超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜同時(shí)測(cè)定雷公藤藥材中5個(gè)有效成分

胡峻 劉超 郭蘭萍 郝慶秀 康利平 南鐵貴 劉勇 詹志來 黃璐琦

[摘要]該文建立了超高效液相色譜電噴霧串聯(lián)三重四級(jí)桿質(zhì)譜同時(shí)測(cè)定雷公藤藥材中5種有效成分的方法，并比較了不同產(chǎn)地及來源的雷公藤藥材中5種有效成分的含量差別。以乙腈2%甲酸銨水為流動(dòng)相洗脫，Waters ACQUITY UPLCCSHC18S柱（21 mm×100 mm，17 μm），以電噴霧離子源為接口， 正離子模式掃描，質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式檢測(cè)。結(jié)果表明，5種有效成分在各自線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r>0997 8），加樣回收率在9672%～1032%，RSD為10%～24%。該研究所建立的方法穩(wěn)定性、精密度、重復(fù)性良好，適用于雷公藤中有效成分的含量測(cè)定；不同來源的雷公藤藥材中成分含量差異顯著，雷公藤藥材的質(zhì)量和安全性亟待提高，而對(duì)雷公藤藥材實(shí)施多指標(biāo)的含量控制是保證其臨床藥用安全可控的必要途徑。

[關(guān)鍵詞]超高效液相色譜電噴霧串聯(lián)三重四級(jí)桿質(zhì)譜；雷公藤；昆明山海棠；有效成分；含量測(cè)定

[Abstracts]This paper is aimed to develop a method for the determination of five effective components in medicinal material of Tripterygium using ultra performance liquid chromalography coupled withelectrospray ionization tandem mass spectrometry（UPLCESIMS/MS）， which then was used to study their contents in raw materials from different areas and different sourcesThe separation was performed on a Waters ACQUITY UPLCCSHC18S column（21 mm×100 mm，17 μm）， usingacetonitrile02% ammonium formateaqueous solutionas mobile phase The target components were detected in multiplereactionmonitoring（MRM） mode by mass spectrometry with electrospray ionization （ESI） source operated in positive ionization mode The quantitative results showed that good linearity wasachievedin their respective linear ranges and fine determination coefficient （r>0997 8），and the overall recoveries ranged from 9672%1032% with the RSD ranging from 10%24%The methodissensitive and accurate，and suitable for the effective components quantification in medicinal material of Tripterygium； contents of five effective components from different sources vary significantly， so the quality and safety of medicinal material of Tripterygium needs to be improved It is very important to control the quality with multiindex for clinic safety

[Key words]UPLCESIMS/MS； Tripterygium wilfordii； Tripterygium hypoglaucum； effective components； content determination

doi：10.4268/cjcmm20160817

雷公藤屬植物是重要的藥用植物，民間多做殺蟲劑使用，20世紀(jì)60年代因試用其治療麻風(fēng)反應(yīng)效果顯著，引起廣泛關(guān)注，并相繼開展了系統(tǒng)的研究，發(fā)現(xiàn)其有強(qiáng)大的抗炎、免疫抑制、抗腫瘤、抗生育等多種藥理作用，目前被廣泛在應(yīng)用于難治的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、腎病綜合癥、紅斑狼瘡、皮肌炎、大皰性皮膚病等，同樣對(duì)各型銀屑病也有顯著的療效[13]。雷公藤與昆明山海棠由于形態(tài)特征相近，在民間均做為藥用雷公藤的主要來源[45]，且兩者所含主要的化學(xué)成分均為三萜類、生物堿類、二萜內(nèi)酯類、倍半萜類、有機(jī)酸類、蒽醌類、黃酮類、木脂素等[68]，其中二萜內(nèi)酯類成分如雷公藤甲素、雷公藤內(nèi)酯酮是最主要的活性成分，生物堿類成分如雷公藤晉堿、雷公藤定堿、雷公藤次堿是含量最高的成分。但這些成分既是活性成分，也是有毒成分，時(shí)有報(bào)道其引起的不良反應(yīng)[916]。

目前對(duì)其質(zhì)量的評(píng)價(jià)主要采用單一指標(biāo)性成分，如斯金平等[17]以雷公藤甲素的含量來評(píng)價(jià)雷公藤藥材的質(zhì)量；高旋等[18]以雷公藤內(nèi)酯醇來評(píng)價(jià)不同藥材部位及產(chǎn)地的雷公藤藥材質(zhì)量，但單一化學(xué)成分不能全面反映藥材的質(zhì)量。而多指標(biāo)評(píng)價(jià)主要采用液相色譜法，如張茹萍等[19]運(yùn)用HPLC同時(shí)定量測(cè)定雷公藤藥材中6種有效成分并結(jié)合主成分分析法（PCA）評(píng)價(jià)不同產(chǎn)地的雷公藤藥材質(zhì)量，但HPLC耗時(shí)長(zhǎng)，且其靈敏度低，尤其對(duì)于沒有紫外吸收的成分以及含量較低的萜類等成分檢測(cè)存在困難，此外雷公藤藥材中幾個(gè)指標(biāo)性生物堿的含量較低，加上與其極性相近的結(jié)構(gòu)類似物較多，導(dǎo)致液相檢測(cè)峰型、分離度均較差，存在誤差較大的問題。

近年來興起的超高效液相色譜電噴霧串聯(lián)三重四級(jí)桿質(zhì)譜由于其分離速度快、靈敏度高、測(cè)定準(zhǔn)確性強(qiáng)已廣泛用于中藥及復(fù)方的分析中，尤其是微量成分的研究[20]。本實(shí)驗(yàn)基于超高效液相色譜電噴霧串聯(lián)三重四級(jí)桿質(zhì)譜建立了對(duì)雷公藤藥材根中5種有效成分進(jìn)行定量分析的方法，并對(duì)不同產(chǎn)地的雷公藤藥材中5種成分測(cè)定，比較其含量差異，以對(duì)雷公藤藥材的質(zhì)量進(jìn)行多指標(biāo)的控制，保證其用藥的安全。

1材料

ACQUITY IClass 超高效液相色譜儀（美國(guó)Waters 公司）；AB QTRAP 6500 三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀（美國(guó)ABsciex公司，數(shù)據(jù)采集Analyst ABsciex；數(shù)據(jù)分析Multiquant 30），BSA224S型1/1萬分析天平（德國(guó)Sartorius公司），Centrifuge 5415D型離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司），SB800DTD型超聲清洗機(jī)，超聲功率500W（寧波新芝生物科技股份有限公司），Pacific TⅡ型超純水儀（美國(guó)Thermo公司）。

化學(xué)對(duì)照品雷公藤甲素（批號(hào)PS14030304），雷公藤晉堿（批號(hào)PS07250010），雷公藤定堿（批號(hào)PS07250005）購(gòu)于成都普思生物科技股份有限公司，純度均>98%，雷公藤次堿（批號(hào)4001165865）購(gòu)于上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司，純度>98%，雷公藤內(nèi)酯酮（批號(hào)MUST14092810）購(gòu)于成都曼斯特生物科技有限公司，純度>98%。水為超純水，甲醇，乙腈為色譜純（Fishier Scientific公司），其余試劑均為分析純。

試驗(yàn)所用的為雷公藤及昆明山海棠的根，分別采自江西、湖南、云南、浙江等，均經(jīng)中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥資源中心郝近大研究員鑒定，留樣憑證存放于中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥資源中心，藥材來源見表1。

2方法與結(jié)果

21色譜分析條件

色譜條件為色譜柱Waters ACQUITY UPLCCSHC18S（21 mm×100 mm，17 μm）；流動(dòng)相為2%甲酸銨（A）乙腈（B），梯度洗脫；0～5 min，40%～70% B；51～7 min，100% B；71～9 min，40% B；流速05 mL·min-1；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量1 μL。

質(zhì)譜條件為離子源Turbo V，電離模式：（ESI+）；采集方式多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；離子化溫度（TEM） 550 ℃；噴霧電壓5 500 V；霧化氣（Gas 1） 55 kPa；輔助氣（Gas 2）：55 kPa；氣簾氣（CUR）： 30 kPa；碰撞氣（CAD）Medium；優(yōu)化的各離子對(duì)質(zhì)譜參數(shù)值， 見表2。

22對(duì)照品溶液的制備

精密稱取對(duì)照品雷公藤甲素，雷公藤內(nèi)酯酮，雷公藤次堿，雷公藤定堿，雷公藤晉堿對(duì)照品適量，置10 mL量瓶中，加適量甲醇超聲使其溶解，再加甲醇至刻度，搖勻，制得質(zhì)量濃度為23×102 mg·L-1的雷公藤甲素，14×102 mg·L-1雷公藤內(nèi)酯酮，09×102 mg·L-1的雷公藤次堿，17×102 mg·L-1的雷公藤定堿，17×102 mg·L-1的雷公藤晉堿對(duì)照品供試液。

23供試品溶液的制備

13批雷公藤藥材粉碎，過篩，精密稱取藥材粉末020 g置2 mL Ep管中，加入80%甲醇15 mL，超聲（功率500 W）提取1h，放置室溫，12 000 r·s-1離心10 min，取上清液，過022 μm的微孔濾膜，供UPLCQTRAP 分析。

24方法學(xué)考察

241方法專屬性

在上述色譜質(zhì)譜條件下， 混合對(duì)照品和樣品5種有效成分MRM定量離子圖見圖1。5種成分分離良好， 而空白基質(zhì)加標(biāo)樣品的分析表明基質(zhì)成分不干擾被測(cè)5種有效成分的檢測(cè)。

242線性范圍、檢測(cè)限、定量限

精密量取制備好的對(duì)照品溶液適量，稀釋到一定的濃度，再分別用甲醇稀釋配置成7個(gè)梯度濃度的對(duì)照品溶液，按已有色譜條件進(jìn)行分析。以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），對(duì)照品溶液的濃度為橫坐標(biāo)（X），

243精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性和回收率試驗(yàn)

2431精密度試驗(yàn)取一定濃度的混合對(duì)照品溶液，按照21項(xiàng)的色譜條件，重復(fù)進(jìn)樣6次，分別計(jì)算各成分面積的RSD在17%～26%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

2432重復(fù)性試驗(yàn)按照上述供試品溶液制備方法，取同一樣品平行制備6 份供試品溶液，按21項(xiàng)的色譜條件進(jìn)樣分析，測(cè)定各成分含量的RSD在13%～29%，表明方法重復(fù)性良好。

2433穩(wěn)定性試驗(yàn)取重復(fù)性試驗(yàn)中的同一份供試品溶液，按21項(xiàng)的色譜條件分別于0， 2， 4， 8， 12， 24 h 進(jìn)樣分析，分別計(jì)算各成分含量的RSD在25%～42%，結(jié)果表明供試品溶液室溫下在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2434回收率試驗(yàn)精密稱取已知含量的同一樣品6份，約020 g，精密加入低、中、高3個(gè)濃度的 5種對(duì)照品，按照供試品制備方法制備供試品溶液，按21項(xiàng)的色譜條件進(jìn)樣分析，計(jì)算5個(gè)成分的平均加樣回收率在9672%～1032%，其RSD在10%～24%，表明方法回收率良好，結(jié)果見表4。

25樣品測(cè)定

分別精密稱取13批的雷公藤樣品粉末約020 g，按供試品制備方法制備供試品溶液， 按21項(xiàng)的色譜條件進(jìn)樣分析， 分別計(jì)算各成分的含量，見表5。

3討論

在樣品分析過程中，本研究比較了不同粒徑色譜柱對(duì)雷公藤中5種成分的分離效果，考察了Waters HSS T3 C18（21 mm×100 mm，17 μm）， Waters CSHC18S（21 mm×100 mm，17 μm），Waters BEH C18（21 mm×100 mm，17 μm），Waters BEH C18（21 mm×50 mm，17 μm）4根色譜柱，最終選擇Waters CSHC18S（21 mm×100 mm，17 μm）柱，因其分離度和靈敏度均明顯高于其他超高效液相色譜柱。對(duì)于流動(dòng)相的選擇，考察了乙腈01%甲酸水、乙腈01%甲酸銨水、乙腈02%甲酸銨水，乙腈02%甲酸銨水最佳。另外，色譜分離上雷公藤定堿和雷公藤次堿無法有效分離，但在質(zhì)譜通道上2個(gè)化合的離子對(duì)不相互干擾，可以準(zhǔn)確定量。

對(duì)13個(gè)批次的雷公藤及昆明山海棠樣品進(jìn)行定量分析，在選定的色譜條件下，經(jīng)方法學(xué)考察，方法的重復(fù)性、穩(wěn)定性、精密度均符合有關(guān)規(guī)定，方法準(zhǔn)確可靠、簡(jiǎn)便快速。但是，不同批次的雷公藤藥材中雷公藤甲素、雷公藤內(nèi)酯酮、雷公藤定堿、雷公藤晉堿、雷公藤次堿含量差異較大。

從表5中可以看出，雷公藤定堿含量在江西萍鄉(xiāng)、湖南岳陽、浙江蘭溪的雷公藤中，江西遂川的昆明山海棠中含量較高；雷公藤內(nèi)酯酮含量在湖南岳陽、浙江新昌的雷公藤中，貴州劍河、福建泰寧的昆明山海棠中較高，且其都為栽培品；雷公藤甲素含量在浙江新昌，浙江蘭溪的雷公藤中，貴州劍河的昆明山海棠中含量較高。福建泰寧為雷公藤的道地產(chǎn)區(qū)，從表5中可以看出產(chǎn)地為福建泰寧的2個(gè)雷公藤樣品中雷公藤晉堿，雷公藤次堿含量較高。整體來說昆明山海棠中5個(gè)成分含量低于雷公藤。

綜上，本研究建立的UPLCESIMS/MS同時(shí)測(cè)定雷公藤中雷公藤甲素、雷公藤內(nèi)酯酮、雷公藤定堿、雷公藤晉堿、雷公藤次堿5種活性成分的定量方法簡(jiǎn)單、快捷、準(zhǔn)確，為綜合評(píng)價(jià)雷公藤藥材的質(zhì)量，保證其用藥的安全提供參考。

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[責(zé)任編輯丁廣治]