不同產(chǎn)地牽牛子生品及炒制品咖啡酸含量測定

馮　鑫，袁　杰，金傳山，劉叢彬，張　偉，胡　雨，張　悅

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，安徽 合肥　230012；2.安徽省食品藥品檢驗研究院，安徽 合肥　230051)

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不同產(chǎn)地牽牛子生品及炒制品咖啡酸含量測定

馮鑫1，袁杰2，金傳山1，劉叢彬1，張偉1，胡雨1，張悅1

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，安徽 合肥230012；2.安徽省食品藥品檢驗研究院，安徽 合肥230051)

[摘要]目的 通過測定不同產(chǎn)地牽牛子生品及炒制品中咖啡酸含量，探討產(chǎn)地和炮制方法對牽牛子質(zhì)量的影響。方法采用高效液相色譜法測定牽牛子生品及炒制品中咖啡酸的含量。色譜柱：Shim-pack ODS(4.6 mm×150 mm，5 μm)；柱溫：30 ℃；流動相：乙腈-0.04%磷酸水溶液，梯度洗脫；檢測波長為325 nm。結(jié)果河南產(chǎn)牽牛子咖啡酸含量最高，山西產(chǎn)牽牛子咖啡酸含量最低，其他產(chǎn)地牽牛子咖啡酸含量居中，牽牛子炒制品較生品中咖啡酸含量均有不同程度的降低。結(jié)論不同產(chǎn)地牽牛子咖啡酸含量不同，炮制后，咖啡酸含量降低，咖啡酸可作為牽牛子的評價指標(biāo)之一。

[關(guān)鍵詞]牽牛子；產(chǎn)地；咖啡酸；高效液相色譜

牽牛子為旋花科植物裂葉牽牛Pharbitisnil(L.)Choisy或者是圓葉牽牛Pharbitispurpurea(L.)Voigt的干燥成熟種子[1-2]，始載于《名醫(yī)別錄》，又名黑丑、白丑。牽牛子味苦，性寒，有毒，歸肺、腎、大腸經(jīng)，具有瀉水通便、消痰滌飲、殺蟲攻積之功效[3]。牽牛子的主要成分是咖啡酸，咖啡酸又名3，4-二羥基肉桂酸[4-5]，具有保護(hù)心血管、抗誘變、抗癌、抗菌、抗白血病、免疫調(diào)節(jié)、利膽止血及抗氧化等藥理作用[6-8]。牽牛子生用偏于逐水消腫，殺蟲；炮制后可降低毒性，緩和藥性，以消食導(dǎo)滯見長。目前，關(guān)于牽牛子質(zhì)量、炮制及產(chǎn)地優(yōu)選方面的研究鮮有報道?；诖耍緦嶒炓誀颗Ｗ拥闹饕煞挚Х人釣闇y定指標(biāo)，通過測定不同產(chǎn)地牽牛子生品及炒制品中咖啡酸含量，觀察產(chǎn)地和炮制方法對牽牛子質(zhì)量的影響，以期為牽牛子藥材的產(chǎn)地優(yōu)選及其資源的合理利用提供實驗依據(jù)。

1儀器及試劑

1.1儀器高效液相色譜儀：島津LC-2010AHT，PDA型檢測器；CP225D型電子天平：德國Sartorius公司；KQ-200KDB超聲波清洗器：江蘇省昆山超聲儀器有限公司；Milli-Q Advantage超純水機(jī)：美國Millipore 公司；756MC紫外-可見分光光度計：上海精密科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)；HL-200A型打粉機(jī)：上海塞耐機(jī)械有限公司。

1.2試劑及藥材咖啡酸對照品(純度98%)：中國藥品生物制品檢定所，批號110885-200102；色譜甲醇：上海星可高純?nèi)軇┯邢薰荆?67-56-1；磷酸：天津四友精細(xì)化學(xué)品有限公司，批號 113004-113005；石油醚(60～90 ℃)：天津四友精細(xì)化學(xué)品有限公司，批號 223009-12962；三氯甲烷：上海中試化工總公司，批號 283009-22962；蒸餾水：自制。牽牛子樣品：均收購于中原正信藥材有限公司，經(jīng)過安徽中醫(yī)藥大學(xué)金傳山教授鑒定為牽牛屬裂葉牽牛Pharbitisnil(L.)Choisy的干燥成熟種子。

2方法和結(jié)果

2.1牽牛子樣品的收集及信息統(tǒng)計共購買8批牽牛子樣品及其相應(yīng)的炒制品，分別由浙江杭州，安徽亳州、六安等5家飲片廠生產(chǎn)，來源于河南、江蘇、四川、湖北、山西、遼寧、安徽共7個產(chǎn)地。具體樣品信息見表1。

表1　牽牛子生品、炒制品樣品信息

2.2咖啡酸含量測定

2.2.1色譜條件[9]色譜柱：Shim-pack ODS(4.6 mm×150 mm，5 μm)；柱溫：30 ℃；流動相為：乙腈(A)-0.04%磷酸水溶液(B)，梯度洗脫(0～12 min， 13% A，87% B；12～13 min， 13% A→54% A，87% B→46% B；13～19 min，54% A，46% B)；檢測波長為325 nm；其理論板數(shù)按咖啡酸峰計算不低于4 000。

2.2.2對照溶液配制取咖啡酸對照品3.02 mg，精密稱定，然后置于10 mL的棕色容量瓶中，用色譜甲醇定容，搖勻，得到濃度為302 μg/mL的咖啡酸母液。用移液管移取1 mL轉(zhuǎn)移到10 mL的容量瓶中，用色譜甲醇定容即可。

2.2.3供試溶液制備[9]精密稱定牽牛子樣品粉末(過65目篩)2 g，放到索氏提取器中，加石油醚(60～90 ℃)試劑，水浴回流提取2 h，過濾，舍棄石油醚液，余下濾渣揮干石油醚，加甲醇-三氯甲烷(1∶3)混合液提取6 h，回收溶劑至提取液少許，然后轉(zhuǎn)移到10 mL量瓶中，用相同有機(jī)溶劑清洗容器后移至上述10 mL量瓶中，定容，搖勻即可。

2.2.4線性關(guān)系考察取咖啡酸對照品3.02 mg，精密稱定，然后置于10 mL容量瓶中，加甲醇定容，制成咖啡酸標(biāo)準(zhǔn)貯備液(302 μg/mL)，分別配成1.887 5、3.75、7.55、15.1、30.2 μg/mL的系列對照品液，依次吸取20 μL進(jìn)樣測定，以峰面積(y)為縱坐標(biāo)，對照品濃度(x)為橫坐標(biāo)，得線性方程：咖啡酸y=111 853x-18 600 (r=0.999 5)。從結(jié)果可知，咖啡酸在1.887～30.2 μg/mL的濃度范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.2.5精密度試驗精密吸取咖啡酸溶液20 μL，進(jìn)樣6次，結(jié)果得到咖啡酸峰面積的RSD為1.69%，表明該儀器的精密度良好。

2.2.6重復(fù)性試驗精密稱定牽牛子樣品6份，每份約2 g，分別制備供試品溶液6份，進(jìn)樣，測定咖啡酸的峰面積，計算咖啡酸含量，結(jié)果咖啡酸含量的RSD為1.98%，表明本方法的重復(fù)性良好。

2.2.7穩(wěn)定性試驗精密稱定牽牛子樣品2 g，制備供試品溶液，分別在0、4、8、12、16 h進(jìn)樣，測定咖啡酸的峰面積，計算其RSD為1.90%，表明制備的供試品溶液在16 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.8加樣回收率試驗精密稱定牽牛子樣品6份，每份約1 g，分別加入咖啡酸適量，按“2.2.3”制備供試品溶液，分別進(jìn)樣，測得平均回收率為99.39%，RSD=1.72%。

2.2.9樣品中咖啡酸含量測定精密稱取8批牽牛子生品及炒制品各3份，每份約2 g，按“2.2.3”制備供試品溶液，然后進(jìn)樣，樣品以干燥品計算，測定各樣品中咖啡酸含量，結(jié)果見表2。牽牛子生品、炒制品的高效液相色譜圖見圖1。

圖1　咖啡酸對照品(A)、牽牛子生品(B)、牽牛子炒制品(C)的高效液相色譜圖

注：比值=生品咖啡酸含量/炒制品咖啡酸含量。

3討論

《中華人民共和國藥典》2005版一部[9]牽牛子項下的含量測定對咖啡酸和咖啡酸乙酯的總量進(jìn)行測定，但在實驗中發(fā)現(xiàn)牽牛子生品和炒制品的所用樣品中幾乎測不出咖啡酸乙酯，因此筆者只對樣品中咖啡酸進(jìn)行測定。在《中華人民共和國藥典》2005版一部牽牛子項下含量測定色譜條件的基礎(chǔ)上，通過方法學(xué)考察確定咖啡酸的含量測定方法。

由8批不同產(chǎn)地牽牛子生品中咖啡酸含量的測定結(jié)果可以看出，河南產(chǎn)牽牛子咖啡酸含量最高，山西產(chǎn)牽牛子咖啡酸含量最低，其他產(chǎn)地牽牛子咖啡酸含量居中，據(jù)此可以得出產(chǎn)地對牽牛子中咖啡酸的含量影響較大，可以一定程度上通過咖啡酸含量的高低判斷牽牛子藥材的質(zhì)量。另一方面，也為今后能夠更合理、更充分、更高效地利用牽牛子藥材資源提供實驗依據(jù)。

本研究結(jié)果表明，8批牽牛子生品經(jīng)炒制后咖啡酸含量均有不同程度的降低，降低幅度最大的是四川產(chǎn)牽牛子，降低幅度最小的為山西產(chǎn)牽牛子。炒制過程是一個加熱的過程，而咖啡酸對熱不穩(wěn)定[10]，故牽牛子在炒制后其咖啡酸含量降低。如何確定牽牛子炮制過程中咖啡酸的含量變化與炒制程度之間的關(guān)系及尋找牽牛子炮制過程的具體參數(shù)是當(dāng)前研究的難點，也是課題組下一步的研究方向。此外，關(guān)于牽牛子炮制減毒的具體機(jī)制，今后將進(jìn)一步的深入研究。

參考文獻(xiàn)：

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015:253.

[2]田連起，鄭玉麗，白吉星，等.牽牛子炮制前后咖啡酸的含量比較研究[J].中醫(yī)學(xué)報，2011，26(5):595-597.

[3]敖冬梅，魏群.牽牛子研究進(jìn)展[J].中國中醫(yī)藥信息雜志，2003，10(4):77-80.

[4]Tanaka T，Kojima T，Kawamori T，et al. Inhibition of 4-nitroquinoline-1-oxide-induced rat tongue carcinogenesis by the naturally occurring plant phenolics caffeic，ellagic，chlorogenic and ferulic acids[J].Carcinogenesis，1993，14(7):1321-1325.

[5]Toshio Kawasaki，Hikaru Okabe，Iwao Nakatsuka. Reinvestigation of the components of pharbitin，a resin glycoside of the seeds ofpharbitisnilchoisy[J].Chem Pharm Bull，1971，19(6):1144-1150.

[6]田連起，張振凌，張本山.牽牛子藥理、毒副作用及臨床應(yīng)用的研究進(jìn)展[J].光明中醫(yī)，2008， 23(11):1864-1865.

[7]陳立娜，李萍.牽牛子化學(xué)成分研究[J].中國天然藥物，2004，2(3):146-148.

[8]陳立娜，李萍.牽牛子化學(xué)成分研究：Ⅱ[J].林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè)，2007，27(6):105-108.

[9]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005:177-178.

[10]王初，孫建宇.炮制對牽牛子有效成分及藥效的影響[J].醫(yī)藥導(dǎo)報，2008，27(7):781-782.

Determination of Caffeic Acid in Raw and Stir-friedSemenPharbitidisfrom Different Producing Areas

FENGXin1,YUANJie2,JINChuan-shan1,LIUCong-bin1,ZHANGWei1,HUYu1,ZHANGYue1

(1.SchoolofPharmacy，AnhuiUniversityofChineseMedicine,AnhuiHefei230012,China;2.AnhuiInstituteforFoodandDrugControl,AnhuiHefei230051,China)

[Abstract]ObjectiveTo determine the content of caffeic acid in raw and stir-fried Semen Pharbitidis from different producing areas, and to investigate the influence of producing area and processing method on the quality of Semen Pharbitidis. MethodsHigh-performance liquid chromatography (HPLC) was applied to determine the content of caffeic acid in raw and stir-fried Semen Pharbitidis. HPLC was performed on a Shim-pack ODS column (4.6 mm × 150 mm, 5 μm) with a mobile phase of acetonitrile-0.04% phosphoric acid solution for gradient elution at a column temperature of 30 ℃ and a detection wavelength of 325 nm. ResultsSemen Pharbitidis produced in Henan Province had the highest caffeic acid content, Semen Pharbitidis produced in Shanxi Province had the lowest caffeic acid content, and Semen Pharbitidis produced in other areas had a medium caffeic acid content. Compared with raw Semen Pharbitidis, stir-fried Semen Pharbitidis had varying degrees of reduction in caffeic acid content. ConclusionThe content of caffeic acid varies across Semen Pharbitidis from different producing areas, and it is reduced after Semen Pharbitidis is processed. The content of caffeic acid can be used as an index for the assessment of Semen Pharbitidis.

[Key words]Semen Pharbitidis; Producing area; Caffeic acid; High-performance liquid chromatography

(收稿日期：2015-12-11；編輯：曹健)

[中圖分類號]R284[DOI]10.3969/j.issn.2095-7246.2016.02.028

通信作者：袁杰，dsyuanjie@126.com

作者簡介：馮鑫，男(1974-)，碩士，講師

基金項目：安徽中醫(yī)藥大學(xué)自然科學(xué)基金項目(2016zr015)；安徽省高?？蒲袆?chuàng)新平臺團(tuán)隊(中藥飲片產(chǎn)地加工與炮制一體化關(guān)鍵技術(shù)研究創(chuàng)新團(tuán)隊)建設(shè)項目(2015TD035)