)格要求，環(huán)境條件嚴(yán)格控制，一般可以控制；而內(nèi)源性污染是最難控制的污染源，主要從外植體的選取以及外植體的消毒等方面控制[54]。同時(shí)，造成污染的病原主要分為細(xì)菌和真菌，細(xì)菌污染在接種1～3 d后就可被發(fā)現(xiàn)；真菌污染的特點(diǎn)是污染部分長有不同顏色的霉菌，在接種3～15 d后才可被發(fā)現(xiàn)[55]，在接種后兩周左右才可判斷外植體能否正常生長；而常用的消毒劑有次氯酸鈉、漂白水、氯化汞[56]。

若污染菌類是從材料周圍長起，則可判定為植物材料自身帶菌引起；也有可能是接種時(shí)材料被污染，接種工具滅菌不徹底導(dǎo)致。如果污染菌類是從培養(yǎng)基以上部分長起，不是在培養(yǎng)基長起，同時(shí)在接種5 d后發(fā)現(xiàn)，就可判定污染是油梨外植體本身的內(nèi)生菌導(dǎo)致。如果污染菌類是零星分散于培養(yǎng)基中，就可確定為人為造成的污染；比如接種用具、培養(yǎng)基滅菌不徹底，接種員操作不正確，開瓶時(shí)間太長，操作中心在人體范圍內(nèi)；培養(yǎng)室環(huán)境不干凈等。如果污染是從培養(yǎng)基以下部分開始生長， 且有從里向外發(fā)展的趨勢(shì)， 就說明是切口引起的污染，原因可能是外植體滅菌之后沒有剪去切口；或雖剪去，但器具本身帶菌[56]。

為減少油梨組織培養(yǎng)過程中產(chǎn)生的污染，一般采用污染較少且生長旺盛的植物部位作為外植體，很多學(xué)者采用未成熟的合子胚、幼胚芽等為外植體[11，20，26-30，33-34，36-40，53]。Barrera-Guerra等[28]利用嫩枝莖段和幼胚芽為外植體，并提出在培養(yǎng)基中添加四環(huán)素、慶大霉素、利福平等抗生素可減少污染。值得注意的是使用抗生素雖有一定的殺菌效果，但是并不是對(duì)每一種菌種都有效[56]。同時(shí)抗生素在不穩(wěn)定的環(huán)境下易分解而失去其活性，而且使用濃度不對(duì)也會(huì)對(duì)外植體產(chǎn)生負(fù)面影響；因此尋找適宜的抗生素已成為重要的課題。

針對(duì)不同污染情況有不同的解決方法，主要采取4個(gè)方面的措施：一是外植體的選擇，選擇帶菌少的外植體。二是選擇適當(dāng)?shù)南痉椒?，常見的消毒劑有次氯酸鈉、乙醇、氯化汞、過氧化氫等。三是對(duì)接種室進(jìn)行空間滅毒。最后是操作人員嚴(yán)格按照無菌操作規(guī)則進(jìn)行操作。

2.2 褐化

油梨為木本植物，次生代謝旺盛，植物體內(nèi)含有較多的酚類和醌類化合物，這些褐色物質(zhì)在培養(yǎng)基中不斷擴(kuò)散積累，抑制其他酶類的活性，毒害培養(yǎng)材料，嚴(yán)重地影響整個(gè)組織培養(yǎng)過程。實(shí)驗(yàn)研究認(rèn)為，外植體的生理狀態(tài)和部位、取材時(shí)間和大小、受傷程度及所用消毒劑等對(duì)褐化有一定程度的影響[57]。謝志亮等[58]指出外植體材料（包括外植體取材時(shí)間、外植體大小、外植體部位和種類、外植體消毒時(shí)間等）、培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件對(duì)褐化有一定影響；同時(shí)，可通過選擇適宜的外植體、預(yù)處理材料、選用適宜的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件、使用防褐劑和連續(xù)轉(zhuǎn)移外植體來減少褐化。在油梨組織培養(yǎng)中常用的方法是在培養(yǎng)基中添加防褐化劑如活性炭、硝酸銀、PVPP（Crosslinking polyvingypyrrolidone）和維生素C（Vitamin C）[59-60]。Encina等[37]以活性炭為添加劑，使得外植體生長狀態(tài)更佳，褐化率減少。使用活性炭在一定程度上可減少褐化，但使用時(shí)要注意控制濃度和使用的時(shí)間，否則會(huì)對(duì)外植體產(chǎn)生不良效果。

雖然一定濃度的防褐化劑可在一定程度上減輕褐化對(duì)培養(yǎng)物的影響，但對(duì)于一些褐化嚴(yán)重的植物則效果不明顯。所以，要從根本上解決此問題就要從褐化產(chǎn)生的生理及分子機(jī)理深入探討。

2.3 組培苗生根難度大

組培苗的生根過程是一個(gè)復(fù)雜的生理生化過程， 一般影響外植體不定根的因素主要有外植體基因型、培養(yǎng)基類型、取材部位、植物生長調(diào)節(jié)劑、培養(yǎng)條件等[61]。油梨組培苗生根難度大主要表現(xiàn)在生根概率低，一些品種難以獲得完整植株，出現(xiàn)單極生長現(xiàn)象。

油梨合子胚培養(yǎng)再生繁殖形成兩極生長的完整植株的概率大概是0.002%～6%，其概率大小依品種而異[52]。Barrera-Guerra等[28]利用莖段為外植體培養(yǎng)在生根階段嘗試了各種處理，發(fā)現(xiàn)其生根的概率為0～20%。Encina等[37]為解決此問題嘗試二步培養(yǎng)法（固態(tài)培養(yǎng)基-液態(tài)培養(yǎng)基-固態(tài)培養(yǎng)基）使得生根率增加到35%～58.3%。油梨是木本植物，其在組培過程中生根較困難，可通過使用不同濃度的IBA和體外微芽嫁接來促進(jìn)生根，同時(shí)注意觀察幼苗的生長情況，Barrera-Guerra等[28]，在外植體培養(yǎng)期間，發(fā)現(xiàn)根的形成和生長較難且嫩枝生長較慢。Raharjo等[52]結(jié)合微芽嫁接技術(shù)來培育完整油梨植株，以組培苗的莖段為接穗，以油梨幼苗為砧木；結(jié)果形成完整植株且成活的概率達(dá)52%～76%。

油梨生根培養(yǎng)存在一定的難度， 同時(shí)也是整個(gè)組織培養(yǎng)過程成功的關(guān)鍵部分之一。因此，誘導(dǎo)帶有高質(zhì)量根系的組培苗是亟待解決的問題。

2.4 移栽成活率不穩(wěn)定

油梨組培苗移栽成活率不高，一是組培苗移栽階段感病嚴(yán)重而加大死亡率，二是組培苗在移栽過程中易斷根。因此，要提高不定根質(zhì)量和組培苗適應(yīng)環(huán)境的能力，提高移栽成活率，才能為實(shí)現(xiàn)油梨產(chǎn)業(yè)化發(fā)展奠定基礎(chǔ)。Martínez-Ferri等[62]在油梨植物生產(chǎn)育苗階段引入菌根劑和施加雞糞，發(fā)現(xiàn)對(duì)油梨植株的生長有積極影響。為提高油梨組培苗的移栽成活率，在移栽前可對(duì)組培苗進(jìn)行煉苗和優(yōu)化移栽基質(zhì)；同時(shí)密切觀察組培苗的長勢(shì)。

3 展望

植物組織培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展在生物科學(xué)研究和應(yīng)用中發(fā)揮重要作用，也在油梨的栽培與生產(chǎn)上得到廣泛的應(yīng)用與研究。通過莖尖培養(yǎng)繁殖無病毒植株，利用胚培養(yǎng)誘導(dǎo)未成熟種胚的發(fā)育與成長；借助離體低溫冷凍保存技術(shù)保存優(yōu)良油梨種質(zhì)和選擇優(yōu)質(zhì)油梨品種。油梨離體培養(yǎng)技術(shù)的迅速發(fā)展和不斷完善，將會(huì)大大提高油梨的育種效率，加快油梨品種改良和油梨產(chǎn)業(yè)化的進(jìn)程。

針對(duì)油梨組織培養(yǎng)存在的問題，目前我國學(xué)者研究甚少，為此我國的研究學(xué)者應(yīng)加大力度重視油梨組織培養(yǎng)的技術(shù)研究體系；形成針對(duì)不同品種的實(shí)用、高效、標(biāo)準(zhǔn)的組培快繁體系。結(jié)合基因工程技術(shù)培育高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、營養(yǎng)價(jià)值高、無病害、樹體矮化、樹形優(yōu)美的油梨新品種；滿足人民日益增長的需求。

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