超高效液相色譜泊聯(lián)質(zhì)譜同時測定首烏藤中13種成分

羅益遠(yuǎn) 劉娟秀 王鋒 劉訓(xùn)紅 王勝男 華愉教 蘭才武

[摘要]建立超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLCMS/MS）同時測定首烏藤中二苯乙烯（二苯乙烯苷、虎杖苷、白藜蘆醇）、蒽醌（大黃素、大黃素甲醚、大黃素8βD葡萄糖苷、蘆薈大黃素）、黃酮（表兒茶素、蘆丁、金絲桃苷、紫云英苷、槲皮素）及酚酸（沒食子酸）等13種成分的方法。采用Waters BEH C18（21 mm×100 mm，17 μm）色譜柱，流動相為水（含01%甲酸）乙腈，梯度洗脫，柱溫35 ℃，流速025 mL·min-1，采用電噴霧離子源（ESI），多反應(yīng)離子監(jiān)測（MRM）掃描方式進(jìn)行檢測。采用TOPSIS法對13種成分進(jìn)行分析評價。結(jié)果13種成分在一定濃度范圍內(nèi)均呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)大于0991 5，精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性良好；加樣回收率在9524%～1023%，RSD均小于5%。TOPSIS分析顯示廣州產(chǎn)的樣品綜合質(zhì)量較好。所建立的方法準(zhǔn)確、專屬性、重復(fù)性較好，可用于首烏藤中多元功效物質(zhì)或指標(biāo)成分的同時測定，為首烏藤藥材內(nèi)在質(zhì)量的綜合評價和全面控制提供新的方法參考。

[關(guān)鍵詞]首烏藤；UPLCMS/MS；二苯乙烯類；蒽醌；黃酮；酚酸；同時測定

[Abstract]A comprehensive analytical method based on UPLCMS/MS was developed for the simultaneous determination of thirteen components including three stilbenes （stilbeneglucoside， polydatin， resveratrol）， four anthraquinones （emodin， physcion， emodin8βDglucopyranoside， aloeemodin）， five flavonoids （epicatechin， rutin， hyperoside， astragalin，quercetin） and one phenolic acid （gallic acid） in Polygoni Multifori CaulisThe separation was carried out on a Waters BEH C18 column（21 mm×100 mm，17 μm）with gradient elution of acetonitrilewater （01% acetic acid） at a flow rate of 025 mL·min-1， and column temperature was 35 ℃ The target compounds were analyzed by multiple reaction monitoring （MRM） mode TOPSIS analysis ware performed to evaluate the samples from different areas and commercial herbs according to the contents of thirteen components The correlation coefficients of all the calibration curves were higher than 0991 5 The average recoveries ranged from 9524% to 1023%， and the relative standard deviations were less than 5% The result of TOPSIS analysis showed that the comprehensive quality of Polygoni Multifori Caulis sample from Guangzhou was better The developed method with good repeatability and accuracy was suitable for the simultaneous determination of multiple functional substances， which provided a new basis for the comprehensive assessment and overall control of the quality of Polygoni Multifori Caulis

[Key words]Polygoni Multifori Caulis； UPLCMS/MS； stilbenes； anthraquinones； flavonoids； phenolic acids； simultaneous determination

doi：10.4268/cjcmm20160818

首烏藤為蓼科植物何首烏Polygonum multiflorum Thunb的干燥藤莖，具有養(yǎng)血安神、祛風(fēng)通絡(luò)的功效，臨床用于治療失眠多夢、血虛身痛、風(fēng)濕痹痛、皮膚瘙癢[1]，已被列入衛(wèi)生部公布的可用于保健食品的物品名單，其改善睡眠的主要有效成分為蒽醌類、黃酮類[23]?！吨袊幍洹?015年版一部首烏藤質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)只規(guī)定了2，3，5，4′四羥基二苯乙烯2OβD葡萄糖苷的含量測定，而某些以首烏藤為主藥的復(fù)方制劑（如首珍顆粒、加味安爾眠顆粒等）則以蒽醌類成分為質(zhì)控指標(biāo)[45]。為確保以首烏藤為主藥的復(fù)方制劑的成品質(zhì)量，需建立首烏藤中多元功效物質(zhì)含量測定的方法，以全面控制首烏藤原藥材的內(nèi)在質(zhì)量。本實(shí)驗(yàn)在前期研究基礎(chǔ)上[69]，采用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（UPLCMS/MS）聯(lián)用技術(shù)同時測定首烏藤藥材中二苯乙烯（二苯乙烯苷、虎杖苷和白藜蘆醇）、蒽醌（蘆薈大黃素、大黃素8βD吡喃葡萄糖苷、大黃素和大黃素甲醚）、黃酮（表兒茶素、蘆丁、金絲桃苷、紫云英苷和槲皮素）和酚酸（沒食子酸）等13種成分的含量，結(jié)合TOPSIS分析[1013]，對首烏藤不同產(chǎn)地或商品藥材進(jìn)行綜合評價，為首烏藤藥材的內(nèi)在質(zhì)量的綜合評價和全面控制提供科學(xué)依據(jù)。

1材料

超高效液相色譜TQD 質(zhì)譜聯(lián)用儀，Acquity系統(tǒng)，Masslynx V41 工作站（美國Waters公司產(chǎn)品）；KQ500B超聲波清洗機(jī)（昆山超聲儀器有限公司，超聲功率500 W，40 kHz）；BSA2245型電子分析天平（1/10萬，德國賽多利斯公司）；ME36S型電子分析天平（1/100萬，德國賽多利斯公司）。高速離心機(jī)（H1650W，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)儀器開發(fā)有限公司）。

對照品二苯乙烯苷（批號110844200607）、大黃素（批號110756200110）、蘆薈大黃素（批號07959803）、大黃素甲醚（批號0758200206）、表兒茶素（批號10878200102）、沒食子酸（批號110831200302）、槲皮素（批號100081200907）、蘆?。ㄅ?0809705）、金絲桃苷（批號111521200303）、槲皮素（批號100081200406）、紫云英苷（批號11092001）購自中國食品藥品檢定研究院，純度均大于98%；虎杖苷（批號YY90052）、白藜蘆醇（批號YY90051）、大黃素8βD葡萄糖苷（批號YY90555）購自上海源葉生物科技有限公司，純度均大于98%。水為超純水（由Millipore純水器制備），乙腈、甲醇（色譜純，德國Merk公司），甲酸（色譜純，美國ROE公司），其余試劑均為分析純。

首烏藤藥材樣品均為實(shí)地采集或由相關(guān)醫(yī)療單位提供，編號及來源如下：S1采自南京中醫(yī)藥大學(xué)藥苑、S2采自江蘇省句容馬山、S3四川產(chǎn)，由江蘇省中醫(yī)院提供（批號131209）、S4湖北產(chǎn)，由南京大華中藥店提供（批號130901）、S5湖北產(chǎn)，由南京益大藥店提供（批號130614）、S6廣東產(chǎn)，由北京同仁堂南京店提供（批號130513046）。所有樣品均經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院劉訓(xùn)紅教授鑒定為何首烏P multiflorum的藤莖。留樣憑證保存于南京中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定實(shí)驗(yàn)室。

2方法與結(jié)果

21色譜條件

色譜柱Waters BEH C18（21 mm×100 mm，17 μm）；流動相水（含01%甲酸，A）乙腈（B）；梯度洗脫0～1 min，10% B；1～2 min，10%～90% B；2～3min，90% B；3～4 min，90%～10% B；4～5 min，10% B。柱溫35 ℃，流速025 mL·min-1，進(jìn)樣量5 μL。

22質(zhì)譜條件

離子化方式：電噴霧離子化（ESI），多反應(yīng)監(jiān)測離子掃描模式（MRM）測定，主要質(zhì)譜參數(shù)為：脫溶劑溫度為400 ℃，錐孔氣體積流量為50 L·h-1，正離子模式下毛細(xì)管電壓為 35 kV，脫溶劑氣體積流量為 800 L·h-1；負(fù)離子模式下毛細(xì)管電壓25 kV，脫溶劑氣體積流量為550 L·h-1。13種成分的質(zhì)譜具體參數(shù)見表1。

23對照品溶液制備

精密稱取表兒茶素642 mg、蘆丁211 mg、金絲桃苷150 mg、二苯乙烯苷213 mg、紫云英苷178 mg、白藜蘆醇263 mg、槲皮素155 mg、沒食子酸549 mg、蘆薈大黃素027 mg、大黃素8βD葡萄糖苷2520 mg、大黃素1485 mg、虎杖苷

238 mg、大黃素甲醚1460 mg對照品，分別置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度。取各對照品母液適量，加甲醇配制成含上述對照品的混合儲備液，并逐級稀釋，得到一系列不同濃度的混合對照品溶液，4℃保存，備用。

24供試品溶液制備

取干燥恒重樣品粉碎過80目篩，精密稱取樣品粉末10 g，平行稱取2份，置于100 mL具塞錐形瓶中，加入25 mL 70%甲醇，稱重，室溫下超聲提取45 min后取出，放冷以70%甲醇補(bǔ)足失重，靜置冷卻，保存于4 ℃。測定時精密吸取1mL，置于100 mL量瓶中，用初始流動相乙腈01%甲酸 1∶9定容至刻度，搖勻，12 000 r·min-1離心10 min，取上清液經(jīng)022 μm的微孔濾膜濾過，即得。

25線性關(guān)系、檢測限和定量限

精密吸取23項(xiàng)下混合對品照標(biāo)溶液，置于10 mL量瓶中，用初始流動相乙腈01%甲酸水1∶9逐級稀釋制成一系列濃度的混合對照品溶液，按上述色譜質(zhì)譜條件進(jìn)樣分析，以對照品的峰面積（Y）對相應(yīng)的濃度（X）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍。以各化合的信噪比（S/N）等于3時相對應(yīng)的濃度確定為最低檢測限（LOD），以各化合的信噪比（S/N）等于10時相對應(yīng)的濃度確定為最低定量限（LOQ）。結(jié)果見表2， 圖1。

26方法學(xué)考察

精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性試驗(yàn)精密吸取同一混合對照溶液分別重復(fù)進(jìn)樣6次，分別計算13種成分的峰面積的RSD；取同一樣品，按照樣品制備方法制備供試品溶液，進(jìn)樣，重復(fù)測定6次，計算各成分的

含量的RSD；取同一樣品制備供試品溶液，分別在0，2，4，8，12，24 h測定13種成分的含量并計算其RSD，結(jié)果見表3。

加樣回收率試驗(yàn)取已知含量的樣品05 g（6份），精密稱定，置錐形瓶中，分別精密加入一定量各對照品溶液，根據(jù)24項(xiàng)下方法制備加樣回收率供試品溶液，根據(jù)樣品測定方法進(jìn)樣，計算各成分的平均回收率及RSD，結(jié)果見表3。

27樣品測定

取24項(xiàng)下各首烏藤供試品溶液，按照上述色譜質(zhì)譜條件測定，根據(jù)相應(yīng)線性關(guān)系計算供試樣品中13種成分的含量，測定結(jié)果見表4。

28Topsis分析

以各成分含量為分析指標(biāo)，采用Topsis分析方法對首烏藤藥材中13種目標(biāo)成分進(jìn)行綜合分析評價，得出排序結(jié)果。

281歸一化處理將首烏藤藥材中13種目標(biāo)成分的含量數(shù)據(jù)矩陣進(jìn)行歸一化處理，建立相應(yīng)矩陣，歸一化處理后的矩陣見表4。

αijXij/∑ni=1X2ij（原高優(yōu)指標(biāo)）

X′ij/∑ni=1（X′ij）2（原低優(yōu)指標(biāo)）

注：式中Xij表示第i個評價對象在第j個指標(biāo)上的取值。X′ij表示經(jīng)倒數(shù)轉(zhuǎn)換后的第i個評價對象在第j個指標(biāo)上的取值，αij表示第i個評價指標(biāo)在第j個評價指標(biāo)上歸一化處理后的取值。

282最優(yōu)方案與最劣方案根據(jù)歸一化處理后的矩陣得到最優(yōu)值和最劣值向量，即有限方案中的最優(yōu)方案（A+）與最劣方案（A-）

A+=（0548， 0536， 0416， 0488， 0593， 0612， 0495， 0655， 0631， 0539， 0998， 0877， 0800）

A-=（0256， 0179， 0396， 0373， 0216， 0153， 0322， 0095， 0241， 0352， 0005， 0080， 0096）

283Di+與Di-的計算分別計算各評價對象與最優(yōu)方案及最劣方案的距離Di+與Di-

D+i∑10j=1（α+ij-αij）2

D-i∑10j=1（α-ij-αij）2

式中D+i與D-i分別表示第i個評價指標(biāo)與最優(yōu)方案及最劣方案的距離；αij表示某個評價對象i在第j個指標(biāo)的取值。

284Ci的計算計算各評價對象與最優(yōu)方案的接近程度。

Ci=D-iD+i+D-i

285Topsis分析方法按照Ci大小將各評價對象排序，Ci越大，表示綜合質(zhì)量越好。首烏藤藥材的Topsis評價結(jié)果見表5。

3討論

31色譜條件的優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)考察了甲醇水、乙腈水、甲醇01%甲酸水、乙腈01%甲酸水等溶劑作為流動相，結(jié)果發(fā)現(xiàn)

采用乙腈作為流動相時的分離效果明顯優(yōu)于甲醇，在流動相中加入一定比例的甲酸可增強(qiáng)樣品中待測物的保留，并減少色譜峰拖尾，從而提高分析方法的分離效果和靈敏度。因此本實(shí)驗(yàn)采用乙腈01%甲酸水作為流動相梯度洗脫。

32質(zhì)譜條件的優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)同時選用正負(fù)2種離子模式測定13種目標(biāo)成分的含量，其中二苯乙烯苷、白藜蘆醇選擇負(fù)離子模式，經(jīng)過反復(fù)試驗(yàn)考察，發(fā)現(xiàn)這幾種成分具有較好的穩(wěn)定性，具有較高的響應(yīng)值和更好的峰形。其他成分選擇正離子模式，也均能使各成分在檢測條件下更穩(wěn)定，峰形及響應(yīng)值更佳。

33供試品制備方法的優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)中對提取溶劑（60%，70%，80%，90%，100%甲醇）、料液比（1∶15，1∶20，1∶25，1∶30，1∶35）及提取時間（15，30，45，60 min）進(jìn)行了考察。結(jié)果表明，70%甲醇作為最適合的溶劑可以提取出更多待測物；以料液比1∶25，超聲提取45 min具有較好的提取效率。因此選擇以70%甲醇作為溶劑，料液比1∶25、超聲提取45 min。

34結(jié)果分析

測定結(jié)果表明，首烏藤藥材的13種指標(biāo)成分中，以二苯乙烯苷和大黃素8βD吡喃葡萄糖苷的含量較高，其次為大黃素甲醚、大黃素及虎杖苷，這5種成分的總量達(dá)179%以上；不同產(chǎn)地及商品藥材中13種成分的含量有所差異，二苯乙烯苷、虎杖苷及沒食子酸的含量以廣州產(chǎn)樣品（S6）較高，所測4種蒽醌的總量、5種黃酮的總量以四川產(chǎn)樣品（S3）較高；所分析的首烏藤樣品中，其二苯乙烯苷含量均符合《中國藥典》2015年版一部的標(biāo)準(zhǔn)，僅單一成分為評價指標(biāo)難以反映藥材的整體質(zhì)量，測定多元指標(biāo)成分的含量對中藥材的質(zhì)量控制更為全面。由于首烏藤不同產(chǎn)地及商品藥材中多元指標(biāo)成分含量不一，難以直觀評價，因而用TOPSIS分析法進(jìn)行綜合評價，以克服了人為確定權(quán)重系數(shù)的片面性及主觀性，從而提高分析方法的可靠性。綜合評價結(jié)果顯示，廣州產(chǎn)首烏藤樣品（S6）的綜合質(zhì)量較好。

本實(shí)驗(yàn)建立了超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（UPLCMS/MS）技術(shù)同時測定首烏藤中二苯乙烯苷、虎杖苷、白藜蘆醇、蘆薈大黃素、大黃素8βD吡喃葡萄糖苷、大黃素、大黃素甲醚、表兒茶素、蘆丁、金絲桃苷、紫云英苷、槲皮素、沒食子酸含量的方法，并對不同產(chǎn)地或商品藥材進(jìn)行TOPSIS綜合評價，可為首烏藤藥材內(nèi)在質(zhì)量的綜合評價和全面控制提供新的方法參考。

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[責(zé)任編輯丁廣治]