大葉桉精油對(duì)ESBLs肺炎克雷伯菌體外抑制作用及對(duì)質(zhì)粒的消除作用△

黃軼凡張國華林亮君丘　敏（.中山市西區(qū)醫(yī)院　中山　5840；.中山市小欖人民醫(yī)院　中山　5845）

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大葉桉精油對(duì)ESBLs肺炎克雷伯菌體外抑制作用及對(duì)質(zhì)粒的消除作用△

黃軼凡1張國華2林亮君1丘敏1（1.中山市西區(qū)醫(yī)院中山528401；2.中山市小欖人民醫(yī)院中山528415）

摘要：目的：探討大葉桉精油對(duì)ESBLs肺炎克雷伯菌體外抑制作用及對(duì)質(zhì)粒的消除作用。方法：采用牛津杯法和逐個(gè)檢出法分別檢測大葉桉精油對(duì)ESBLs肺炎克雷伯菌的抑制作用和對(duì)質(zhì)粒的消除作用。結(jié)果：大葉桉精油對(duì)ESBLs肺炎克雷伯菌的抑制作用顯著，MIC值為5ml/L，對(duì)ESBLs肺炎克雷伯菌作用24h和48h質(zhì)粒的消除率分別為35.4%和55.2%。結(jié)論：大葉桉精油對(duì)ESBLs肺炎克雷伯菌有顯著抑制作用和質(zhì)粒消除作用。

關(guān)鍵詞：大葉桉質(zhì)粒消除ESBLs肺炎克雷伯菌

近年來，隨著抗生素大量應(yīng)用，細(xì)菌的耐藥問題逐漸變成全球性的問題。超廣譜β-內(nèi)酰胺類抗生素的不合理應(yīng)用，導(dǎo)致細(xì)菌產(chǎn)生了由質(zhì)粒介導(dǎo)的超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（ESBLs），從而對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥，其所含耐藥基因可由質(zhì)粒、整合子或轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)在不同菌種之間進(jìn)行重排或轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致多重耐藥[1]。據(jù)報(bào)道，我國不同地區(qū)14所醫(yī)院臨床分離菌中，克雷伯菌屬產(chǎn)ESBLs的百分率平均為41.4%[2]，北京某醫(yī)院的細(xì)菌監(jiān)測報(bào)告顯示，其院內(nèi)產(chǎn)肺炎克雷伯菌（klebsiella pneumoniae）產(chǎn)ESBLs率達(dá)56.1%[3]，受ESBLs肺炎克雷伯菌引發(fā)的肺部感染已成為臨床治療的一個(gè)難題。目前研究認(rèn)為，ESBLs酶的產(chǎn)生耐藥與耐藥質(zhì)粒的介導(dǎo)密切相關(guān)。因此，質(zhì)粒消除或抑制是當(dāng)前解決ESBLs耐藥菌耐藥性的研究熱點(diǎn)。前期研究表明大葉桉精油具有良好的廣譜抑菌作用[4，5]，本文進(jìn)一步從大葉桉精油對(duì)ESBLs肺炎克雷伯菌質(zhì)粒的消除作用進(jìn)行探討，以期尋找可靠有效的ESBLs肺炎克雷伯菌質(zhì)粒消除劑提供依據(jù)。

1　實(shí)驗(yàn)材料

1.1供試菌株：ESBLs肺炎克雷伯菌，為中山市中醫(yī)院檢驗(yàn)科微生物室臨床分離菌株；質(zhì)控肺炎克雷伯菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（ATCC4352），購于南京便診生物科技有限公司；實(shí)驗(yàn)操作在中山市中醫(yī)院檢驗(yàn)科微生物室完成。

1.2藥物：大葉桉由廣州至信藥業(yè)有限公司提供，經(jīng)鑒定為桃金娘科Eucalyptus robusta Smith的干燥葉。

1.3試劑與儀器：MH瓊脂培養(yǎng)基（江門市凱林貿(mào)易有限公司）；無菌空白藥敏試紙（OXOID）；吐溫-80（廣州化學(xué)試劑廠）；XSW-CJ-2A標(biāo)準(zhǔn)型凈化工作臺(tái)（吳江市津化設(shè)備總廠）；LRH-250A生化培養(yǎng)箱（廣東省醫(yī)療器械廠）；DL-ZD1濁度儀（珠海迪爾生物工程有限公司）；LMQR-4060型立式滅菌器（山東新華醫(yī)療器械股份有限公司）；針筒式濾膜過濾器（Millipore）。

2　實(shí)驗(yàn)方法

2.1 MRSA菌懸液的制備：ESBLs肺炎克雷伯菌經(jīng)平板分離培養(yǎng)24h后，用無菌接種環(huán)挑取數(shù)個(gè)菌落置于生理鹽水稀釋液中，用濁度儀校正濃度至0.5麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)液。

2.2大葉桉精油制備：大葉桉剪碎后用水蒸氣蒸餾法固液比1:6提取揮發(fā)油，無水硫酸鈉干燥備用。

2.3大葉桉精油抑菌活性實(shí)驗(yàn)[6]：大葉桉精油用1%的吐溫80無菌水溶液（針筒式濾膜過濾器過濾除菌）稀釋成150.00、100.00、60.00、40.00、20.00、10.00、5.00、2.50、1.20mL/L的大葉桉精油稀釋液，用微量移液器吸取30μL各濃度大葉桉精油均勻涂布于無菌空白藥敏紙片，兩面各15μL。紙片吸透藥液后貼于接種了ESBLs肺炎克雷伯菌MH平板上，做好標(biāo)記，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。以平板中貼浸30μL有1%吐溫-80無菌水液（針筒式濾膜過濾器過濾除菌）的紙片為空白對(duì)照。用游標(biāo)卡尺測量各組抑菌圈直徑，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

判斷標(biāo)準(zhǔn)：不敏感（≤6.25mm，—），低度敏感（≤7mm，+），中度敏感（＞7mm，++），高度敏感（≥15mm，+++）。

抑菌率計(jì)算公式：抑菌率（%）=[（藥液抑菌圈平均直徑—空白紙片直徑）/空白紙片直徑]×100%。

2.4大葉桉精油對(duì)ESBLs肺炎克雷伯菌最低抑菌濃度（MIC）的測定[7]：用1%的吐溫80水溶液稀成150.00、100.00、60.00、40.00、20.00、10.00、5.00、2.50、1.20mL/L大葉桉揮發(fā)油稀釋液。用醫(yī)用無菌棉簽蘸取0.1%的ESBLs肺炎克雷伯菌懸液接種于MH（Mueller-Hinton Agar）瓊脂平板中，用無菌棉簽涂勻后，移取0.2mL各濃度揮發(fā)油稀釋液加于接種了MRSA菌的MH平板中，用無菌棉簽均勻涂布，倒置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。觀察ESBLs肺炎克雷伯菌生長情況，有菌落生長為陽性（+），未見菌落生長為陰性（-），以不生長ESBLs肺炎克雷伯菌菌落的精油最低濃度為大葉桉精油的MIC值。實(shí)驗(yàn)以1%的吐溫80無菌水溶液作對(duì)照，重復(fù)3次，記錄結(jié)果。

2.5慶大霉素和紅霉素對(duì)ESBLs肺炎克雷伯菌的MIC測定：將慶大霉素（Gm）和紅霉素（Em）用倍比稀釋法分別配制成128、256、512和1024μg/mL，MIC測定方法同“2.4”[7]。

2.6大葉桉精油對(duì)ESBLs肺炎克雷伯菌的質(zhì)粒消除作用

2.6.1抗生素選擇培養(yǎng)基的制備：將1/2 MIC濃度的慶大霉素和紅霉素分別加入LB培養(yǎng)基，配制成質(zhì)粒消除的選擇性培養(yǎng)基，現(xiàn)用現(xiàn)配。

2.6.2質(zhì)粒消除實(shí)驗(yàn)：用無菌棉簽蘸取0.1%的ESBLs肺炎克雷伯菌懸液接種于MH平板中，用無菌棉簽涂勻后，移取0.2mL小于MIC值濃度的大葉桉精油稀釋液加于接種了ESBLs肺炎克雷伯菌的MH平板中，用無菌棉簽均勻涂布，倒置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。選取菌落數(shù)在200～300個(gè)的平板，采用逐個(gè)檢出法分別接種在配制好的選擇培養(yǎng)基上和普通培養(yǎng)基平板上。37℃下培養(yǎng)24h和48h，觀察平板上的菌落數(shù)量并記錄結(jié)果。以不加藥液的培養(yǎng)基作空白對(duì)照，以SDS（十二烷基硫酸鈉）作為陽性對(duì)照組，每組重復(fù)3次，取其平均值[7]。

2.6.3質(zhì)粒消除的結(jié)果判定：在不含抗生素的平板上生長而在含抗生素的選擇平板上不生長，即為質(zhì)粒消除子（需在選擇培養(yǎng)基平板上進(jìn)行復(fù)試確認(rèn)）[7]。

質(zhì)粒消除率（%）=A/B×100%

A：在不含抗生素的普通培養(yǎng)基平板上生長而在含抗生素的選擇性培養(yǎng)基平板上不生長的菌落數(shù)；B：在不含抗生素的普通培養(yǎng)基平板上生長的菌落數(shù)。

2.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用SPSS19.0軟件進(jìn)行X2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3　實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

3.1大葉桉精油對(duì)ESBLs肺炎克雷伯菌抑菌活性影響：大葉桉精油稀釋濃度≥40mL/L對(duì)ESBLs肺炎克雷伯菌呈高度敏感性，抑菌圈在15mm以上，抑菌率均大于140%；大葉桉精油稀釋濃度5～20mL/L對(duì)ESBLs肺炎克雷伯菌呈中度敏感性，抑菌圈在8.33～10.93mm，抑菌率在33.28%～74.88%；大葉桉精油稀釋濃度低于5mL/L對(duì)ESBLs肺炎克雷伯菌呈低度敏感性，抑菌圈小于8.33mm，抑菌率小于33.28%，詳見表1。

表1　大葉桉精油對(duì)ESBLs肺炎克雷伯菌抑菌活性影響結(jié)果

3.2大葉桉精油對(duì)ESBLs肺炎克雷伯菌最低抑菌濃度（MIC）的測定：大葉桉精油濃度≥5ml/L培養(yǎng)皿均未見ESBLs肺炎克雷伯菌生長，故大葉桉精油對(duì)ESBLs肺炎克雷伯菌的MIC為5mL/L，詳見表2。

表2　大葉桉精油對(duì)ESBLs肺炎克雷伯菌MIC測定結(jié)果

3.3兩種抗生素對(duì)ESBLs肺炎克雷伯菌最低抑菌濃度（MIC）的測定結(jié)果：慶大霉素和紅霉素在1024mg/mL濃度以上的培養(yǎng)皿均未見ESBLs肺炎克雷伯菌生長，故慶大霉素和紅霉素對(duì)ESBLs肺炎克雷伯菌的MIC值均大于1024mg/mL，該劑量下可用于質(zhì)粒消除實(shí)驗(yàn)，詳見表3。

表3　兩種抗生素對(duì)ESBLs肺炎克雷伯菌MIC的測定結(jié)果

3.4大葉桉精油對(duì)ESBLs肺炎克雷伯菌的質(zhì)粒消除的結(jié)果：大葉桉精油作用于ESBLs肺炎克雷伯菌24h和48h質(zhì)粒的消除率分別為35.4%和55.2%，表現(xiàn)出較好的質(zhì)粒消除作用，其消除效果跟時(shí)間呈相關(guān)性，作用時(shí)間延長對(duì)質(zhì)粒消除效果越好，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），詳見表4。

表4　大葉桉精油作用24h對(duì)ESBLs肺炎克雷伯菌質(zhì)粒的消除率

4　討論

現(xiàn)代研究表明，高溫培養(yǎng)、溴化乙啶、紫外照射及SDS（十二烷基硫酸鈉）均具有良好的R質(zhì)粒消除作用，但這些方法要么毒副作用強(qiáng)，要么操作性差，較難在臨床應(yīng)用[8]。中草藥中清熱解毒的藥物大部分具有較好的抗菌作用，而從中發(fā)掘天然無毒高效的質(zhì)粒消除劑是當(dāng)前的熱點(diǎn)。已有研究發(fā)現(xiàn)黃連、紫花地丁、艾葉等對(duì)大腸埃希菌質(zhì)粒具有消除作用[9]，黃柏和甘草對(duì)MRSA菌質(zhì)粒也有消除作用，作用48h質(zhì)粒消除率近30%[7]。組方清肺湯對(duì)耐藥質(zhì)粒的消除率為45%，與西藥聯(lián)用對(duì)肺炎克雷伯菌R質(zhì)粒的消除率為37.5%，有助于恢復(fù)和增強(qiáng)耐藥菌株對(duì)抗生素的敏感性[10]。大葉桉是南方經(jīng)濟(jì)樹種，植株高大，從中提取出來的大葉桉精油含量高，具有很好的研究開發(fā)價(jià)值。研究發(fā)現(xiàn)，大葉桉精油在抗炎、抗菌、抗氧化等方面均有較好的藥理作用[11]。本文采用牛津杯法和逐個(gè)檢出法分別檢測大葉桉精油對(duì)ESBLs肺炎克雷伯菌的抑制作用和對(duì)質(zhì)粒的消除作用，結(jié)果顯示大葉桉精油對(duì)ESBLs肺炎克雷伯菌具有較好的抑制作用，其MIC為5mL/L，作用24h和48h對(duì)ESBLs肺炎克雷伯菌質(zhì)粒的消除率分別為35.4%和55.2%，并隨時(shí)間延長質(zhì)粒消除作用增強(qiáng)，是較理想的質(zhì)粒消除劑，具有研究開發(fā)價(jià)值。

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Inhibition and plasmid elimination effect of volatile oil of Eucalyptus robusta on ESBLs klebsiella pneumoniae

Hunag Yifan1Zhang Guohua2Lin Liangjun1Qiu Min1（1.Western Hospital of Zhongshan City，Zhongshan Guangdong Province 528401，China；2.Xiaolan People’s Hospital of Zhongshan City，Zhongshan Guangdong Province 528415，China）

Abstract：Objective：To study the inhibition and plasmid elimination of volatile oil of Eucalyptus robusta on ESBLs klebsiella pneumoniae（KPN）. Methods：The inhibition and plasmid elimination of volatile oil in ESBLs KPN were determined by Oxford cup and one-by-one detection methods, respectively. Results：The growth of ESBLs KPN was obviously inhibited by volatile oil, with the MIC of 5 mL/L. The plasmid elimination rates were 35.4% at 24 h and 55.2% at 48 h.Conclusion：The volatile oil of Eucalyptus robusta possesses the significant inhibition and plasmid elimination on ESBLs KPN.

Key words:Eucalyptus robusta Plasmid elimination ESBLs klebsiella pneumonia

基金項(xiàng)目：△中山市衛(wèi)生局醫(yī)學(xué)科研立項(xiàng)（2015A020418）

中圖分類號(hào)：R563.1

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B

文章編號(hào)：1672-8351（2016）04-0109-02