酸菜發(fā)酵液多糖的分離純化及結(jié)構(gòu)分析

榮向華，張璇，趙春燕，2*

1(沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng)，110161) 2(沈陽(yáng)工學(xué)院，遼寧 撫順，113122)

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酸菜發(fā)酵液多糖的分離純化及結(jié)構(gòu)分析

榮向華1，張璇1，趙春燕1，2*

1(沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng)，110161) 2(沈陽(yáng)工學(xué)院，遼寧 撫順，113122)

摘要以醇沉法提取的酸菜發(fā)酵液粗多糖為原料，研究了酸菜發(fā)酵液多糖的分離純化工藝，并對(duì)其結(jié)構(gòu)及單糖組成進(jìn)行了初步鑒定。比較了Sevag法、TCA﹣正丁醇法、TCA與木瓜蛋白酶結(jié)合法及Sevag與木瓜蛋白酶結(jié)合法4種脫蛋白方法，利用DEAE-52纖維素柱和Sephadex-50葡聚糖凝膠柱層析精制得到了SJPⅡ-1，通過(guò)紅外光譜(infrared spectroscopy,IR)和高效液相色譜(high performance liguid chromatography,HPLC)分析SJPⅡ-1的結(jié)構(gòu)及單糖組成。試驗(yàn)結(jié)果表明，TCA與木瓜蛋白酶結(jié)合法是較佳脫蛋白方法，蛋白質(zhì)的清除率為94.86%，多糖的損失率為19.77%；IR檢測(cè)結(jié)果顯示，SJPⅡ-1具有多糖特征結(jié)構(gòu)；HPLC分析結(jié)果表明，SJPⅡ-1主要由果糖、甘露糖、鼠李糖、葡萄糖4種單糖組成。

關(guān)鍵詞酸菜發(fā)酵液；多糖；純化；結(jié)構(gòu)；單糖

酸菜發(fā)酵液是乳酸菌發(fā)酵酸菜過(guò)程中產(chǎn)生的剩余液，除含有乳酸菌、無(wú)機(jī)鹽外，還含有多糖和蛋白質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[1-2]。隨著酸菜產(chǎn)業(yè)的蓬勃發(fā)展，產(chǎn)生了大量的酸菜剩余液并以廢液的形式排放到河流，導(dǎo)致水體富營(yíng)養(yǎng)化，造成環(huán)境污染。因此，研究酸菜發(fā)酵液的綜合利用具有十分重要的意義。乳酸菌在發(fā)酵過(guò)程中除產(chǎn)生對(duì)菌體自身有益的莢膜多糖和胞壁多糖之外，還產(chǎn)生一種擴(kuò)散到發(fā)酵液中的可溶性多糖。乳酸菌胞外多糖除了其對(duì)細(xì)菌自身的生物學(xué)意義之外，更重要的是它具有安全無(wú)毒、理化性質(zhì)獨(dú)特、用途廣泛、易與菌體分離及可通過(guò)深層發(fā)酵實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)等優(yōu)良性質(zhì)而備受關(guān)注。研究表明，乳酸菌發(fā)酵酸奶過(guò)程中產(chǎn)生的胞外多糖具有很強(qiáng)的生物活性,能夠增強(qiáng)機(jī)體免疫力,并具有抗癌、抗腫瘤的功能[3]?；谝陨嫌^(guān)點(diǎn)，同為乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)物，酸菜發(fā)酵液多糖的結(jié)構(gòu)和功能越來(lái)越引起人們的關(guān)注。因此，本文利用乳酸菌發(fā)酵東北酸菜，對(duì)酸菜發(fā)酵液中多糖的分離純化及結(jié)構(gòu)進(jìn)行初步研究，為進(jìn)一步研究酸菜發(fā)酵液多糖的活性及開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1材料與儀器

1.1原料與試劑

原料：大白菜，遼寧阜新白菜生產(chǎn)基地。

1.2菌種

Lactobacillusplantarum1047，沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室保存。

1.3試劑

無(wú)水乙醇、氯化鈉、苯酚、硫酸、無(wú)水乙醚、丙酮、葡萄糖、三氯甲烷、三氯乙酸、正丁醇、考馬斯亮藍(lán)、1-甲基-3-苯基-5-吡唑酮(PMP)等(均為分析純)、單糖(標(biāo)準(zhǔn)品)、乙腈(色譜級(jí))、甲醇(色譜級(jí))，沈陽(yáng)化工試劑公司；牛血清白蛋白，國(guó)藥試劑公司；木瓜蛋白酶(酶活力10 000 U/g) 、DEAE-52纖維素、Sephadex-50，鼎國(guó)試劑公司。

1.4儀器

玻璃層析柱(2.6 cm×40 cm和1.6 cm×50 cm)，國(guó)藥試劑公司；722可見(jiàn)光分光光度計(jì)，上海菁華科技儀器公司；RE-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器有限公司；HL-2D恒流泵，上海青浦滬西儀器公司；UV-2450可見(jiàn)分光光度計(jì)，日本島津公司；SA-205傅里葉交換光譜分析儀，Thorlabs公司；2489高效液相色譜儀，美國(guó)Waters公司。

2實(shí)驗(yàn)方法

2.1酸菜發(fā)酵液多糖的提取

取過(guò)濾后酸菜發(fā)酵液，經(jīng)4 000r/min,30 min離心，低溫濃縮(5∶1)后，常溫下乙醇沉淀，條件為：加入濃縮液4倍體積量的無(wú)水乙醇，提取時(shí)間16 h，pH 8.4。將得到的沉淀經(jīng)無(wú)水乙醇、乙醚、丙酮洗滌后，用60 ℃蒸餾水溶解，離心去雜質(zhì)，上清液再醇沉，所得乳白色沉淀物質(zhì)即為酸菜發(fā)酵液粗多糖。

2.2酸菜發(fā)酵液多糖的分離純化

2.2.1酸菜發(fā)酵液多糖(SJP)脫蛋白

將酸菜發(fā)酵液粗多糖配制成濃度為10%的糖溶液。使用Sevag法：糖溶液和Sevag[(氯仿)∶(正丁醇)=4∶1]體積比為2∶1；TCA﹣正丁醇法：糖溶液和TCA﹣正丁醇(1∶5)體積比為2∶1；TCA與木瓜蛋白酶解結(jié)合法：先用0.8%木瓜蛋白酶再加入1.5% TCA；Sevag與木瓜蛋白酶解結(jié)合法：先用0.8%木瓜蛋白酶再加1/2體積的Sevag溶液，分別對(duì)酸菜發(fā)酵液多糖進(jìn)行脫蛋白處理[4-7]，所有試驗(yàn)均重復(fù)3次。用考馬斯亮藍(lán)染色法與苯酚-硫酸法分別測(cè)定4種方法處理后的蛋白質(zhì)和多糖的剩余量，采用Excel 2010軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析并繪圖。應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行方差分析，利用Duncan多重比較進(jìn)行差異顯著性分析，選出最佳脫蛋白方法。

2.2.2DEAE-52纖維素離子交換層析

DEAE-52纖維素進(jìn)行活化處理后，采用濕法裝柱(2.6 cm×30 cm)[8-9]。取脫蛋白、透析后的粗多糖樣品配制成質(zhì)量濃度為10 mg/mL，上柱量為10 mL，按照順序用蒸餾水及 0.1～0.5 mol/L NaCl溶液進(jìn)行梯度洗脫，每個(gè)梯度洗脫20管，先經(jīng)過(guò)純水洗脫平衡除雜，收集洗脫液(7 mL/管)，以硫酸-苯酚法進(jìn)行跟蹤檢測(cè)，測(cè)定每管洗脫液490 nm波長(zhǎng)處吸光度，以管數(shù)為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制洗脫曲線(xiàn)圖。收集多糖主峰，經(jīng)低溫濃縮，透析后冷凍干燥得酸菜發(fā)酵液多糖(SJPⅡ)。

2.2.3Sephadex G-50葡聚糖凝膠柱層析

取30 mg SJPⅡ溶于10 mL蒸餾水中，上SephadexG-50柱(1. 6 cm×50 cm)進(jìn)一步分離純化[10]，以蒸餾水洗脫，控制洗脫速度為0.5 mL/min，每支試管接洗脫液5 mL。后續(xù)操作同上，干燥得SJPⅡ-1。

2.3酸菜發(fā)酵液多糖純度及結(jié)構(gòu)組成分析

2.3.1SJPⅡ-1的紫外光譜分析

將SJPⅡ-1配成質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL的溶液，在190～400 nm范圍內(nèi)掃描，檢測(cè)在核酸(260 nm)和蛋白質(zhì)(280 nm)下是否有吸收峰，測(cè)定多糖的純化效果。

2.3.2SJPⅡ-1的紅外光譜分析

取SJPⅡ-1與KBr按1∶100的比例混合，在瑪瑙研缽中均勻研磨，壓片后置于傅里葉變換紅外光譜儀中在4000～400 cm-1波段內(nèi)掃描并觀(guān)察記錄譜峰[11]。

2.3.3SJPⅡ-1的高效液相色譜分析

將經(jīng)過(guò)柱前衍生處理[12]，離心取上清液并過(guò)濾所得的單糖標(biāo)準(zhǔn)品混合液和SJPⅡ-1水解樣品分別進(jìn)行洗脫分析。HPLC條件：色譜柱Kromasil C18(150 mm×4.6 mm),柱溫為常溫，流速0.9 mL/min，流動(dòng)相為水和乙腈，體積比為20∶80，進(jìn)樣量10 μL，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為250 nm。對(duì)照單糖標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間確定SJPⅡ-1的單糖組成。

3結(jié)果與討論

3.1脫蛋白方法選擇

對(duì)比4種脫蛋白方法(Sevag法、TCA﹣正丁醇法、TCA與木瓜蛋白酶解結(jié)合法、Sevag與木瓜蛋白酶解結(jié)合法)，將醇沉后的粗多糖進(jìn)行脫蛋白處理。如圖1和圖2可知，不同的脫蛋白方法對(duì)蛋白的脫除率和多糖損失率影響差異很大。由圖1可知，酶與TCA結(jié)合法蛋白脫出率最高，顯著高于其他3種脫蛋白方法(P<0.01)。在圖2中，多糖損失率的高低順序?yàn)椋篠evag法>酶與Sevag結(jié)合法>TCA﹣正丁醇法>酶與TCA結(jié)合法。酶與TCA結(jié)合法多糖損失率最低，極顯著低于其他3種方法(P<0.01)。綜合比較得出：最好的脫蛋白方法為木瓜蛋白酶與TCA結(jié)合法，該方法的蛋白質(zhì)脫除率高達(dá)94.86%，而多糖損失率僅為19.77%。

圖1　四種脫蛋白方法的蛋白脫除率比較Fig.1　Comparison of removal rates of protein with four deproteinization methods

圖2　四種脫蛋白方法的多糖損失率比較Fig.2　Comparison of loss rates of polysaccharides with four deproteinization methods

3.2DEAE-52纖維素柱層析

將經(jīng)過(guò)脫蛋白處理得到的酸菜發(fā)酵液多糖(SJP)收集，凍干，獲得純化的SJP。將SJP上DEAE-52纖維素柱進(jìn)行初級(jí)分離。由圖3可知，經(jīng)過(guò)纖維素柱洗脫后得到4個(gè)組分，按洗脫順序分別命名為SJPⅠ、SJPⅡ、SJPⅢ、SJPⅣ。分別收集各吸收峰組分洗脫液，經(jīng)低溫濃縮，透析后凍干，計(jì)算出各組分得率分別為2.2%、64.72%、1.88%、2.37%。組分SJPⅡ收集體積最大且得率最高，本試驗(yàn)僅對(duì)SJPⅡ進(jìn)行進(jìn)一步分離純化和結(jié)構(gòu)組成分析。

圖3　DEAE-52纖維素柱洗脫曲線(xiàn)Fig.3　Elution curve of polysaccharide on DEAE-52 cellulose column

3.3SJPⅡ的Sephadex G-50柱層析

將經(jīng)纖維素柱分離的SJPⅡ進(jìn)一步經(jīng)葡聚糖凝膠柱分離純化。由圖4得，經(jīng)蒸餾水洗脫后，SJPⅡ只有1個(gè)洗脫峰，說(shuō)明SJPⅡ是成分單一的多糖。收集吸收峰，濃縮凍干得白色沉淀SJPⅡ-1。

圖4　Sephadex G-50層析柱洗脫曲線(xiàn)Fig.4　Elution curve of polysaccharide on Sephadex G-50 column

3.4SJPⅡ-1的紫外光譜分析

如圖5所示，SJPⅡ-1在260 nm和280 nm波長(zhǎng)處均無(wú)明顯吸收峰，說(shuō)明經(jīng)過(guò)DEAE-52纖維素柱和Sephadex G-50凝膠柱層析后所得的多糖較純，基本不含蛋白質(zhì)和核酸等雜質(zhì)

圖5　SJPⅡ-1的紫外光譜Fig.5　UV spectra of SJPⅡ-1

3.5SJPⅡ-1的紅外光譜分析

由圖6可知，3 411 cm-1處出現(xiàn)一個(gè)較寬的吸收峰，是己糖環(huán)上的O—H伸縮振動(dòng)峰，表明多糖存在分子內(nèi)和分子間的氫鍵；2 930 cm-1左右處為C—H的伸縮振動(dòng)吸收峰；1 600 cm-1處為C—O—C伸縮振動(dòng)峰；1 400 cm-1左右處為C—H的變角振動(dòng)峰，以上4處峰均為多糖的特征吸收峰。此外在1 088 cm-1處的吸收峰可證明SJPⅡ-1存在吡喃環(huán)構(gòu)型的單糖。

圖6　SJPⅡ-1的紅外光譜Fig.6　IR spectra of SJP

3.6HPLC分析SJPⅡ-1的單糖組成

由圖7可知，SJPⅡ-1中含有果糖(Fru)、甘露糖(Man)、鼠李糖(Rham)、葡萄糖(Glu)。經(jīng)過(guò)計(jì)算，F(xiàn)ru∶Man∶Rham∶Glu=1∶0.33∶0.46∶0.39。

圖7　單糖混合標(biāo)準(zhǔn)液(a)及SJPⅡ-1 (b)的HPLC圖譜Fig.7　HPLC chromatograms of mixture of monosaccharide standards and SJPⅡ-1

4結(jié)論

本試驗(yàn)對(duì)醇沉后獲得的酸菜發(fā)酵液粗多糖的分離純化和結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究與分析。對(duì)4種脫蛋白方法進(jìn)行比較，以蛋白清除率、多糖損失率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，確定了酶法與TCA結(jié)合法為最好的脫蛋白方法，經(jīng)過(guò)DEAE-52纖維素柱與Sephadex G-50柱層析進(jìn)行分級(jí)分離，得到白色固體SJPⅡ-1, 經(jīng)紅外光譜及高效液相色譜檢測(cè)與組分分析后，得出SJPⅡ-1主要由果糖、甘露糖、鼠李糖、葡萄糖4種單糖組成。

隨著活性多糖的抗癌、抗腫瘤的功能的研究和利用，除植物中天然存在的多糖外，微生物發(fā)酵產(chǎn)生的胞外多糖的研究也越來(lái)越廣泛。各種真菌多糖已經(jīng)在食品、發(fā)酵、醫(yī)療保健中廣泛應(yīng)用，但細(xì)菌胞外多糖研究和利用還鮮見(jiàn)報(bào)端。本試驗(yàn)對(duì)乳酸菌接種發(fā)酵酸菜的發(fā)酵液中可溶性胞外多糖進(jìn)行初步的結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果表明該提取物具有多糖的結(jié)構(gòu)特征。因此，本研究可為酸菜發(fā)酵液多糖進(jìn)一步的活性研究及開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供理論支持。

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Purification of polysaccharide from Sauerkraut juice and its structure analysis

RONG Xiang-hua1, ZHANG Xuan1, ZHAO Chun-yan1,2*

1 (College of Food Science, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110161, China) 2 (Shenyang Institute of Technology, Fushun 113122, China)

ABSTRACTIn order to extract and purify crude polysaccharides from Sauerkraut juice (JSP) and study its preliminary structure and monosaccharide composition, the crude polysaccharide was obtained from sauerkraut juice by ethanol extraction method. Four methods, such as Sevag, trichloroacetic acid (TCA)-n-butyl alcohol, combination of TCA with papain, combination of Sevag with papain, were selected to remove protein. Further purification was conducted by DEAE-52 cellulose and Sephadex G-50 gel column chromatograph. The obtained SJPII-1 was analyzed by infrared spectrum (IR) and high performance liquid chromatography (HPLC). Results showed that the best deproteinization method was combined use of TCA and papain, which resulted in a deproteinization rate of 94.86% and a polysaccharide loss of 19.77%. Results from IR showed that SJP II-1 possessed a feature structure of polysaccharide. Monosaccharide composition of SJP II-1 was measured with HPLC. SJP II-1 was composed of fructose, mannose, rhamnose, and glucose.

Key wordsSauerkraut juice; polysaccharide; purification; structure; monosaccharide

收稿日期：2015-10-22，改回日期：2015-12-18

基金項(xiàng)目：遼寧省教育廳科學(xué)計(jì)劃項(xiàng)目(2014L566)

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201604023

第一作者：碩士研究生(趙春燕教授為通訊作者，E-mail:zhaochunyan108@163.com)。