響應(yīng)面法優(yōu)化麻瘋樹花粉離體萌發(fā)培養(yǎng)基的研究

方志榮， 王勝華， 陳　放*, 劉　慶

( 1. 四川大學 生命科學學院, 成都 610064; 2. 中國科學院成都生物研究所,成都 610041； 3. 西昌學院 動物科學學院, 西昌 615000 )

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響應(yīng)面法優(yōu)化麻瘋樹花粉離體萌發(fā)培養(yǎng)基的研究

方志榮1,2,3， 王勝華1， 陳放1*, 劉慶2

( 1. 四川大學 生命科學學院, 成都 610064; 2. 中國科學院成都生物研究所,成都 610041； 3. 西昌學院 動物科學學院, 西昌 615000 )

摘要：麻瘋樹因其種子含油率較高，種子油提煉的生物柴油可部分替代汽油，而成為一種極具潛能的能源作物，但由于產(chǎn)量低，麻瘋樹在熱帶、亞熱帶的發(fā)展受到極大限制。雜交育種是提高產(chǎn)量的重要手段，雜交親本花粉生活力的高低直接影響到育種的成效。因此，尋求麻瘋樹離體花粉萌發(fā)的最適培養(yǎng)基配方，探明花粉萌發(fā)培養(yǎng)基中各主要培養(yǎng)基成分間的交互作用對生產(chǎn)上麻瘋樹雜交結(jié)實率和種子產(chǎn)量的提高具有重要意義。該研究以麻瘋樹開花初期雄花上花藥剛散粉時的成熟花粉粒為材料，采用Box-Behnken設(shè)計(Box-Behnken design, BBD)的響應(yīng)面法，對麻瘋樹花粉離體萌發(fā)培養(yǎng)基中各主要培養(yǎng)基成分的濃度配比及各主要培養(yǎng)基成分的交互作用進行了研究。以花粉萌發(fā)率為響應(yīng)指標，建立了4種營養(yǎng)成分(蔗糖、硼酸、硝酸鈣、硝酸鉀)與花粉萌發(fā)率的響應(yīng)面模型，并對各主要培養(yǎng)基成分的濃度配比進行了優(yōu)化。通過R軟件進行響應(yīng)面分析的結(jié)果表明: 4因素對花粉萌發(fā)率的影響順序為蔗糖>硼酸>硝酸鈣>硝酸鉀；蔗糖與硼酸、蔗糖與硝酸鈣、蔗糖與硝酸鉀之間的交互作用顯著。響應(yīng)面建模優(yōu)化后的最佳培養(yǎng)基為13.77%蔗糖+32.14 mg·L-1硼酸+22.21 mg·L-1硝酸鈣+19.95 mg·L-1硝酸鉀+200 mg·L-1硫酸鎂，在此條件下的理論萌發(fā)率為99.73%。采用此培養(yǎng)基成分配比得到麻瘋樹花粉離體試驗萌發(fā)率為98.97%，與理論響應(yīng)值相吻合，同時也表明利用BBD設(shè)計的響應(yīng)面模型進行麻瘋樹花粉離體萌發(fā)培養(yǎng)條件優(yōu)化方法的有效性。

關(guān)鍵詞：麻瘋樹, Box-Behnken設(shè)計, 響應(yīng)面法, 花粉活力, 離體花粉萌發(fā), 傳粉生態(tài)學

麻瘋樹(Jatrophacurcas)別名羔桐、臭油桐、黃腫樹、小桐子、假白欖、假花生，為大戟科( Euphorbiaceae)麻瘋樹屬(Jatropha)植物，多年生落葉灌木或小喬木。麻瘋樹的種子含油率為60%～70%，種子油可以提煉高級生物柴油，所提煉的生物柴油可部分替代汽油，是一種極具潛能的能源作物(Becker & Makkar, 2008)。它具有很強的抗旱、耐貧瘠、生長速度快的特性，在我國熱帶、亞熱帶有較大面積的種植和野生分布，主要生長在云南、四川、廣西、海南(林娟等，2004)。然而由于產(chǎn)量低等原因，現(xiàn)存的麻瘋樹處于野生或半野生狀態(tài)，麻瘋樹的發(fā)展遇到了瓶頸(Becker & Makkar, 2008)。而雜交育種是提高產(chǎn)量的重要手段，雜交親本花粉生活力的高低直接影響到育種的成效?；ǚ垭x體萌發(fā)是測定花粉活力的有效方法之一，而探索麻瘋樹花粉離體萌發(fā)的最佳條件,可為花粉活力測定提供有效方法,也可為促進雜交結(jié)實、制定提高麻瘋樹產(chǎn)量措施提供理論依據(jù)。B-K試液(Brewbaker & Kwack ,1963)被廣泛用于花粉的離體培養(yǎng)，但這一培養(yǎng)基成分并不完全適合麻瘋樹離體花粉的培養(yǎng)。不同學者對這一培養(yǎng)基進行了優(yōu)化，優(yōu)化后的效果并不十分理想(Li et al, 2010; Abdelgadir et al, 2012；劉波洋等，2013)。因此，優(yōu)化培養(yǎng)基成分中蔗糖、硼酸、硝酸鈣、硝酸鉀等的濃度配比，對提高麻瘋樹離體花粉的萌發(fā)率具有重要意義。

Box-Behnken試驗設(shè)計(Box-Behnken design, BBD) 是一種三水平的部分因子設(shè)計為響應(yīng)面法 (Response surface methodology, RSM)的一種；其最大的優(yōu)點是能將多個變量與響應(yīng)值建立二次多項回歸分析模型，并對模型進行分析，最終優(yōu)化該響應(yīng)值(Annadurai, 2000)。李淑娟等(2009)利用響應(yīng)面法優(yōu)化了白蠟屬花粉離體萌發(fā)培養(yǎng)基，通過響應(yīng)面試驗與正交試驗的結(jié)果比較，證實利用BBD 響應(yīng)面模型是一種行之有效的優(yōu)化花粉離體萌發(fā)培養(yǎng)基的方法。該方法除了能得到花粉離體培養(yǎng)基各營養(yǎng)元素的極值濃度外，還能確定各因素間的交互作用。本研究以B-K試液(Brewbaker & Kwack,1963)為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，對影響離體花粉萌發(fā)的不同成分進行單因素試驗，試驗結(jié)果通過SPSS軟件比較各因素不同濃度下花粉萌發(fā)率和花粉管長度，進而篩選出影響麻瘋樹花粉離體萌發(fā)的主要因素。采用Box-Behnken試驗設(shè)計，不同培養(yǎng)基成分作為自變量，以花粉萌發(fā)率為響應(yīng)值將試驗結(jié)果進行響應(yīng)面分析和培養(yǎng)基配方的優(yōu)化；旨在尋求麻瘋樹花粉萌發(fā)的最適培養(yǎng)基配方，以期探明花粉萌發(fā)培養(yǎng)基中各主要培養(yǎng)基成分的最佳濃度及各主要培養(yǎng)基成分間的交互作用；提高雜交結(jié)實率，為確定麻瘋樹科學管理措施提供一定理論依據(jù)；為其它試驗中各參數(shù)的優(yōu)化提供參考。

1材料與方法

1.1 材料

于西昌市黃水鄉(xiāng)洼垴村(海拔為1 473 m； 27°32′51″ N, 102°11′44″ E)采集帶有處于開花初期的麻瘋樹花苞的枝條(王潔等，2013)，置于有冰袋的冰盒中，帶回實驗室。在室溫下水培，收集剛開裂花藥中的成熟花粉粒用于離體花粉的萌發(fā)試驗(權(quán)秋梅等，2007)。

1.2 方法

1.2.1 試驗設(shè)計單因素試驗作以下設(shè)置，其余因子均取B-K試液中的最適值(Brewbaker & Kwack ,1963)。蔗糖濃度梯度分別為0、5%、10%、15%、20%、30%；硼酸(H3BO3)濃度梯度分別為0、5、10、20、30、40、50、100、150 mg·L-1,硝酸鈣[(Ca(NO3)2·4H2O[濃度梯度分別為0、5、10、20、30、40、50、100、200、300 mg·L-1；硫酸鎂(MgSO4·7H2O)濃度梯度分別為0、5、10、20、30、40、50、100、200、300 mg·L-1；硝酸鉀(KNO3)濃度梯度分別為0、5、10、20、30、40、50、100、150 mg/L，記錄各處理條件下離體花粉的萌發(fā)率和花粉管長度。用SPSS19.0軟件進行多重比較分析后確定在pH值為5.5、黑暗培養(yǎng)溫度為25 ℃的條件下，蔗糖、硼酸、硝酸鈣、硝酸鉀4因素為影響麻瘋樹花粉萌發(fā)率的主要因素。自變量蔗糖(X1)、硼酸(X2)、硝酸鈣(X3)、硝酸鉀(X4)的試驗水平以-1、1進行編碼，采用Box-Behnken方法進行設(shè)計，共30個試驗點。試驗因素、水平編碼如表1所示，Box-Behnken試驗設(shè)計方案與結(jié)果見表2。

表 1　Box-Behnken試驗設(shè)計分析因素與水平編碼

1.2.2 試驗方法用液體培養(yǎng)法培養(yǎng)花粉，液體培養(yǎng)基中MgSO4·7H2O的濃度參照BK試液[10% 蔗糖，100 mg·L-1H3BO3，300 mg·L-1Ca(NO3)2·4H2O，200 mg·L-1MgSO4·7H2O，100 mg·L-1KNO3](Brewbaker & Kwack ,1963)，其余成分及濃度見表2，并在液體培養(yǎng)基中加入2%的瓊脂粉。用玻璃棒蘸取少量預熱的培養(yǎng)基，將其滴在蓋玻片上，約1 cm2，要求培養(yǎng)基均勻而平坦地分布在蓋玻片上， 將少量花粉粒均勻地撒在培養(yǎng)基上。在凹形載玻片中央滴一滴純水，滴管吸取少量培養(yǎng)基加在凹孔邊緣使成一圈，將蓋玻片蓋在凹孔上(有花粉粒的一面朝下)，讓凹孔邊緣的培養(yǎng)基把蓋玻片固定、密封(秦家順，1994)。將制作好的載玻片放入預先放有濕潤濾紙的有蓋培養(yǎng)皿中，于25 ℃生化培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)1 h(花粉萌發(fā)率和花粉管長度達到最大的最短時間，此后萌發(fā)率和花粉管長度不再增加)，保持培養(yǎng)皿濾紙濕潤。取出載玻片置于顯微鏡下觀察，每塊載玻片觀察6個以上的視野，以花粉管長度大于或等于花粉直徑為花粉萌發(fā)的標準，統(tǒng)計每個視野萌發(fā)花粉粒數(shù)和花粉?？倲?shù)。花粉萌發(fā)率的計算：花粉萌發(fā)率(%)=萌發(fā)花粉粒數(shù)/花粉總粒數(shù)×100%。每處理3次重復，求其平均值作為后面響應(yīng)面分析和培養(yǎng)基優(yōu)化的依據(jù)。

表 2　Box-Behnken試驗方案與結(jié)果 (N=3)

1.2.3 建模、優(yōu)化和驗證 采用R軟件中的lm函數(shù)對表2的結(jié)果進行二次多項回歸擬合和方差分析。利用RSM函數(shù)進行響應(yīng)面的分析和作圖。用canonical.path函數(shù)對響應(yīng)面模型進行優(yōu)化可得到最佳的離體萌發(fā)培養(yǎng)基配方。采用此培養(yǎng)基配方進行麻瘋樹離體萌發(fā)試驗，得到的結(jié)果與響應(yīng)面法優(yōu)化所得的理論值進行比較以驗證配方的可行性。

2結(jié)果與分析

2.1 模型的建立與分析

基于Box-Behnken試驗設(shè)計及結(jié)果見表2。應(yīng)用lm函數(shù)，將表2 的試驗數(shù)據(jù)用R軟件進行二次多項回歸擬合，分析結(jié)果見表3。

表 3　二次多項回歸模型的方差分析

注： ***表示差異顯著性水平(P<0.001)，**表示差異顯著性水平(0.001≤P<0.01)，*表示差異顯著性水平(0.01≤P<0.05)。

Note：*** means significant differences atP<0.001,** means significant differences at 0.001≤P<0.01, * means significant differences at 0.01≤P<0.05.

2.2 花粉萌發(fā)影響因素交互作用分析

利用RSM函數(shù)，將上述結(jié)果用R軟件進行分析，并繪制響應(yīng)面圖，以直觀的反應(yīng)在固定兩個因素的情況下，另兩個因素對麻瘋樹花粉萌發(fā)率的影響。結(jié)果見圖1。由圖1、圖2和圖3可知，當蔗糖濃度在10%～20%時，麻瘋樹花粉的萌發(fā)率隨蔗糖濃度的增加均表現(xiàn)為低-高-低的變化趨勢，而且這種趨勢不隨硼酸、硝酸鈣和硝酸鉀濃度的變化而改變，可見4個因素中蔗糖對花粉萌發(fā)的作用最顯著。另一方面，蔗糖與硼酸、蔗糖與硝酸鈣、蔗糖與硝酸鉀濃度都高或都低時，花粉萌發(fā)率較低;但是二者處于中間濃度時卻表現(xiàn)出較高萌發(fā)率。這表明蔗糖與硼酸、蔗糖與硝酸鈣、蔗糖與硝酸鉀之間都存在明顯的交互作用，表現(xiàn)為互補效應(yīng)。由圖4、圖5可知，當蔗糖濃度一定時，麻瘋樹離體花粉萌發(fā)率隨硼酸濃度的增加而增加，但是硼酸與硝酸鈣、硼酸與硝酸鉀的交互作用不明顯，具體表現(xiàn)為，當二者濃度達到最大時，萌發(fā)率不會顯著下降。這進一步說明硼酸也是決定麻瘋樹離體花粉萌發(fā)率的另一種主要因素。由圖6可知，當蔗糖和硼酸濃度一定時，硝酸鈣與硝酸鉀的交互作用不明顯，具體表現(xiàn)在二者濃度都高或都低時萌發(fā)率不會顯著下降。

圖 1　Y=f(x1,x2) 的響應(yīng)面　X1. 蔗糖濃度(%);X2. 硼酸濃度(mg·L-1); Y. 花粉萌發(fā)率(%)。下同。Fig. 1　Responsive surfaces of Y=f(x1,x2)　 X1 . Concentration of sucrose(%); X2. Concentration of boric acid (mg·L-1); Y. Percentage of pollen germination(%). The same below.

圖 2　Y=f(x1,x2) 的響應(yīng)面　 X3. 硝酸鈣濃度(mg·L-1)。下同。Fig. 2　Responsive surfaces of Y=f(x1,x2)　 X3. Concentration of calcium nitrate (mg·L-1). The same below.

圖 3　Y=f(x1,x2) 的響應(yīng)面　X4. 硝酸鉀濃度(mg·L-1)。 下同。Fig. 3　Responsive surfaces of Y=f(x1,x2)　X4. Concentration of potassium nitrate (mg·L-1). The same below.

圖 4　Y=f(x1,x2) 的響應(yīng)面　Fig. 4　Responsive surfaces of Y=f(x1,x2)

圖 5　Y=f(x1,x2) 的響應(yīng)面Fig. 5　Responsive surfaces of Y=f(x1,x2)

圖 6　Y=f(x1,x2) 的響應(yīng)面　Fig. 6　Responsive surfaces of Y=f(x1,x2)

2.3 反應(yīng)條件的優(yōu)化與模型驗證

用canonical.path函數(shù)對上述響應(yīng)面模型進行優(yōu)化，得到萌發(fā)率最高時的培養(yǎng)基組合為蔗糖13.77%+硼酸32.14 mg·L-1+硝酸鈣22.21 mg·L-1+硝酸鉀19.95 mg·L-1+硫酸鎂 200 mg·L-1，在此條件下的理論萌發(fā)率為99.73%。用此培養(yǎng)基配方進行離體花粉培養(yǎng)，重復3次，實際測得的3次萌發(fā)率為99.3%，98.7%，98.9%，平均萌發(fā)率為98.97%，試驗萌發(fā)率與理論萌發(fā)率的相對誤差RSD%為0.76%，驗證了應(yīng)用Box-Benhnken 響應(yīng)面設(shè)計優(yōu)化花粉離體萌發(fā)培養(yǎng)基的方法是可行的。

3討論與結(jié)論

采用優(yōu)化后的離體花粉培養(yǎng)基獲得高的萌發(fā)率的前提條件是獲得高生活力的花粉。通過I2-KI檢測法(孫愛芹等，2010)檢測不同發(fā)育時期花粉的活力，結(jié)果表明花藥剛散粉時的花粉活力最高，接近100%。這一結(jié)果與李昆等(2007)證實麻瘋樹雄花的花藥剛散粉時花粉活力最高為54.35%存在顯著差異，這可能與麻瘋樹的品種有關(guān)。這種花粉萌發(fā)率的差異在不同的梨品種中間(楊磊，2009；趙紀偉，2012)和新疆野蘋果不同的單株之間也表現(xiàn)出來。西昌市黃水鄉(xiāng)處于野生狀態(tài)的麻瘋樹較高的離體花粉萌發(fā)率使其可能成為麻瘋樹雜交育種的優(yōu)良父本，今后可開展相關(guān)的試驗研究。

優(yōu)化后的二次多項回歸模型及響應(yīng)面模型，不僅能顯示單因素作用的大小，而且能顯示各因素的交互作用。本研究得出各因素對麻瘋樹離體花粉萌發(fā)率影響的順序為蔗糖>硼酸>>硝酸鈣>硝酸鉀，而且蔗糖與硼酸、硝酸鈣、硝酸鉀均表現(xiàn)出顯著的交互作用。蔗糖和硼酸是決定麻瘋樹離體花粉萌發(fā)的兩種主導因素(權(quán)秋梅等，2007)，硝酸鈣和硝酸鉀主要是在蔗糖和硼酸的作用下起輔助作用，而這種輔助作用是花粉管生長所必須的。蔗糖作為一種重要的碳水化合物，參與花粉滲透壓的平衡，對花粉的離體萌發(fā)起主導作用，它一方面可以參與花粉管滲透壓的平衡，另一方面作為花粉代謝的底物，為花粉萌發(fā)和花粉管生長提供營養(yǎng)物質(zhì)(Johri & Vasil,1961)。本研究中，當花粉萌發(fā)率在蔗糖濃度大于15%時顯著下降，這可能是因為高的滲透壓導致麻瘋樹花粉細胞發(fā)生質(zhì)壁分離(Johri & Vasil，1961)，從而抑制花粉萌發(fā)和生長。10%～15%的蔗糖能維持花粉滲透壓的平衡，使花粉保持較高的活力，保證萌發(fā)過程的順利進行(Johri & Vasil，1961)。硼可以直接參與果膠酶的合成，因此間接地參與了花粉管細胞膜的合成(楊曉冬，1999)。本研究表明，硼酸濃度在20～35 mg/L時促進花粉萌發(fā)，超過35 mg/L反而會抑制花粉萌發(fā)。本研究還表明硝酸鈣和硝酸鉀對麻瘋樹花粉離體萌發(fā)有顯著作用。一定濃度的Ca2+、K+促進花粉萌發(fā)效應(yīng)已在擬南芥、南非醉茄等中得到證實(Fan et al,2001; Ramanjan & Subrata,2013)。此外，響應(yīng)面分析結(jié)果表明蔗糖與硼酸、蔗糖與硝酸鈣、蔗糖與硝酸鉀的交互作用對萌發(fā)率也有顯著影響,這種交互作用在楊花粉萌發(fā)試驗中得到體現(xiàn)(杜克兵等，2007)。這可能是蔗糖與硼酸形成的蔗糖-硼酸絡(luò)合物復合物，鈣離子、鉀離子與蔗糖形成離子絡(luò)合物比蔗糖能更好的吸收、運輸和代謝(Gauch & Dugger,1953)。

響應(yīng)面模型進行優(yōu)化后得到萌發(fā)率最高時的培養(yǎng)基各營養(yǎng)成分的比例為13.77%蔗糖+32.14 mg·L-1硼酸+22.21 mg·L-1硝酸鈣+19.95 mg·L-1硝酸鉀+200 mg·L-1硫酸鎂，采用此培養(yǎng)基得到的花粉實際萌發(fā)率與理論響應(yīng)值相吻合，同時也表明利用BBD設(shè)計的響應(yīng)面模型進行麻瘋樹花粉離體萌發(fā)培養(yǎng)條件優(yōu)化方法的有效性。

本研究通過Box-Behnken設(shè)計的響應(yīng)面法得到了花粉離體萌發(fā)的最佳培養(yǎng)基組合，然而盛花期每朵雄花產(chǎn)生的花粉粒減少，活性花粉數(shù)降低；一天中不同時間麻瘋樹花粉萌發(fā)率存在差異(劉波洋,2013)。本研究相關(guān)實驗進一步表明pH值為5.0～5.5、溫度為25 ℃、光照為600 lx時麻瘋樹花粉萌發(fā)率最高，花粉管生長最好。因此，在麻瘋樹種植的生產(chǎn)實踐中可收集并儲藏開花初期的花粉待盛花期時進行人工授粉，并注意選擇授粉時間段，以期提高麻瘋樹的人工授粉率。

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Optimal medium for pollen germination ofJatrophacurcasinvitrousing response surface methodology

FANG Zhi-Rong1,2,3, WANG Sheng-Hua1, CHEN Fang1*, LIU Qing2

( 1.CollegeofLifeSciences,SichuanUniversity, Chengdu 610064, China; 2.ChengduInstituteofBiology,ChineseAcademyofSciences, Chengdu 610041, China; 3.AnimalScienceSchoolofXichangCollege, Xichang 615013, China )

Abstract:Jatropha curcas is likely to become one of the key energy crops in the world because of high oil content in seed which can be refined into high quality biodiesel. J. curcas widely distributes and cultivates in many tropics and sub-tropics areas of China. Due to inadequate pollination and very low productivity, J. curcas was a wild or semi-wild tree for a long time. Effective pollination is a prerequisite for fruit-set and seed-set of J. curcas. Information on the most suitable ingredient concentration ratio of B-K medium which was widely used to pollen culture in vitro for pollen germination and inactions among ingredients in vitro is required to increase rate of hybrid seed set and seed production. Gathered mature pollen grains when petals opened and the anther just began scattering pollen in primary flowering time to do pollen germination test. Ingredient concentration ratio was optimized by response surface methodology (RSM) based on the Box-Behnken design (BBD) . The primary variables chosen were sucrose, H3BO3 , Ca(NO3)2·4H2O and KNO3. A total number of 30 runs were tested. We constructed a response surface model between the pollen germination rates and four ingredients for the culture medium in vitro by R 3.0 software. The effect order of 4 factors to influence germination rate were: sucrose > H3BO3 >Ca(NO3)2·4H2O>KNO3. There were significant interactions of pollen germination between sucrose and H3BO3, sucrose and Ca(NO3)2·4H2O, sucrose and KNO3. The optimal ingredient concentration ratio which supported the germination of pollen and growth of pollen tubes was 13.77% sucrose + 32.14 mg·L-1H3BO3+ 22.21 mg·L-1Ca(NO3)2·4H2O + 19.95 mg·L-1KNO3 + 200 mg·L-1Mg(SO4)2·4H2O. Under this condition, the germination rate theoretically achieved 99.73%. The verification test were made corresponding to the optimal ingredient concentration ratio, the results of pollen germination experiments showed that pollen germination rates of 98.97%, the proportion matched theoretical response value well. It can also verify the effectiveness of the BBD-based response surface model and analysis technique in obtaining optimal ingredient concentration ratio for pollen germination.

Key words:Jatropha curcas, Box-Behnken design, response surface methodology, pollen viability, in vitro pollen germination, pollination ecology

中圖分類號：Q813.1+3

文獻標識碼：A

文章編號：1000-3142(2016)04-0479-07

作者簡介：方志榮(1981-)，女，四川冕寧人，在讀博士，研究方向為植物生理學,(E-mail)172580110@qq.com。*通訊作者： 陳放,博士，教授,研究方向為植物學,(E-mail)cfang@263.net。

基金項目：國家科技支撐計劃項目(2011BAD22B08)；四川省科技計劃項目(2011HH0006)[Supported by National Key Technology R & D Program of China(2011BAD22B08); Scientific and Technological Plan of Sichuan Province(2011BAD22B08)]。

*收稿日期:2014-11-15修回日期： 2015-03-31

DOI:10.11931/guihaia.gxzw201409029

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