Survivin在口腔粘膜下纖維性變和癌變中的表達及臨床意義*

張大宮　衛(wèi)倩　夏金圣

(上海市奉賢區(qū)中心醫(yī)院口腔科, 上海 201400)

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·論著·

Survivin在口腔粘膜下纖維性變和癌變中的表達及臨床意義*

張大宮衛(wèi)倩夏金圣

(上海市奉賢區(qū)中心醫(yī)院口腔科, 上海 201400)

【摘要】目的分析生存蛋白(Survivin)在口腔粘膜下纖維性變(OSF)和癌變中的表達及其臨床意義。方法選取2011年8月～2014年8月在醫(yī)院接受治療的OSF患者17例和OSF癌變患者18例，并選取同期進行口腔健康檢查的健康人群20例作為研究對象，采用SP方法檢測三組患者的Survivin表達情況。結(jié)果健康人群口腔粘膜上皮組織中未出現(xiàn)Survivin陽性表達；OSF癌變患者的Survivin表達陽性率(94.4%)明顯高于OSF患者(47.1%)(P<0.05)；OSF患者早期、中期、晚期的Survivin表達陽性率呈升高趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論Survivin水平對于診斷口腔粘膜下纖維性癌變具有重要意義，可作為患者早期的診斷標(biāo)志物。

【關(guān)鍵詞】Survivin；口腔粘膜下纖維性變；癌變；表達；臨床意義

口腔粘膜下纖維性變(OSF)是一種慢性疾病，能對口腔粘膜的任一部位進行侵襲，最終導(dǎo)致口腔功能障礙，甚至發(fā)展成口腔粘膜下纖維性癌,癌變率為7%～13%[1，2]，故OSF也屬于癌前狀態(tài)。咀嚼擯榔是OSF的主要病因，據(jù)相關(guān)資料統(tǒng)計，在咀嚼檳榔人群中大約有30%均有口腔粘膜下纖維性變[3-5]。Survivin屬于凋亡抑制因子，主要參與機體的有絲分裂、抗凋亡等生物學(xué)過程，它具有腫瘤特異性，在正常的組織中并不表達，只在胚胎組織及惡性腫瘤組織中表達，并且和腫瘤細胞的分化、增殖、浸潤、轉(zhuǎn)移等緊密相關(guān)[6,7]。目前，關(guān)于OSF和OSF癌變組織中Survivin的表達情況臨床研究較少，為探究Survivin在口腔粘膜下纖維性變癌變中的表達及臨床意義，本文進行了針對性研究，以期為臨床治療OSF癌變提供更加有效的診斷及治療思路，現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1資料與方法

1.1臨床資料選取2011年8月～2014年8月在我院口腔科接受治療的OSF患者17例，均經(jīng)病理學(xué)檢查予以確診和排除其他系統(tǒng)性疾病患者，17例OSF患者中男性7例，女性10例，年齡18～65歲，平均年齡(46.3±3.8)歲，其中包括5例早期，8例中期，4例晚期患者。另選取OSF癌變患者18例，均先表現(xiàn)為OSF癥狀，其后演變?yōu)榘┳?，排除合并其他口腔黏膜疾病患者?8例OSF癌變患者中男性8例，女性10例，年齡32～68歲，平均年齡(44.8±4.2)歲，其中包括11例舌癌，4例頰癌，2例牙齦癌，1例口底癌。同時選取同期進行口腔健康檢查的健康人群20例作對照，均無吸煙、酗酒、嗜好咀嚼檳郎習(xí)慣，亦無其他口腔黏膜疾病，20例健康人群中男性11例，女性9例，年齡21～64歲，平均年齡(43.9±4.9)歲。三組人群均未接受過放化療治療，且均同意進行病理研究。對比分析三組人群的年齡、性別等一般資料，無明顯統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，具有可比性。

1.2研究方法

1.2.1檢查儀器與試劑儀器：病理切片機(QPJ-I型，購自天津航空機電設(shè)備廠)、電熱鼓風(fēng)干燥箱(101C-III型，購自上海實驗儀器總廠)、離心機(80-1型，購自上海手術(shù)器械廠)、微波爐(WD800T型，購自順德格蘭仕電器有限公司)、顯微鏡(Ys100型，購自日本NiKon公司)。試劑：鼠抗人Survivin、DAB試劑盒、SP試劑盒、EDTA修復(fù)液、磷酸鹽緩沖液，均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2.2檢測方法本組患者均經(jīng)免疫組化SP法進行檢測，檢測步驟應(yīng)嚴格按照試劑說明書操作。首先采集三組人群的頰粘膜組織，使用40g/L的中性甲醛溶液進行標(biāo)本固定，石蠟包埋后進行常規(guī)切片，普通載玻片及經(jīng)多聚賴氨酸處理后的載玻片切片厚度均為4μm。對普通載玻片行HE染色，病理醫(yī)師很據(jù)自身經(jīng)驗及病理學(xué)分期標(biāo)準，對選取的OSF組織的分期及癌變進行判斷。對經(jīng)多聚賴氨酸處理過的載玻片置入烤箱中>24h,烤箱溫度設(shè)置為60℃，目的為使獲取的組織與切片緊密粘附，利于免疫組化分析。兩種切片均需脫蠟處理，分別用蒸餾水及PBS沖洗、浸泡10min、5min，其后將其置入抗原修復(fù)液中進行修復(fù)，每次煮沸后斷電，期間間隔5min，連續(xù)進行2次，冷卻切片，然后經(jīng)過沖洗、H2O2孵育等步驟向樣本組織中滴加鼠抗人Survivin抗體，空白對照組采用PBS[8]。

1.2.3結(jié)果判定切片處理完畢后，由兩名經(jīng)驗豐富的病理科醫(yī)師進行閱片，應(yīng)在高倍鏡下對切片進行觀察，高倍鏡目數(shù)為×400，觀察時一般選擇5個不同的視野，對500個細胞進行計數(shù)，陽性細胞的判定標(biāo)準為：在胞質(zhì)內(nèi)見到棕褐色顆粒。根據(jù)陽性細胞的染色強度及其所占百分比對其進行分級評分，其中依據(jù)染色強度分為4個等級：強(+++)，中等(++)，弱(+)和無(-)，分別記為3分、2分、1分和0分；依據(jù)陽性細胞百分比分為5個等級：0分～百分比在5%以下；1分：百分比在5%～24%之間；2分：百分比在25%～49%之間；3分：百分比在50～75%；4分：百分比在75%以上。將上述兩項進行疊加，若分值為0分或1分，則記為(-)，若分值為2分或3分，則記為(+)，若分值為4分或5分，則記為(++)，若分值為6分或7分，則記為(+++)[9]。

1.3統(tǒng)計學(xué)分析本組研究采用SPSS 15.0統(tǒng)計學(xué)軟件對所得數(shù)據(jù)進行分析與處理，其中計數(shù)資料的組間比較采用2檢驗方法，用(n，%)表示，陽性表達率的計算采用Fish確切概率法，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1口腔粘膜上皮組織中Survivin的表達分布Survivin顯示為棕褐色顆粒，粗細不一，主要在細胞質(zhì)內(nèi)表達。在健康人群中，未在其口腔粘膜上皮組織中發(fā)現(xiàn)Survivin陽性染色(見圖1)。在OSF患者中，可見Survivin陽性染色，其中早期及中期Survivin的陽性染色比較微弱，只在棘層和基底層細胞質(zhì)內(nèi)觀察到散在的淡褐色顆粒(見圖2，圖3)，而在晚期Survivin的陽性染色程度加深，在部分棘層和基底層細胞質(zhì)內(nèi)可在密集、均勻的褐色顆粒(見圖4)。在OSF癌變患者中，Survivin陽性顆粒呈片狀分布，大部分棘層、基底層細胞及癌細胞被染成深褐色，但間質(zhì)細胞并未著色(見圖5)。

圖1健康人群口腔粘膜Survivin未表達

Figure 1Survivin was not expressed in healthy population

圖2OSF早期Survivin的表達

Figure 2The expression of survivin in early OSF

圖3OSF中期Survivin的表達

Figure 3The expression of survivin in middle OSF

圖4OSF晚期Survivin的表達

Figure 4The expression of survivin in late OSF

圖5OSF癌變Survivin的表達

Figure 5The expression of survivin in OSF canceration

2.2口腔粘膜上皮組織中Survivin的陽性表達率在20例健康人群的口腔粘膜上皮組織中未發(fā)現(xiàn)Survivin陽性表達。在17例OSF患者中，有8例呈陽性表達，表達陽性率為47.1%，其中包括1例(5.9%)早期，3例(17.6%)中期，4例(23.5%)晚期。在18例OSF癌變患者中，有17例呈陽性表達，表達陽性率為94.4%。提示在OSF患者中Survivin的陽性表達率明顯高于健康人群(2=12.008，P<0.05)，OSF癌變患者中Survivin的陽性表達率明顯高于OSF患者(2=9.619，P<0.05)，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義。但在OSF早期、中期及晚期患者Survivin的陽性表達率無明顯統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。見表1。

表1三組患者口腔粘膜上皮組織中Survivin的陽性表達率

Table 1The positive expression rate of survivin in oral mucosa epithelium in the three groups

組別nSurvivin陽性表達-++++++表達率(×10-2)正常口腔粘膜組20200000OSF患者組1747.1 OSF早期01005.9 OSF中期021017.6 OSF晚期022023.5OSF癌變組181071094.4

3討論

Survivin在腫瘤細胞中的表達已經(jīng)成為臨床上研究的熱點問題[10]。Survivin又稱生存蛋白，屬于IAP家族的成員之一，在目前臨床發(fā)現(xiàn)的凋亡抑制因子中其作用能力最強，最早由耶魯大學(xué)學(xué)者于1997年發(fā)現(xiàn)[11]。 Survivin主要存在在17q25染色體上，由142個氨基酸構(gòu)成，分子量僅為16300，是IAP家族中分子量最小的成員[12]。內(nèi)源性Survivin的亞細胞定位不同，大約有80%定位在細胞質(zhì)，其余20%定位在細胞核。Survivin在不同組織中表達效果不一，在胚胎組織、惡性腫瘤組織中為高表達，在甲狀腺、胸腺、睪丸及成人大腸粘膜中為低表達，在良性腫瘤組織及終末組織中不表達[13,14]。同時，Survivin在細胞內(nèi)的表達呈嚴格周期依賴性，在G2/M期表達比較特異，是因為其半衰期只有30分鐘，當(dāng)在G2/M期表達后，其在接下來的G1期表達的蛋白質(zhì)及mRNA顯著下降。

Survivin能參與細胞的有絲分裂及增殖，并促進血管的形成。在G2/M期，Survivin的過度表達能增加細胞逃逸，進而致使細胞出現(xiàn)異常增殖。同時，Survivin還能協(xié)同血管內(nèi)皮生長因子促進腫瘤的浸潤轉(zhuǎn)移及血管內(nèi)生成，由此可見，Survivin在腫瘤的發(fā)生及進展中起到十分重要的作用[15,16]。在Survivin高表達腫瘤患者中化療效果不理想，其總體生存期較短，腫瘤易復(fù)發(fā)，對于預(yù)測腫瘤的發(fā)生和發(fā)展具有重要意義。OSF屬于慢性、進展性口腔黏膜疾病，其具有癌變傾向，主要的臨床特征為口干、灼痛、吞咽困難、進食疼痛、張口困難等。OSF在國外較常見，尤其是東南亞及印度等國家，我國則集中在臺灣及湖南等地區(qū)，目前，其病因尚不明確，可能和咀嚼檳郎、營養(yǎng)因素、遺傳因素、免疫因素、進食因素等有關(guān)，其已被WHO列為癌前狀態(tài)[17]。近年來，關(guān)于Survivin在口腔粘膜下纖維性變癌變中的表達研究日漸增多，證明了Survivin與口腔癌癥的發(fā)生、進展、轉(zhuǎn)移及預(yù)后緊密相關(guān)[13]。有學(xué)者[18]利用免疫組化方法對正常口腔粘膜、口腔白斑及口腔鱗癌中的Survivin表達進行檢測，結(jié)果顯示：在正常口腔粘膜中未出現(xiàn)Survivin陽性表達；在口腔白斑中發(fā)現(xiàn)隨著異常程度的加重，Survivin的陽性表達率逐漸升高；在口腔鱗癌中發(fā)現(xiàn)隨著癌細胞分化程度的降低，Survivin的陽性表達率逐漸升高，這充分說明了Survivin的陽性表達和細胞的增殖分化程度相關(guān)，可作為口腔惡性腫瘤的診斷標(biāo)志物[19]。本次研究也對上述觀點予以證實，本文采用免疫組化檢測方法對口腔黏膜中的Survivin表達情況進行觀察研究，結(jié)果顯示健康人群口腔粘膜上皮組織中未出現(xiàn)Survivin陽性表達；OSF患者出現(xiàn)少量Survivin陽性表達，OSF癌變患者出現(xiàn)大量Survivin陽性表達，三組之間具有明顯統(tǒng)計學(xué)差異，這說明Survivin的表達可能與OSF的癌變具有一定關(guān)系，對其進行檢測能幫助早期診斷OSF癌變。

4結(jié)論

本研究表明，Survivin蛋白在OSF和OSF癌變組織中均存在不同程度的陽性表達，OSF癌變組織中其陽性表達率較OSF組織更為明顯，提示Survivin和OSF癌變的發(fā)生具有一定關(guān)系，可將其作為OSF癌變的早期診斷標(biāo)志物。

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The expression and clinical significance of survivin in oral submucous fibrosis and cancer

ZHANG Dagong，WEI Qian，XIA Jinsheng

(DepartmentofStomatology,CentralHospitalofShanghaiFengxian，Shanghai201400,China)

【Abstract】ObjectiveTo analyze the expression and clinical significance of survivin in oral submucous fibrosis (OSF) and cancer. Methods17 patients with OSF and 18 patients with malignant transformation of OSF were controlled with 20 healthy people. The expression of surviving was observed.ResultsSurvivin positive expression does not appear health human oral mucosa epithelial tissue. The originating from OSF patients survivin expression positive rate (94.4%) was significantly higher than that of OSF patients (47.1%) (P<0.05). OSF patients early, middle and late stage of survivin expression positive rate showed an increasing trend, but the difference was not statistically significant (P>0.05).ConclusionThe level of survivin has important significance for diagnosis of oral submucous fibrosis carcinogenesis, which be used as the early diagnostic marker.

【Key words】Survivin；Oral submucous fibrosis; Cancerous; Express; Clinical significance

(收稿日期：2015-08-03； 編輯： 陳舟貴)

【中圖分類號】R 739.85

【文獻標(biāo)志碼】A

doi：10.3969/j.issn.1672-3511.2016.04.007

基金項目：上海市教委科研基金項目(SJY02014)