巴西橡膠樹膠乳和懸浮細(xì)胞中MVA和MEP代謝途徑基因的表達(dá)分析

鄧小敏， 吳紹華， 戴雪梅， 田維敏

( 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所/農(nóng)業(yè)部橡膠樹生物學(xué)重點開放實驗室/省部共建國家重點實驗室培育基地—海南省熱帶作物栽培生理學(xué)重點實驗室， 海南 儋州 571737 )

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巴西橡膠樹膠乳和懸浮細(xì)胞中MVA和MEP代謝途徑基因的表達(dá)分析

鄧小敏， 吳紹華， 戴雪梅， 田維敏*

( 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所/農(nóng)業(yè)部橡膠樹生物學(xué)重點開放實驗室/省部共建國家重點實驗室培育基地—海南省熱帶作物栽培生理學(xué)重點實驗室， 海南 儋州 571737 )

摘要：MVA和MEP代謝途徑是植物類異戊二烯代謝途徑的兩條重要次生代謝途徑。 該研究利用熒光定量PCR技術(shù)，分析了橡膠樹膠乳和橡膠樹花藥愈傷組織來源的懸浮細(xì)胞中MVA代謝途徑和MEP代謝途徑中關(guān)鍵基因的表達(dá)水平，同時分析了茉莉酸的結(jié)構(gòu)類似物冠菌素(coronatine，COR)對懸浮細(xì)胞中HbAACT3，HbHMGR4，HbHMGR5，HbDXS2，HbDXR和HbSQS1基因表達(dá)的調(diào)節(jié)作用。結(jié)果表明：在MVA代謝途徑中，基因HbAACT1，HbAACT2，HbHMGS1，HbHMGS2，HbHMGR1，HbHMGR3，HbMVK，HbPMK，HbMVD1，HbMVD2和IPP下游代謝基因HbIPPI1和HbFDPS1在膠乳中的表達(dá)量要相對高于其在懸浮細(xì)胞中的表達(dá)量，然而橡膠樹懸浮細(xì)胞中MEP代謝途徑基因HbDXS1，HbDXS2，HbDXR，HbCMS1，HbCMS2，HbCMK，HbMCS1，HbMCS2，HbHDS，HbHDR和鯊烯合酶基因HbSQS1的表達(dá)水平要相對高于膠乳。而且COR能不同程度地上調(diào)HbHMGR5，HbHMGR4，HbSQS1，HbDXS2和HbDXR基因的表達(dá)水平。該研究結(jié)果為探索利用橡膠樹懸浮細(xì)胞體系研究次生代謝合成調(diào)控以及生產(chǎn)活性次生代謝產(chǎn)物奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：巴西橡膠樹， 甲羥戊酸， 脫氧木酮糖-5-磷酸， 冠菌素， 鯊烯合酶基因

甲羥戊酸(mavalonic acid，MVA)途徑和脫氧木酮糖-5-磷酸(DXP)或甲基赤蘚醇-4-磷酸(methylerythritol phosphate，MEP)途徑是植物細(xì)胞類異戊二烯代謝途徑中合成異戊烯基焦磷酸(isopenteny lpyrophosphate，IPP)的兩條重要來源。其中，MVA代謝途徑位于細(xì)胞質(zhì)中，以乙酰輔酶A 為代謝原料；而MEP代謝途徑則位于質(zhì)體中，以丙酮酸和甘油醛-3-磷酸為代謝原料(王凌健等，2013；Chow et al，2007,2012)。異戊烯基焦磷酸是合成植物萜類次生代謝物的重要原料，而且異戊烯基焦磷酸的合成和利用效率將直接影響到下游重要次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)率。

巴西橡膠樹是工業(yè)原料天然橡膠的主要來源。乳管細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)——膠乳是合成天然橡膠(順式異戊二烯鏈)的主要場所。天然橡膠生物合成是乳管細(xì)胞中典型的植物類異戊二烯代謝途徑，乳管細(xì)胞中也存在MVA和MEP代謝途徑，其中MVA代謝途徑是膠乳中合成天然橡膠的主要途徑 (Chow et al，2007, 2012)。最近的研究發(fā)現(xiàn)膠乳中除了主要合成天然橡膠分子外，同時還合成一些重要的萜類分子，比如含量較高的角鯊烯 (梅志剛等，2011)(圖1)，并且膠乳中合成角鯊烯的關(guān)鍵基因HbSQS1已被鑒定(張志平等，2014)。

橡膠樹花藥愈傷組織來源的懸浮細(xì)胞培養(yǎng)體系已經(jīng)成功建立。目前主要用于原生質(zhì)體融合和植株再生研究(戴學(xué)梅等，2013)，其用于橡膠樹次生代謝研究還未見報道。在同為天然橡膠合成(反式異戊二烯鏈)的杜仲樹中，已經(jīng)有利用懸浮細(xì)胞生產(chǎn)綠原酸的初步研究(王亞琴等，2008)。同時也有研究表明茉莉酸作為誘導(dǎo)子能誘導(dǎo)重要次生代謝物的合成(孫彬賢等，2000；王煥等，2014)。因此，本文重點研究橡膠樹膠乳和懸浮細(xì)胞中MVA和MEP代謝途徑重要基因的表達(dá)模式，以及在懸浮細(xì)胞中茉莉酸類似物——COR對關(guān)鍵酶編碼基因的表達(dá)調(diào)控作用，為今后利用膠乳和懸浮細(xì)胞研究次生代謝調(diào)控，同時為利用懸浮細(xì)胞生產(chǎn)生物活性物質(zhì)奠定前期實驗基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1 材料與試劑

橡膠樹膠乳采集于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗場的橡膠樹無性系熱研8-79，橡膠樹無性系熱研8-79花藥愈傷組織來源的懸浮細(xì)胞由戴雪梅老師饋贈。本實驗所用生化試劑冠菌素為Sigma分析純，所用試劑盒為天根植物總RNA提取試劑盒，F(xiàn)ermentas cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒，Takara SYBR Premix EX熒光定量PCR試劑盒為，引物為英駿公司合成。

1.2 方法

1.2.1 材料處理將終濃度為1 μm·L-1的茉莉酸生理活性類似物冠菌素 (coronatine，COR) 添加至橡膠樹懸浮細(xì)胞培養(yǎng)液中分別處理8 h，1 d，3 d，5 d和7 d，對照不添加COR，為正常的懸浮細(xì)胞培養(yǎng)液。每個時間點取樣后置于1 000 r·min-1輕柔離心，收集懸浮細(xì)胞放置液氮中速凍并保存于-80 ℃?zhèn)溆谩８钅z后收集膠乳到預(yù)先添加提取液的無RNase污染的離心管中，混勻置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 RNA提取與cDNA合成膠乳樣品和懸浮細(xì)胞樣品的RNA提取利用天根植物總RNA提取試劑盒，參照說明書上方法提取，所提取的RNA經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳確定完整性和無DNA污染，同時利用Nano drop核酸定量儀鑒定RNA的含量和純度，其中OD260/OD280為1.8～2.0，表明所提RNA純度較高，符合后續(xù)實驗要求。cDNA第一鏈合成利用Fermentas cDNA第一鏈反轉(zhuǎn)錄試劑盒參照使用說明書合成。

1.2.3 熒光定量PCR本實驗涉及到的MVA和MEP代謝途徑基因和橡膠樹鯊烯合酶基因HbSQS1的引物序列(表1)主要來源于5篇已報道的文獻(xiàn)(Chow et al，2007, 2012；張志平等，2014；Sando et al，2008a,b)，另外HbMVD1和HbMVD2基因序列來源于NCBI數(shù)據(jù)庫，序列號分別為JN036537和JN036539，其特異性已經(jīng)過序列比對，瓊脂糖電泳和測序分析，均為正確可用。其中，內(nèi)參基因的選擇參照伯樂CFX系列熒光定量PCR儀中的分析軟件說明，選取兩個內(nèi)參基因(Hb18S和HbActin基因)用于分析其他待研究基因的相對表達(dá)量。

表 1　該研究使用的引物信息

續(xù)表1

路徑名Pathwayname基因名Genename引物名稱Primername引物序列(5'-3')Primersequences(5'-3')HbHDSHbHDRHbHDS-qFWGCTGACAAAGCCATTACCCAATHbHDS-qRVCGTGTACCTTCTGGCAAAAGCHbHDR-qFWTTCCTACCAGAAGGTCCCATTACHbHDR-qRVATATCCAACCACTAATTGCAGCTCIPP下游代謝基因和內(nèi)參基因IPPdownstreammetabolicgenesandinternalcontrolgenesHbIPPI1HbIPPI2HbFDPS1HbSQS1Hb18SHbACTINHbIPPI1-qFWACCTTGGTTTAGACTAGTTGTGGACHbIPPI1-qFVAACTCGTTTACAACTGACATTACCAHbIPPI2-qFWACACGTTGAAAAGGGGACACTCHbIPPI2-qFVCCAGACTAAGAATACTGAATGCCGHbFDPS1-qFWTAACCTCTATTGAAGCTCATCCTAGHbFDPS1-qFVTTCAGCGTCATCCAGTCTTTGHbSQS1-qFWGATTTGGCACCAGATGTCCTHbSQS1-qRVGCCAAAACATGCGTGACTTAHb18S-qFWCCATAAACGATGCCGACCAGHb18S-qRVCAGCCTTGCGACCATACTCHbACTIN-qFWGATTCCGTTGCCCAGAAGTCHbACTIN-qFVCACCACTCAGCACAATGTTACC

圖 1　橡膠樹膠乳中MVA和MEP代謝途徑　引自Sando et al，2008a,b， 略有改動。Fig. 1　MVA and MEP metabolic pathways in latex of Hevea brasiliensis This map was draw based on Sando et al, 2008a, b， with some modification.

熒光定量PCR反應(yīng)的反應(yīng)體系為10 μL：水 3 μL，2×Takara SYBR Premix EX Taq 5 μL，正反向引物(10 μm·L-1)各0.5 μL，cDNA模板1 μL。熒光定量PCR反應(yīng)在伯樂CFX系列熒光定量PCR儀上運行，PCR反應(yīng)程序為95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，40個循環(huán)；實驗設(shè)3個重復(fù)。利用儀器自帶分析軟件分析基因的表達(dá)水平(ΔΔCT法)，其中以懸浮細(xì)胞為對照樣品檢測所研究的目標(biāo)基因與內(nèi)參基因的相對表達(dá)量作為目標(biāo)基因的表達(dá)水平。

2結(jié)果與分析

2.1 MVA代謝途徑基因的表達(dá)分析

MVA代謝途徑就是將初始原料蔗糖轉(zhuǎn)化為異戊烯基焦磷酸IPP的代謝途徑，利用橡膠樹在該代謝通路中已發(fā)表的基因表達(dá)檢測引物和新登錄的基因序列設(shè)計的引物，在膠乳和懸浮細(xì)胞中檢測這些基因的表達(dá)模式，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MVA代謝途徑基因HbAACT1，HbAACT2，HbHMGR1，HbHMGR3，HbHMGS1，HbHMGS2，HbMVK，HbPMK，HbMVD1和HbMVD2在膠乳中的表達(dá)量高于其在懸浮細(xì)胞中的表達(dá)量(圖2)。這表明至少與懸浮細(xì)胞相比，橡膠樹乳管細(xì)胞的膠乳中MVA途徑基因的表達(dá)占優(yōu)勢，表明在膠乳中相比MEP代謝途徑，MVA代謝途徑是主要的IPP代謝途徑。而且IPP下游代謝基因HbIPPI1和HbFDPS1在膠乳中的表達(dá)量也高于懸浮細(xì)胞，這些結(jié)果表明膠乳中對蔗糖的轉(zhuǎn)化利用效率可能要高于懸浮細(xì)胞。另外部分MVA代謝途徑基因如HbAACT3，HbHMGR4，HbHMGR5和HbIPPI2在懸浮細(xì)胞中的表達(dá)量卻相對高于其在膠乳中的表達(dá)量，說明MVA代謝途徑部分基因的同源基因在懸浮細(xì)胞中可能也發(fā)揮著重要的作用(圖2)。

2.2 MEP代謝途徑基因的表達(dá)分析

定位于質(zhì)體或葉綠體中的脫氧木酮糖-5-磷酸(DXP)或甲基赤蘚醇-4-磷酸(methylerythritol phosphate, MEP)途徑是將初始原料丙酮酸和甘油醛-3-磷酸轉(zhuǎn)化為異戊烯基焦磷酸IPP。同樣地，利用橡膠樹該代謝通路中已發(fā)表的基因表達(dá)檢測引物和新登錄的基因序列設(shè)計的引物，在膠乳和懸浮細(xì)胞中檢測這些基因的表達(dá)模式，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MEP代謝途徑基因HbDXS1，HbDXS2，HbDXR，HbCMS1，HbCMS2，HbCMK，HbMCS1，HbMCS2，HbHDR和HbHDS在懸浮細(xì)胞中的表達(dá)量均高于其在膠乳中的表達(dá)量(圖3)。這說明懸浮細(xì)胞在離體培養(yǎng)條件下MEP代謝途徑基因的表達(dá)相比MVA代謝途徑基因更占優(yōu)勢，懸浮細(xì)胞可能更傾向于利用MEP途徑生產(chǎn)其所需的IPP原料。同時對IPP下游代謝基因鯊烯合酶基因HbSQS1的表達(dá)檢測發(fā)現(xiàn)其在懸浮細(xì)胞中的表達(dá)量也高于其在膠乳中的表達(dá)量(圖3)，這些結(jié)果說明膠乳系統(tǒng)中由于將IPP主要用于合成天然橡膠，一些其他的萜類化合物合成酶基因如鯊烯合酶基因的表達(dá)可能會受到一定程度的抑制。然而懸浮細(xì)胞因為不能合成橡膠，其IPP代謝流將轉(zhuǎn)向其他代謝分支，鯊烯合酶基因HbSQS1的表達(dá)量可能由此升高，以上結(jié)果表明懸浮細(xì)胞中的兩條IPP代謝途徑與膠乳系統(tǒng)相比進(jìn)行了調(diào)整，使得MEP代謝途徑可能成為優(yōu)勢代謝途徑，并且同時也加強了合成下游次生代謝物比如角鯊烯的鯊烯合酶基因的表達(dá)。

圖 2　橡膠樹膠乳和懸浮細(xì)胞中MVA代謝途徑基因的表達(dá)分析　LT代表膠乳； SUS代表橡膠樹花藥愈傷組織來源的懸浮細(xì)胞。下同。Fig. 2　Expression analysis of genes involved in MVA metabolic pathway in latex and suspension cells of Hevea brasiliensis　LT represents latex, SUS represents suspension cells of Hevea brasiliensis. The same below.

圖 3　橡膠樹膠乳和懸浮細(xì)胞中MEP代謝途徑基因的表達(dá)分析Fig. 3　Expression analysis of genes involved in MEP pathway in latex and suspension cells of Hevea brasiliensis

2.3 COR對橡膠樹懸浮細(xì)胞中MEP代謝途徑關(guān)鍵基因和MVA代謝途徑中優(yōu)勢表達(dá)基因的影響

茉莉酸及其結(jié)構(gòu)類似物被證明通過上調(diào)植物次生代謝物合成關(guān)鍵酶基因的表達(dá)，進(jìn)而誘導(dǎo)次生代謝物的合成(王煥等，2014；魏潔書等，2014)。本研究分析茉莉酸的活性結(jié)構(gòu)類似物COR對橡膠樹懸浮細(xì)胞中MEP代謝途徑關(guān)鍵基因HbDXS1，HbDXS2和HbDXR，MVA代謝途徑中上調(diào)表達(dá)的基因HbAACT3，HbHMGR4和HbHMGR5，以及角鯊烯合成途徑重要基因HbSQS1表達(dá)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，1 μm·L-1COR對HbHMGR5基因表達(dá)的誘導(dǎo)最強，其次是HbHMGR4基因，而對HbSQS1，HbDXS2和HbDXR基因的誘導(dǎo)作用相對較弱。HbAACT3基因的表達(dá)呈現(xiàn)“振蕩表達(dá)模式”，其誘導(dǎo)作用也較弱(圖4)。這表明COR對橡膠樹懸浮細(xì)胞MEP代謝通路關(guān)鍵基因具有一定程度的誘導(dǎo)作用，而且COR對懸浮細(xì)胞中MEP和MVA代謝通路內(nèi)部分基因都能誘導(dǎo)表達(dá)，不局限于特定誘導(dǎo)或調(diào)控其中一種代謝通路。通過對這兩條代謝通路基因的誘導(dǎo)，特別是誘導(dǎo)鯊烯合酶基因HbSQS1的表達(dá)，COR很有可能有助于提高橡膠樹懸浮細(xì)胞中角鯊烯或其他次生代謝物質(zhì)的合成。

3討論

橡膠樹乳管是橡膠樹樹皮中的一種特化組織，具有抵御外界刺激的作用，因此是一種重要的保護(hù)組織。膠乳是乳管中的細(xì)胞質(zhì)組分，其中主要合成天然橡膠分子(何康和黃宗道，1987)。膠乳中雖然存在MEP代謝途徑基因表達(dá)，但是MVA代謝途徑仍然是膠乳中合成天然橡膠分子的主要途徑(Chow et al，2007, 2012)。橡膠樹花藥愈傷組織來源的懸浮細(xì)胞體系實驗系統(tǒng)已經(jīng)成功建立，但尚不清楚MVA代謝途徑在橡膠樹懸浮細(xì)胞中是否也是主要異戊二烯代謝途徑。本研究對MVA和MEP代謝途徑基因在膠乳系統(tǒng)和懸浮細(xì)胞系統(tǒng)中的表達(dá)水平進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)了新的現(xiàn)象：與膠乳系統(tǒng)不同，體外離體培養(yǎng)的橡膠樹懸浮細(xì)胞中MEP代謝途徑基因的表達(dá)量比MVA代謝途徑基因的表達(dá)量高，說明不是所有的組織都主要采用MVA代謝途徑來生產(chǎn)IPP原料分子，懸浮細(xì)胞作為離體組織細(xì)胞有它自身的內(nèi)在特征，利用這一體系進(jìn)行實驗需要先了解這個體系的本身特征，而不能照搬已有的認(rèn)識。因此，本研究有助于對橡膠樹懸浮細(xì)胞和膠乳中差異代謝途徑特征的認(rèn)識，對其他植物懸浮細(xì)胞體系的研究和利用也具有一定的借鑒意義。

懸浮細(xì)胞已經(jīng)被用來研究和生產(chǎn)重要次生代謝產(chǎn)物(孫彬賢等，2000；王亞琴等，2008)。為提高所需次生代謝物質(zhì)的含量需要添加各種誘導(dǎo)物，其中茉莉酸及其類似物是廣泛使用的誘導(dǎo)劑，能夠促進(jìn)次生代謝物合成基因的表達(dá)，并提高其含量。如茉莉酸能促進(jìn)南方紅豆杉(Taxuschinensisvar.meirei)懸浮細(xì)胞中抗癌物質(zhì)紫杉醇的積累(孫彬賢等，2000)。本研究分析了茉莉酸活性結(jié)構(gòu)類似物——COR對在橡膠樹懸浮細(xì)胞中優(yōu)勢表達(dá)和一些關(guān)鍵酶編碼基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)COR能同時誘導(dǎo)MEP和MVA代謝途徑的基因， 表明這種誘導(dǎo)效應(yīng)不僅僅局限于某一個基因或某一類代謝途徑，這樣可能更有利于增強植物的次生代謝。因此相比某一特定次生代謝產(chǎn)物的積累，茉莉酸及其結(jié)構(gòu)類似物可能更多的是一種通用的促進(jìn)劑或誘導(dǎo)劑。

圖 4　COR對MEP代謝途徑關(guān)鍵基因和其它在懸浮細(xì)胞中富集表達(dá)基因的調(diào)節(jié)Fig. 4　Regulatory effects of COR on expression of key genes involved in MEP metabolic pathway or enriched expressed genes in suspension cells

角鯊烯雖然在膠乳中的含量已被測定，但是膠乳中提取利用該物質(zhì)目前還有一定的難度。而橡膠樹懸浮細(xì)胞也檢測到鯊烯合酶基因HbSQS1的表達(dá)，同時也受COR誘導(dǎo)，這些實驗結(jié)果將為利用懸浮細(xì)胞體系生產(chǎn)角鯊烯等活性次生代謝物質(zhì)奠定重要的前期研究基礎(chǔ)。

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Expression analysis of MVA and MEP metabolic pathways genes in latex and suspension cells ofHeveabrasiliensis

DENGXiao-Min，WUShao-Hua，DAIXue-Mei，TIANWei-Min*

( Key Laboratory for Rubber Biology, Ministry of Agriculture/State Key Laboratory Incubation Base for Cultivation and Physiology of Tropical Crops/Rubber Research Institute, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences,Danzhou571737,China)

Abstract:The MVA and MEP metabolic pathways are two important plant isoprenoid metabolic pathways in plants. The expression of genes respectively in MVA and MEP secondary metabolic pathways were analyzed in the latex and suspension cells from anther-derived callus of Hevea brasiliensis by using qRT-PCR technology. In addition, expression changes of HbAACT3, HbHMGR4, HbHMGR5, HbDXS2, HbDXR and HbSQS1 genes were further analyzed in the suspension cells under COR treatment. The results demonstrated that expressions of HbAACT1，HbAACT2，HbHMGS1，HbHMGS2，HbHMGR1，HbHMGR3，HbMVK，HbPMK，HbMVD1，HbMVD2 in MVA metabolic pathway and HbIPPI1 and HbFDPS1 genes involved in IPP utilization were relatively higher in latex than that in suspension cells, while HbDXS1，HbDXS2，HbDXR，HbCMS1，HbCMS2，HbCMK，HbMCS1，HbMCS2，HbHDS and HbHDR in MEP metabolic pathway and HbSQS1 were relatively higher in suspension cells than that in latex. Moreover, HbHMGR5, HbHMGR4, HbSQS1, HbDXS2 and HbDXR genes were induced highly or to some degree in suspension cells by COR application. This study lays a foundation for further utilization of suspension cells to analyze secondary metabolism regulation as well as to produce bioactive compounds from anther-derived callus of Hevea brasiliensis in the future.

Key words:Hevea brasiliensis， mavalonic acid， methylerythritol phosphate， coronatine， squalene synthase

中圖分類號：Q945.4，Q786

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1000-3142(2016)04-0449-07

作者簡介：鄧小敏 (1985-)， 男， 湖北荊州監(jiān)利人， 博士研究生， 助理研究員， 主要從事橡膠樹分子生物學(xué)和次生代謝調(diào)控研究， (E-mail) dxmbio822@163.com。*通訊作者： 田維敏，博士，教授，主要從事橡膠樹發(fā)育生物學(xué)研究，(E-mail)wmtian@163.com。

基金項目：國家自然科學(xué)基金(31170642)；中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所基本科研業(yè)務(wù)費(1630022015010)[Supported by the National Natural Science Foundation of China(31170642); the Fundamental Research Fund for Rubber Research Institute, CATAS(NO.1630022015010)]。

*收稿日期:2015-10-13修回日期： 2015-12-08

DOI:10.11931/guihaia.gxzw201510013

鄧小敏，吳紹華，戴雪梅，等. 巴西橡膠樹膠乳和懸浮細(xì)胞中MVA和MEP代謝途徑基因的表達(dá)分析[J]. 廣西植物， 2016， 36(4)：449-455

DENG XM，WU SH, DAI XM， et al. Expression analysis of MVA and MEP metabolic pathways genes in latex and suspension cells ofHeveabrasiliensis[J]. Guihaia， 2016， 36(4)：449-455