MicroRNA-134在骨肉瘤中的表達及生物學作用研究

阿布都艾尼·熱吾提，孫俊剛，瓦熱斯江·尼亞孜，王浩，袁宏

(新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院骨科中心關節(jié)外科，新疆 烏魯木齊　830001)

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MicroRNA-134在骨肉瘤中的表達及生物學作用研究

阿布都艾尼·熱吾提，孫俊剛，瓦熱斯江·尼亞孜，王浩，袁宏*

(新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院骨科中心關節(jié)外科，新疆 烏魯木齊830001)

摘要：目的檢測微小RNA-134(microRNA-134)在骨肉瘤的表達，并探究其在骨肉瘤細胞的生物學作用。方法收集40 例骨肉瘤及癌旁正常骨組織標本，利用熒光定量PCR(Quantitative RT-PCR)檢測microRNA-134的表達情況。進一步分析microRNA-134在骨肉瘤細胞系(HOS和Saos-2)及正常成骨細胞系(NHOst)的表達，進而通過轉染microRNA-134 mimics至HOS和Saos-2細胞，并應用四甲基偶氮唑鹽微量酶反應比色法、細胞劃痕以及凋亡試驗探究其對骨肉瘤細胞的生物學作用。結果MicroRNA-134在骨肉瘤組織標本中的表達量明顯低于配對的癌旁組織(P<0.01)，同樣microRNA-134在HOS和Saos-2細胞系中的表達亦低于NHOst細胞系(P<0.05)。細胞生物學功能實驗發(fā)現(xiàn)，過表達microRNA-134可顯著抑制HOS和Saos-2細胞的增殖及遷移能力，并增加凋亡蛋白Bcl-2相關X蛋白(BAX)及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(CASPASE-3)表達。結論MicroRNA-134在骨肉瘤組織及細胞系中明顯低表達，并具有抑制骨肉瘤細胞增殖、遷移及增加凋亡的功能，高度提示其作為抑癌因子參與骨肉瘤的發(fā)生和發(fā)展過程。

關鍵詞：microRNA-134；骨肉瘤；Quantitative RT-PCR；低表達；抑癌因子

骨肉瘤是惡性度高的實體腫瘤，常好發(fā)于脛骨近端和股骨遠端等長管狀骨的干骺端[1]。骨肉瘤的發(fā)病率占人類惡性實體腫瘤的0.2%左右，在所有原發(fā)性的惡性骨腫瘤中，其發(fā)病率占第一位[2]。近年來，由于新型輔助化療技術的不斷發(fā)展和各類手術方式的不斷創(chuàng)新，對于沒有發(fā)生轉移的骨肉瘤患者，其5年生存率能夠達到70%左右，但總體而言，骨肉瘤的病死率及轉移率仍非常高[3]。雖然臨床研究發(fā)現(xiàn)某些致癌因子或抑癌因子在骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，但到目前為止，骨肉瘤發(fā)生的具體機制仍不明確[4-5]。所以，針對加強骨肉瘤發(fā)病分子機制的研究顯得尤為重要。

微小RNA分子(microRNA，miRNA)是一段長度約為21-25核苷酸的小型非編碼RNA家族分子，其廣泛參與到細胞分化、生物發(fā)育及腫瘤形成等各種生物學過程中[6]。目前研究表明，miRNA分子對骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展及預后具有重要的作用。例如，microRNA-124可通過下調酪氨酸激酶樣孤兒受體(receptor tyrosine kinase-like orphan receptor 2，ROR2)介導的Wnt信號通路抑制骨肉瘤細胞的遷移和侵襲[7]。MicroRNA-214通過作用于下游分子人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源的基因(Phosphatase and tensin homolog，PTEN)進而調控骨肉瘤細胞的生長及惡性轉移[8]。在骨肉瘤中，體內及體外實驗證明microRNA-140可顯著抑制細胞的增殖及遷移[9]。

MicroRNA-134屬于miRNA家族的成員之一，研究發(fā)現(xiàn)，microRNA-134低表達于膠質瘤中，并與腫瘤的惡性程度及轉移密切相關[10]。MicroRNA-134通過下調蛋白O-葡萄糖基轉移酶1(Protein O-glucosyltransferase 1，POGLUT 1)基因和Notch信號通路抑制子宮內膜癌的生長及腫瘤形成[11]。MicroRNA-134調控肺癌細胞的生長及凋亡，通過作用于WWOX基因(WW domain containing oxidoreductase，WWOX)和ERK1/2信號通路[12]。目前關于microRNA-134在骨肉瘤的研究尚未見相關文獻報道，本研究旨在分析microRNA-134在骨肉瘤組織和細胞中的表達情況，并探究microRNA-134在骨肉瘤細胞中的生物學功能。

1資料與方法

1.1病例及組織標本的收集2012年1月至2014年12月于新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院收集40 例骨肉瘤及癌旁正常骨組織標本，每一例標本均經(jīng)本院病理科進行病理確診。其中男20 例，女20 例，平均年齡(52±3.4) 歲(28～63 歲)，中位年齡(48±4.6) 歲。標本的收集均經(jīng)本醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會認可并獲得患者知情同意。

1.2實驗試劑和相關儀器總RNA提取試劑Trizol，細胞培養(yǎng)基DMEM，胎牛血清FBS，蛋白裂解液RIPA及Lipofetamine 2000轉染試劑均購自美國Invitrogen公司。反轉錄試劑盒TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit，熒光定量PCR試劑盒SYBR?Premix EX TaqTM ⅡPCR Kit及PCR擴增引物均購自日本Takara公司。MicroRNA-134模擬物(mimics)及模擬物陰性對照(mimics control)合成于上海吉瑪基因公司。骨肉瘤細胞系(HOS 和Saos-2)及正常成骨細胞系(NHOst)購自中科院上海細胞庫。普通PCR儀來源于美國BIO-RAD公司。LightCycler480熒光定量PCR儀購自德國Roche公司。

1.3標本總RNA的提取及cDNA的合成選取液氮保存的40 例配對骨肉瘤及癌旁組織，依照Trizol試劑盒說明書，提取組織中的總RNA。遵照TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit試劑盒說明將lμg RNA逆轉錄為cDNA。合成的cDNA放置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4Quantitative RT-PCR按照SYBR?Premix EX TaqTMⅡPCR Kit試劑盒說明書，以合成的cDNA作為模版在LightCycler480Ⅱ熒光定量PCR儀上進行Quantitative RT-PCR反應。反應總體系為：模版cDNA 1 μL，microRNA-134特異性引物0.2 μL，2×SYBR?Premix Mix 10 μL，microRNA-134上游引物為5′-GACTGGTTGACCAGAGGGGC-3′，下游引物為Takara公司試劑盒提供的通用引物；以U6為內參，U6上游引物為5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物為5′-ACGCTTCACGAATTTGCGT-3′，最后加RNase-free water至反應總體積為20 μL。Quantitative RT-PCR反應條件為：95℃ 20 min，隨后95℃ 10 s，60℃ 30 s，72℃ 20 s，共45個循環(huán)。最后采用 ΔΔCT法計算 Quantitative RT-PCR所得實驗數(shù)據(jù)[13]。

1.5細胞培養(yǎng)和細胞轉染實驗所用HOS，Saos-2及NHOst細胞均采用DMEM培養(yǎng)基+10% FBS進行培養(yǎng)。細胞培養(yǎng)條件為37℃，5% CO2。實驗均分為2組，其中試驗組轉染microRNA-134 mimics，陰性對照組轉染mimics control。細胞鋪板后，按照上述分組采用Lipofetamine 2000轉染試劑進行細胞轉染，之后按照相應實驗需要進行處理。

1.6Western blot按照蛋白裂解液RIPA說明書，提取處理后的HOS和Saos-2細胞的總蛋白。將提取好的總蛋白使用BCA定量試劑盒定量到2 μg/μL，按比例加入5倍SDS上樣緩沖液，105℃加熱15 min使其完全變性。常規(guī)制備10% SDS聚丙烯酰胺凝膠，每孔上樣量25 μL，隨后電泳、轉膜、封閉，加入抗BAX(ab32503，1︰1 000稀釋)及CASPASE-3抗體(ab2171，1︰1 000稀釋)，4℃過夜并室溫孵育相應的二抗1h，隨后使用TBST洗滌3次，ECL發(fā)光液處理后暗室內曝光膠片。

1.7細胞增殖試驗將HOS和Saos-2細胞培養(yǎng)后，按照96孔板進行鋪板，并使每孔細胞數(shù)達到5 000～6 000個。之后按照上述實驗分組進行轉染，并連續(xù)4 d每天每孔加入16 μL四甲基偶氮唑鹽微量酶反應比色法(5 g/L，Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)與細胞共孵育4 h后棄上清，最后使用150 μL二甲亞砜溶解，并測各孔450 nm波長的吸光度，計算各組平均值并繪制生長曲線。

1.8細胞劃痕試驗將培養(yǎng)好的HOS和Saos-2細胞消化后，按照6 孔板進行鋪板，并使每孔細胞數(shù)約為2×105個，當細胞完全貼壁后，用消毒過的100 μL槍頭均勻劃出4條橫線，隨后以PBS洗細胞3次去除雜質。之后按照同樣的方法進行實驗分組并進行細胞轉染。在轉染后0 h及24 h進行拍照，觀察和測定各組劃痕閉合寬度。

1.9數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計學分析所有數(shù)據(jù)均為計量數(shù)據(jù)，表示為均數(shù)±標準差(mean±SD)。統(tǒng)計分析采用SPSS 17.0軟件，兩組均數(shù)比較采用兩個獨立樣本的Student′s檢驗，MTT實驗采用ANOVA檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。所有的實驗至少獨立重復3次。

2結果

2.1MicroRNA-134在骨肉瘤組織及細胞系中低表達經(jīng)Quantitative RT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，40 例骨肉瘤組織中microRNA-134的相對表達量明顯低于癌旁組織(P<0.01)。同樣骨肉瘤細胞系(HOS和Saos-2)中microRNA-134的表達量亦低于正常成骨細胞系(NHOst，P<0.05)，見圖1。

2.2MicroRNA-134 mimics促進HOS和Saos-2細胞中microRNA-134表達采用microRNA-134 mimics和mimics control轉染HOS和Saos-2細胞。48 h后，經(jīng)Quantitative RT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，microRNA-134 mimics可顯著促進HOS和Saos-2細胞中microRNA-134的表達。結果見圖2。兩組差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。

2.3MicroRNA-134抑制HOS和Saos-2細胞的增殖細胞增殖曲線顯示結果見圖 3。MicroRNA-134 mimics轉染組細胞增殖速度明顯降低，轉染后1、2、3 d HOS細胞生長抑制率

注：*P<0.05

圖1MicroRNA-134在骨肉瘤組織及細胞系中的表達情況

注：*P<0.01

圖2MicroRNA-134 mimics促進HOS和Saos-2細胞中microRNA-134表達

[1-(microRNA-134 mimics/mimics control)×100%]分別為4.36%、7.29%和14.25%，以轉染后3d 最高(見圖3a)。Saos-2細胞轉染后1、2、3d細胞生長抑制率分別為6.27%、8.92%和17.18%(見圖3b)。

注：*P<0.05

圖3MicroRNA-134對HOS和Saos-2細胞增殖的影響

2.4MicroRNA-134抑制HOS和Saos-2細胞的遷移HOS和Saos-2細胞鋪板后，采用細胞劃痕試驗檢測microRNA-134對其遷移的影響。結果見圖4。24 h后，mimics control組HOS細胞劃痕閉合約54%，microRNA-134 mimics組HOS細胞劃痕閉合約38%；microRNA-134 mimics組Saos-2細胞劃痕閉合約43%，mimics control組Saos-2細胞劃痕閉合約67%。HOS和Saos-2細胞中microRNA-134 mimics組與mimics control組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

注：*P<0.05

圖4MicroRNA-134對HOS和Saos-2細胞遷移的影響

2.5MicroRNA-134促進HOS和Saos-2細胞中凋亡相關蛋白BAX及CASPASE-3的表達為進一步驗證microRNA-134對HOS和Saos-2細胞凋亡的影響，我們采用Western blot檢查其對凋亡相關蛋白BAX及CASPASE-3表達的影響。結果見圖 5所示。轉染microRNA-134 mimics后HOS細胞中BAX及CASPASE-3蛋白的表達水平分別增加3.67和3.04倍；Saos-2細胞中BAX及CASPASE-3蛋白的表達水平分別增加2.25和4.03倍。

圖5　MicroRNA-134對HOS和Saos-2細胞調亡的影響

3討論

動物生長發(fā)育過程與細胞增殖、分化及凋亡行為密切相關，而異常的細胞增殖分化往往導致腫瘤的發(fā)生發(fā)展[14]。研究發(fā)現(xiàn)，成熟miRNA分子通常在轉錄后水平調控目的基因的表達。其主要通過與目的基因mRNA的3′UTR區(qū)域完全或不完全互補配對，進而降解目的基因mRNA或阻礙其蛋白的表達[15]。最近研究顯示，miRNA可以作為抑癌和/或促癌因子在各種腫瘤發(fā)生過程中發(fā)揮抑癌和/或促癌功能。例如microRNA-34a能夠誘導細胞周期停滯、阻滯細胞增殖并促進細胞凋亡[16-19]，Let-7主要通過下調肺癌組織中的Ras基因(Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog，Ras)的表達來抑制細胞的生長及腫瘤的遷移[20]。MicroRNA-372與microRNA-373可以促進腫瘤細胞的生長，其主要通過激活細胞周期蛋白依賴激酶CDK2(Cyclin-dependent kinase 2)來直接抑制抑癌基因LATS2(Large tumor suppressor kinase 2)的活性[21]。毫無疑問，探討miRNA與腫瘤的關系，對于系統(tǒng)的掌握miRNA分子在腫瘤細胞中的功能及分子機制將起重要作用[22]。

MicroRNA-134定位于人染色體14q32位置，已有研究發(fā)現(xiàn)microRNA-134在多種腫瘤中呈現(xiàn)低表達，并發(fā)揮抑癌基因的作用。本研究通過對已經(jīng)發(fā)表的骨肉瘤miRNA表達譜芯片結果進行分析[23]，初步確定microRNA-134為本實驗的主要研究對象。通過對骨肉瘤組織和相應癌旁組織以及骨肉瘤與正常成骨細胞系中差異表達的microRNA-134進行定時熒光定量PCR驗證和比較，發(fā)現(xiàn)microRNA-134確實低表達于骨肉瘤組織及細胞系中。因此我們猜測microRNA-134在骨肉瘤中亦發(fā)揮抑癌基因的作用。

為了進一步驗證上述設想，我們應用MTT、細胞劃痕以及凋亡試驗探究microRNA-134對骨肉瘤細胞的影響。非常有趣的是，我們發(fā)現(xiàn)過表達microRNA-134，可顯著抑制骨肉瘤細胞的增殖及遷移并誘導其凋亡。上述結果提示microRNA-134可能作為抑癌基因參與骨肉瘤的發(fā)生和發(fā)展。

綜上所述，本試驗觀察到microRNA-134低表達于骨肉瘤組織及細胞系，并初步揭示了microRNA-134具有抑制骨肉瘤細胞增殖及遷移并誘導其凋亡的作用。MicroRNA-134有望成為骨肉瘤診斷和治療的腫瘤分子標志物，也可能作為骨肉瘤基因治療的一個有效靶點。然而，關于microRNA-134在骨肉瘤中精確的分子機制還有待于進一步的研究。

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The Expression and Biological Function Studies of MicroRNA-134 in Osteosarcoma

Abuduaini·Rewuti，Sun Jungang，Waresijiang·Niyazi，etal

(Department of Orthopaedics，People′s Hospital of Xinjiang Uygur Autonomous Region，Urumqi 830001，China)

Abstract：ObjectiveTo detect the expression of microRNA-134 in osteosarcoma and explore its biological function in osteosarcoma cell lines.Methods40 cases of paired osteosarcoma tissues and adjacent matched normal osteosarcoma tissues were collected in our hospital and microRNA-134 expression was detected by using Quantitative RT-PCR analysis.The expression levels of microRNA-134 was also analyzed in osteosarcoma cell lines (HOS and Saos-2)and a normal osteoblast cell (NHOst).The cells biological function was assessed by using MTT，wound-healing and Western blot assays，after transfected with microRNA-134 mimics into HOS and Saos-2 cells.ResultsThe microRNA-134 expression in osteosarcoma tissues was significantly lower than paired normal tissues (P<0.01)，and its expression was also down-regulated in HOS and Saos-2 cell lines than NHOst cell (P<0.05).Over-expression of microRNA-134 could markedly inhibit cell proliferation and migration，and promote BAX and CASPASE-3 expression.ConclusionMicroRNA-134 was significantly down-regulated in osteosarcoma tissues and cell lines.MicroRNA-134 can inhibit osteosarcoma cells proliferation and migration，and induce osteosarcoma cells apoptosis，which suggest that microRNA-134 function as a tumor suppressor gene involved in osteosarcoma development.

Key words：microRNA-134；osteosarcoma；Quantitative RT-PCR；low expression；tumor suppressor gene

作者簡介：阿布都艾尼·熱吾提(1982- )，男，主治醫(yī)師，新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院骨科中心關節(jié)外科，830001。

收稿日期：2015-09-06

中圖分類號：R738.1

文獻標識碼：A

文章編號：1008-5572(2016)04-0331-05

*本文通訊作者：袁宏