磷酸肌酸對糖尿病大鼠心肌缺血再灌注損傷的影響

黨旭云， 蔚俊星， 景桂霞， 常建華

(1西安醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院麻醉科，西安　710077； 2西安市第四醫(yī)院麻醉科； 3西安交通大學第一附屬醫(yī)院麻醉科；*通訊作者，E-mail:13958816@qq.com)

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磷酸肌酸對糖尿病大鼠心肌缺血再灌注損傷的影響

黨旭云1， 蔚俊星2*， 景桂霞3， 常建華3

(1西安醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院麻醉科，西安710077；2西安市第四醫(yī)院麻醉科；3西安交通大學第一附屬醫(yī)院麻醉科；*通訊作者，E-mail:13958816@qq.com)

摘要：目的研究磷酸肌酸不同給藥方式對于糖尿病心肌缺血再灌注大鼠內皮素(ET-1)和一氧化氮(NO)含量的影響。方法建立糖尿病病程2周鼠和8周鼠模型各60只，兩組大鼠分別隨機分為四組(n=8)：假手術組(S組)；I/R+生理鹽水組(I/R組)；I/R+Pcr單次給藥組(單次給藥組)；I/R+Pcr多次給藥組(多次給藥組)。S組：只在左冠脈部位穿線而不結扎；I/R組：結扎前30 min腹腔注射生理鹽水；單次給藥組：結扎前30 min，按2 g/kg一次性腹腔注射Pcr；多次給藥組：按1 g/kg每日一次腹腔注射Pcr，連續(xù)5 d，注藥30 min后結扎冠脈；各組均缺血30 min，再灌注2 h。再灌注結束后，分別測定大鼠血漿中ET-1和NO的含量。結果同時間內，與S組相比，I/R組中ET-1的含量均增加(P<0.05)，NO的含量均減少(P<0.01)；與I/R組相比，單次給藥組中ET-1含量減少(P<0.05)，單次給藥組和多次給藥組中NO含量均增加(P<0.01)；與多次給藥組相比，單次給藥組ET-1含量均減少(P<0.05)，NO含量均增加(P<0.01)。8周鼠S組和I/R組分別與2周鼠對應組比較，ET-1含量均增加(P<0.05)，NO含量均明顯減少(P<0.01)。結論磷酸肌酸可減少糖尿病大鼠I/R后血漿ET-1的含量，增加NO的含量，單次大劑量給藥效果優(yōu)于多次小劑量給藥。

關鍵詞：磷酸肌酸；糖尿??；缺血再灌注損傷；心肌；內皮素；一氧化氮；大鼠

糖尿病日漸成為危害人類健康的頭號殺手，根據(jù)最新流行病學調查，中國可能已成為糖尿病患病人數(shù)最多的國家，約有9 240萬成年人患有糖尿病[1]。糖尿病作為缺血性心臟病的獨立發(fā)生因素，能夠顯著增加心血管疾病的發(fā)病率和病死率[2]，約80%的糖尿病病人死于心血管疾病。研究表明糖尿病發(fā)病機制和內皮細胞功能紊亂相關[3]。而缺血再灌注過程同樣伴隨有內皮細胞的受損，導致其合成和釋放血管舒縮因子功能障礙，反過來又加重再灌注損傷，造成惡性循環(huán)。面對糖尿病心肌的缺血缺氧性損害，鄧小強等[4]研究表明磷酸肌酸鈉預先給藥可減輕2型糖尿病患者心肌缺血再灌注損傷，改善預后。但具體機制尚未闡明，本文旨在從內皮細胞功能著手，進一步探討其保護機制，并研究其保護作用和劑量的關系。

1材料與方法

1.1主要試劑

鏈脲佐菌素(美國Sigma 公司)；注射用磷酸肌酸鈉(海南奇力制藥)；一氧化氮試劑盒(南京建成生物工程研究所)；內皮素放射免疫法試劑盒(北京華英生物技術研究所)。

1.2糖尿病模型的建立

采用健康雄性SD大鼠120只，由西安交通大學醫(yī)學院實驗動物中心提供，體重約180-220 g，用來制作糖尿病模型，以高脂飼料喂養(yǎng)4周后禁食12 h，單次腹腔注射由枸櫞酸鈉-枸櫞酸緩沖液溶解的鏈脲佐菌素(STZ)60 mg/kg，繼續(xù)高脂飼料喂養(yǎng)72 h,選擇體重280-350 g，采尾血測非空腹血糖，血糖持續(xù)≥16.7 mmol/L達1周者定為成模糖尿病大鼠。成模大鼠每2周復測一次血糖，血糖<16.7 mmol/L者剔除。分別建立糖尿病病程2周模型和8周模型。

1.3心肌缺血再灌注模型的建立

成?；蛘＝M大鼠稱重后，采用烏拉坦腹腔注射麻醉，仰臥位固定于實驗臺，連接生物機能實驗系統(tǒng)，記錄心電圖。置入自制氣管導管，連接動物呼吸機，潮氣量5 ml/100 g，頻率60-80次/min，吸呼比2 ∶1。胸骨左側三、四肋間切口，鈍性分離至肋間隙，剪斷肋骨暴露胸腔，破心包膜，使心臟充分暴露，在左心耳和肺動脈圓錐間找到與左冠狀動脈伴行的冠狀靜脈一并進行結扎，結扎前放置橡皮條。以同步心電圖QRS增高、增寬，ST段抬高為結扎成功標志。于結扎成功30 min，剪斷結扎線，取出橡皮條，再灌注2 h。

1.4動物分組

糖尿病病程2周鼠和8周鼠分別隨機分為4組(n=8):假手術組(S組)；I/R+生理鹽水組(I/R組)；I/R+Pcr單次給藥組(單次給藥組)；I/R+Pcr多次給藥組(多次給藥組)。每組具體操作如下:S組只在左冠脈部位穿線而不進行結扎，不產生缺血再灌注；I/R組結扎前30 min按20 ml/kg腹腔注射生理鹽水，缺血30 min，再灌注2 h；單次給藥組結扎前30 min，按2 g/kg一次性腹腔注射Pcr，缺血30 min，再灌注2 h；多次給藥組按1 g/kg每日一次腹腔注射Pcr，連續(xù)5 d，最后一次注藥30 min后結扎冠脈，缺血30 min，再灌注2 h。

1.5內皮素和NO測定

實驗結束后自頸內靜脈采血約3 ml，用EDTA作為抗凝劑混勻，迅速于3 000 r/min離心15 min，將上清置于-70 ℃保存。用ELISA法測定血漿中ET-1的含量，硝酸還原酶法測定血漿中NO的含量，分別采用北京華英生物技術研究所和南京建成生物工程研究所的試劑盒進行測定，操作步驟均按照試劑盒說明書進行。

1.6統(tǒng)計學分析

2結果

2.1模型評價

糖尿病大鼠在高脂飼料喂養(yǎng)的4周內，精神活躍,體重增加明顯，外觀肥胖，注射STZ后，逐漸表現(xiàn)為精神倦怠，但進食量明顯增加，且出現(xiàn)多飲多尿癥狀。2周時大鼠體重增幅下降，有的甚至體重減輕。8周時大鼠精神不振，食量減少，多飲多尿癥狀加重，毛皮灰暗，體型消瘦，體重明顯降低。造模期間出現(xiàn)了不明原因死亡的共12只，其余監(jiān)測血糖達標的共有98只，造模成功率為81.7%。心肌缺血再灌注期間，8只死于心力衰竭，3只死于大出血，2只死于呼吸衰竭。實驗死亡大鼠均被剔除，并補做相應數(shù)量的動物以保證足夠的樣本數(shù)。心肌缺血再灌注模型成功的標準：結扎LAD后，心電圖的典型改變，ST段抬高，T波高聳(見圖1)。

2.2血漿ET-1測定結果

與S組相比，2周和8周鼠I/R組ET-1含量增加(P<0.05或P<0.01)；與I/R組相比，單次給藥組含量降低(P<0.05)，單詞給藥組較多次給藥組ET-1含量明顯減少(P<0.01)。8周鼠S組和I/R組分別與2周鼠對應組比較，ET-1含量均增加(P<0.05，見表1)。

2.3血漿NO測定結果

與S組相比，2周和8周鼠I/R組NO含量均明顯減少(P<0.01)；與I/R組相比，單次給藥組和多次給藥組NO含量均明顯增加(P<0.01)；單次給藥組較多次給藥組NO含量明顯增加(P<0.01)。8周鼠S組和I/R組分別與2周鼠對應組比較，NO含量均明顯減少(P<0.01，見表2)。

圖1　結扎LAD后心肌缺血再灌注模型心電圖Figure 1　ECG of myocardial ischemia and reperfusion model rats after ligation of the LAD

組別 2周8周 S組80.85±10.1591.31±13.33▲I/R組90.89±12.24△103.66±12.06△△▲單次給藥組114.64±14.29△△100.81±10.75*多次給藥組124.73±14.35**#123.49±11.24##

同時間與S組比較，△P<0.05，△△P<0.01；與I/R組比較，*P<0.05，**P<0.01；與單次給藥組比較，#P<0.05，##P<0.01；同組與2周比較，▲P<0.05

組別 2周8周 S組86.04±9.4776.87±8.34▲▲I/R組64.41±7.51△△55.46±6.27△△▲▲單次給藥組80.03±8.76△△**63.44±7.10△△**多次給藥組71.87±7.75**##57.41±6.68##

同時間與S組比較，△P<0.05，△△P<0.01；與I/R組比較，*P<0.05，**P<0.01；與單次給藥組比較，#P<0.05，##P<0.01；同組與2周比較，▲▲P<0.01

3討論

心臟是一個高耗能的器官，正常情況下，心肌所需能量的60%以上來源于脂肪酸氧化，心肌缺血時，葡萄糖成為主要能量底物，心肌通過無氧酵解來獲取能量[5]。而糖尿病機體由于代謝異常，產能障礙，使得心肌細胞內ATP缺乏。同時，由于胰島素抵抗和長期高血糖的暴露，使得內皮細胞功能受損，從而減少NO的產生及其生物活性，導致血管功能障礙，影響心肌能量供應。內皮素作為內皮細胞釋放的強烈的縮血管物質，包括3種異構肽，其中ET-1生物活性最強，對心血管起主要作用。正常情況下，血管內皮合成和釋放一定量的NO和ET-1，調節(jié)血管張力和通透性及抗凝作用來維持營養(yǎng)物質和氧供應到相應組織[3]。而缺血缺氧和缺血再灌注可減少NO釋放而增加ET釋放；兩者的平衡被打破。ET大量釋放可使冠脈血管強烈收縮，除了心肌細胞膜ET受體上調，還因為冠脈對ET的敏感性增加，終可導致心肌的無復流。缺血期，缺血缺氧可直接或間接促進內皮素mRNA的表達，增加ET釋放；再灌注期，缺血區(qū)心肌無復流，促進氧自由基大量產生，ET進一步釋放，形成惡性循環(huán)，加重I/R損傷。在糖尿病機體，大量氧自由基還可作用于線粒體膜,使膜通透性改變而導致線粒體結構和功能損傷，產能障礙。

到目前為止糖尿病心臟對I/R的耐受性還沒有統(tǒng)一的結論。有研究證實糖尿病心臟對缺血再灌注損傷的抵抗力增加[6]；而另有研究表明自發(fā)型2型糖尿病大鼠心肌I/R損傷比非糖尿病對照組重[7]，還有實驗則證實:早期(2周)糖尿病的心臟對I/R損傷有耐受性,而對超過8周的糖尿病心臟會造成更大的損傷[8]。本研究結果顯示，糖尿病8周病程鼠與2周病程鼠相比，ET-1含量增加(P<0.05)，NO含量減少(P<0.01)，可見糖尿病8周鼠對MIRI耐受性更差。這可能是胰島素抵抗、能量代謝改變、氧化應激和全身炎癥反應增強、離子通道功能障礙共同作用的結果[9]。

磷酸肌酸作為一種高能磷酸化合物，在缺血前30 min對心肌做預處理，可為心肌細胞補充能量，從而維持細胞內ATP濃度的恒定，還可以作為能量從產生部位到消耗部位轉移的載體，通過磷酸肌酸穿梭來實現(xiàn)細胞內能量的傳遞。已經證實磷酸肌酸進入體內后主要分布于心肌和骨骼肌，并能迅速透過細胞膜，而且它在細胞內的擴散系數(shù)比ATP和ADP都大,這就為建立細胞內正常的能量代謝反應鏈創(chuàng)造了可能。其次，磷酸肌酸還可維持線粒體膜結構的完整性及正常的氧化磷酸化功能，改善心肌細胞能量代謝。

本研究結果表明，糖尿病大鼠在經歷過I/R后，血漿ET-1含量增加(P<0.05)，NO含量減少(P<0.05)，磷酸肌酸預處理，可使ET-1含量減少(P<0.05)，NO含量增加(P<0.05)，而且單次大劑量給藥效果優(yōu)于多次小劑量給藥(P<0.05)。綜上所述，磷酸肌酸對糖尿病缺血心肌的保護作用，除了其增加外源性ATP，改善心肌能量供應之外，還可能與減輕內皮細胞損害，調節(jié)血管舒縮因子NO和ET-1的平衡有關。

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Effects of phosphocreatine(Pcr) on the diabetic rats undergoing myocardial ischemia-reperfusion injury

DANG Xuyun1,YU Junxing2*, JING Guixia3, CHANG Jianhua3

(1DepartmentofAnesthesiology,FirstAffiliatedHospitalofXi’anMedicalUniversity,Xi’an710077,China;2DepartmentofAnesthesiology,ForthHospitalofXi’an;3DepartmentofAnesthesiology,FirstAffiliatedHospital,Xi’anJiaotongUniversity；*Correspondingauthor,E-mail:13958816@qq.com)

Abstract：ObjectiveTo investigate the effect of different administration ways of phosphocreatine(Pcr) on endothelin-1 and NO in diabetic rats with myocardial ischemia-reperfusion injury(I/R).MethodsThe rats were fed with high lipid to establish the diabetic models:2-week disease course and 8-week disease course. The two kinds of rats were respectively randomized into four groups(n=8): sham group, I/R group, single administration of Pcr group, and multiple administration of Pcr group. The artery of rats was not ligated in sham group. The rats in I/R group were given saline 30 min before ligation. The rats were administered with 2 g/kg Pcr once in single Pcr group. The rats were given 1 g/kg Pcr once a day for 5 d in multiple Pcr group. The coronary artery was ligated to induce the myocardial ischemia reperfusion in all rats. The artery was occluded for 30 min by tightening the ligature and followed by reperfusion for 2 h. ET-1 and NO were determined after the reperfusion.ResultsCompared with sham group, the serum level of ET-1 was significantly increased at week 2 and 8 in I/R group(P<0.05)，while the content of NO was significantly decreased(P<0.01). Compared with I/R group, the serum level of ET-1 in single Pcr group was decreased(P<0.05), while the contents of NO in single Pcr group and multiple Pcr group were significantly increased(P<0.01).Compared with multiple Pcr group,ET-1 was decreased in single Pcr group(P<0.05), while NO was significantly increased(P<0.01). In sham group and I/R group, the contents of ET-1 were higher in model rats at 8 week than those at 2 week(P<0.05),while the contents of NO were significantly lower(P<0.01). ConclusionPhosphocreatine could reduce the serum level of ET-1 and increase the content of NO in diabetic rats, which may be one of the mechanisms of myocardial protection. And the effect of single administration and high dose of Pcr is better than that of multiple administration and small dose.

Key words:phosphocreatine;diabetes;ischemia-reperfusion injury;myocardium；endothelin;NO;rats

[收稿日期：2015-07-14]

作者簡介：黨旭云，女，1984-01生，碩士，主治醫(yī)師，E-mail：117636555@qq.com.

中圖分類號：R587.1

文獻標志碼：A

文章編號：1007-6611(2016)02-0107-04

DOI：10.13753/j.issn.1007-6611.2016.02.001