上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化在宮頸癌侵襲和轉(zhuǎn)移中的作用研究

巴彩霞 郭佳 白雪峰

[摘要] 目的 探討上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）對(duì)宮頸癌侵襲和轉(zhuǎn)移的影響。 方法 對(duì)33例宮頸浸潤(rùn)癌組織和23例宮頸原位癌組織（對(duì)照組）采用免疫組化方法進(jìn)行EMT標(biāo)志物的檢測(cè)。 結(jié)果 ①免疫組化檢測(cè)顯示56例宮頸癌組織中，發(fā)生浸潤(rùn)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移后，E-cadherin/β-catenin復(fù)合物的表達(dá)顯著低于原位癌組織（P<0.05），而Vimentin的表達(dá)顯著高于原位癌組織（P<0.05）。②浸潤(rùn)性宮頸癌組織中Fibronectin及N-cadherin表達(dá)與組織學(xué)分級(jí)密切相關(guān)。③FN的表達(dá)與癌組織的浸潤(rùn)深度相關(guān)。 結(jié)論 宮頸癌的侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程中存在著EMT現(xiàn)象，可以為宮頸癌的靶向治療提供理論依據(jù)。

[關(guān)鍵詞] EMT；宮頸癌；轉(zhuǎn)移；免疫組化

[中圖分類號(hào)] R737.3 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701（2016）09-0005-04

[Abstract] Objective To investigate the effect of EMT on the invasion and metastasis of cervical cancer. Methods Immunohistochemistry was use to detectded the expression of markers of EMT in 33 cases of invasive cervical cancer and 23 cases of cervical carcinoma in situ （control group）. Results ①Expression of E-cadherin/β-catenin in invasive carcinoma and lymph node metastasis group was lower than carcinoma in situ（P<0.05）， and expression of Vimentin in invasive carcinoma and lymph node metastasis group was higher than carcinoma in situ（P<0.05）. ②The expression of FN and N-cadherin had relations with histological grade in Invasive cervical cancer. ③The expression of FN had relations with invasive depth of carcinoma. Conclusion Invasion and metastasis of cervical cancer exists phenomenon of EMT， which may provide a theoretic basis for the targeted treatment of cervical cancer.

[Key words] EMT； Cervical cancer； Metastasis； Immunohistochemistry

上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是哺乳動(dòng)物胚胎發(fā)育過(guò)程中的生理現(xiàn)象，但不適當(dāng)?shù)腅MT使上皮性癌細(xì)胞獲得遷移侵襲的能力，影響著多種惡性腫瘤的進(jìn)展[1，2]。目前宮頸癌細(xì)胞如何獲得入侵周圍組織的能力依然未知，但普遍認(rèn)為EMT發(fā)揮了重要的作用。一些分子表型表達(dá)情況與EMT過(guò)程密切相關(guān)，被認(rèn)為是EMT的標(biāo)志物[3，4]。本研究檢測(cè)EMT相關(guān)標(biāo)志物上皮性鈣黏附蛋白（E-cadherin）、β-鏈蛋白（β-catenin）、神經(jīng)性鈣粘蛋白（N-cadherin）、纖連蛋白（Fibronectin，F(xiàn)N）及波形蛋白（Vimentin）在宮頸癌中的表達(dá)情況，探討EMT在宮頸癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用，為宮頸癌的治療和預(yù)后預(yù)測(cè)提供新的有價(jià)值的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料來(lái)源

收集我院2013年6月～2015年6月經(jīng)病理檢查明確診斷的宮頸鱗癌標(biāo)本56例（原位癌23例，浸潤(rùn)癌33例），患者年齡31～67歲，平均48歲。宮頸鱗癌患者在術(shù)前均未接受任何放療、化療和生物治療，并有完整的臨床資料、病理診斷及隨訪資料。

1.2 方法

手術(shù)標(biāo)本經(jīng)中性甲醛固定，石蠟包埋，4.5 μm厚切片，HE和免疫組化染色。免疫組化采用高壓MaxVision法。標(biāo)記一抗包括E-cadherin、β-catenin、N-cadherin、Fibronectin及Vimentin。所用免疫組化相關(guān)試劑購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司。

1.3 免疫組織化學(xué)結(jié)果判定

采用雙盲法閱片。①E-cadherin和β-catenin免疫組化陽(yáng)性物質(zhì)呈棕褐色，主要定位于細(xì)胞膜。>90%癌細(xì)胞細(xì)胞膜陽(yáng)性為高表達(dá)，<10%癌細(xì)胞細(xì)胞膜陽(yáng)性為無(wú)表達(dá)。②N-cadherin免疫組化陽(yáng)性物質(zhì)主要定位于細(xì)胞膜，Vimentin及Fibronectin免疫組化陽(yáng)性物質(zhì)主要定位于細(xì)胞質(zhì)。N-cadherin及Vimentin的判斷標(biāo)準(zhǔn)參照Nakajima S等的方法：≥20%癌細(xì)胞陽(yáng)性為陽(yáng)性表達(dá)；<20%癌細(xì)胞陽(yáng)性為陰性表達(dá)。Fibronectin正常時(shí)癌細(xì)胞不表達(dá)，發(fā)生EMT時(shí)癌細(xì)胞胞漿表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，組間陽(yáng)性率比較采用χ2檢驗(yàn)，以α=0.05為檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 E-cadherin/β-catenin復(fù)合物及Vimentin在宮頸癌中的表達(dá)

56例宮頸癌中，23例原位癌E-cadherin/β-catenin復(fù)合物表達(dá)率為37.80%（圖1、2），20例浸潤(rùn)癌無(wú)淋巴轉(zhuǎn)移E-cadherin/β-catenin復(fù)合物表達(dá)率為10.00%，13例浸潤(rùn)癌有淋巴轉(zhuǎn)移患者E-cadherin/β-catenin復(fù)合物表達(dá)率為7.69%（表1）。組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=6.79，P<0.05）。發(fā)生浸潤(rùn)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移后，E-cadherin/β-catenin表達(dá)下調(diào)。此外，在淋巴轉(zhuǎn)移中存在個(gè)別病例E-cadherin和β-catenin表達(dá)均缺失，而在無(wú)淋巴轉(zhuǎn)移時(shí)并未發(fā)現(xiàn)二者同時(shí)不表達(dá)的情況。

浸潤(rùn)癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組Vimentin陽(yáng)性率為53.80%（圖3），浸潤(rùn)癌無(wú)淋巴轉(zhuǎn)移Vimentin陽(yáng)性率為40.00%，而原位癌Vimentin陽(yáng)性表達(dá)率僅為13.00%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=7.23，P<0.05），說(shuō)明宮頸癌在發(fā)生浸潤(rùn)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移時(shí)，Vimentin的表達(dá)上調(diào)（表1）。在原位癌和無(wú)淋巴轉(zhuǎn)移時(shí)，個(gè)別病例Vimentin存在陽(yáng)性表達(dá)，但僅為弱陽(yáng)性或局灶陽(yáng)性。

2.2 FN及N-cadherin與宮頸浸潤(rùn)癌臨床病理特征的關(guān)系

在宮頸浸潤(rùn)癌中，F(xiàn)N及N-cadherin表達(dá)與組織學(xué)分級(jí)密切相關(guān)（圖4、5）（χ2=6.75、8.85，P<0.05），此外FN的表達(dá)與癌組織的浸潤(rùn)深度相關(guān)（χ2=5.94，P<0.05）（表2）；而五種EMT標(biāo)志物與宮頸癌的早期浸潤(rùn)及局部侵襲（頸管累犯）無(wú)明顯相關(guān)性（P>0.05）。

3 討論

腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT后，侵襲能力明顯增強(qiáng)[1]。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)許多腫瘤細(xì)胞系發(fā)生了部分或完全的EMT，瘤細(xì)胞失去了上皮細(xì)胞大部分的特征，而一些間葉來(lái)源細(xì)胞表型重新表達(dá)或高表達(dá)。相比于上皮細(xì)胞，間質(zhì)細(xì)胞不存在完整的細(xì)胞層結(jié)構(gòu)，呈纖維樣改變，但具有很強(qiáng)的移動(dòng)性和可塑性，能夠離開(kāi)原發(fā)灶，入侵和轉(zhuǎn)移至其他組織及器官。

E-cadherin屬于Ⅰ型鈣粘著蛋白，只表達(dá)于上皮細(xì)胞[5]。β-catenin是細(xì)胞粘附連接的組成成分，其與受體蛋白α-catenin相連后綁定于E-cadherin胞內(nèi)區(qū)域，形成E-cadherin-β-catenin-α-catenin復(fù)合體，與肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架連接。因此，E-cadherin/β-catenin復(fù)合物是構(gòu)建和維持細(xì)胞間聯(lián)系的核心力量。其缺失將導(dǎo)致細(xì)胞間粘附力下降而促使癌細(xì)胞的侵襲能力提升[6-9]，轉(zhuǎn)染E-cadherin cDNA到浸潤(rùn)性癌細(xì)胞里可抑制其轉(zhuǎn)移能力。我們發(fā)現(xiàn)宮頸癌發(fā)生浸潤(rùn)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移后，E-cadherin/β-catenin復(fù)合物表達(dá)下調(diào)，并且有個(gè)別病例E-cadherin和β-catenin表達(dá)同時(shí)缺失。Vimentin是一種重要的Ⅲ型中間絲蛋白，廣泛存在于間質(zhì)細(xì)胞及中胚層來(lái)源的細(xì)胞中，與癌細(xì)胞的粘附侵襲相關(guān)[8，10，11]。發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的宮頸癌，vimentin表達(dá)上調(diào)，陽(yáng)性率達(dá)53.80%。這些細(xì)胞表型的變化意味著細(xì)胞間粘附力下降，極性丟失。

EMT與E-cadherin表達(dá)下調(diào)相伴隨的是產(chǎn)生N-cadherin，稱為鈣粘蛋白的轉(zhuǎn)換，其主要表達(dá)于間葉細(xì)胞[12-15]，與多種腫瘤的惡性程度、浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。我們發(fā)現(xiàn)N-cadherin與宮頸浸潤(rùn)癌的病理組織學(xué)分級(jí)正相關(guān)，Ⅲ級(jí)時(shí)陽(yáng)性率最高。此外，另一種標(biāo)志物FN屬多粘附基質(zhì)蛋白，可作為腫瘤組織分化程度低、侵襲性強(qiáng)、易于復(fù)發(fā)的判斷指標(biāo)。FN的表達(dá)與宮頸癌的浸潤(rùn)深度及組織學(xué)分級(jí)正相關(guān)，癌組織浸潤(rùn)越深，細(xì)胞分化越差時(shí)，F(xiàn)N陽(yáng)性表達(dá)越高。

此外，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)宮頸原位癌早期浸潤(rùn)和浸潤(rùn)癌局部侵襲頸管與五種EMT標(biāo)志物沒(méi)有顯著的相關(guān)性，我們認(rèn)為可能是在宮頸癌早期和局部的發(fā)展中，沒(méi)有大量觸發(fā)EMT的因子，癌細(xì)胞沒(méi)有發(fā)生明顯的EMT過(guò)程，宮頸癌EMT在何時(shí)何處發(fā)生，受哪些因子激發(fā)和調(diào)控將是今后研究的一個(gè)有意義的方向。

目前，宮頸癌細(xì)胞EMT的機(jī)制成為研究的熱點(diǎn)，一些關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子被發(fā)現(xiàn)及報(bào)道。鋅指轉(zhuǎn)錄因子Snail家族在宮頸癌EMT發(fā)生的過(guò)程中起著重要的作用[16，17]。Snail能夠抑制緊密連接蛋白、閉合蛋白及血栓調(diào)節(jié)蛋白的表達(dá)，更是重要的E-cadherin轉(zhuǎn)錄抑制因子[17]，并和宮頸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[16]。E和結(jié)合鋅指蛋白（Zeb1/2）可下調(diào)E-cadherin的表達(dá)，Zeb1可誘導(dǎo)vimentin表達(dá)上調(diào)[18]。其表達(dá)與宮頸癌的侵襲性、盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期呈正相關(guān)[19]。另已發(fā)現(xiàn)Twist是一種在EMT過(guò)程中居于重要地位的基本螺旋-環(huán)-螺旋（basichelix-loop-hlix，bHLH）轉(zhuǎn)錄因子，抑制E-cadherin的表達(dá)[17]。Twist1的高表達(dá)預(yù)示宮頸癌的預(yù)后及放化療抵抗[20]；Twist2的表達(dá)則可預(yù)測(cè)宮頸鱗狀細(xì)胞癌的轉(zhuǎn)移潛力[17]。

此外，Hsu等[21]發(fā)現(xiàn)第三型鉀氯協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（KCC-3）參與宮頸癌EMT的發(fā)生，過(guò)度表達(dá)KCC-3的癌細(xì)胞呈現(xiàn)出EMT發(fā)生時(shí)的特征。阻斷KCC-3后癌細(xì)胞在細(xì)胞連接間E-cadherin and β-catenin的生成大量增加。KCC-3可抑制E-cadherin基因的轉(zhuǎn)錄和加速β-catenin蛋白的降解。在宮頸癌手術(shù)標(biāo)本中，腫瘤組織KKC-3表達(dá)水平與癌細(xì)胞增殖范圍密切相關(guān)。表皮生長(zhǎng)因子（EGFR）也可促使宮頸癌細(xì)胞發(fā)生相似的改變[22]。正常宮頸上皮細(xì)胞極少表達(dá)EGFR，EMT中的細(xì)胞形態(tài)和分子標(biāo)志不受EGFR刺激的影響。臨床手術(shù)標(biāo)本證實(shí)宮頸癌細(xì)胞EGFR過(guò)度表達(dá)與E-cadherin/β-catenin低表達(dá)伴隨發(fā)生。

綜上所述，宮頸癌的侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程中存在著EMT現(xiàn)象。癌細(xì)胞發(fā)生EMT后，細(xì)胞表型發(fā)生變化，侵襲轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)。然而，宮頸癌EMT體外實(shí)驗(yàn)面臨著諸多限制，幾乎沒(méi)有正常的癌細(xì)胞能夠經(jīng)歷完整的EMT過(guò)程，究其原因可能是EMT對(duì)培養(yǎng)環(huán)境非常敏感。在活體內(nèi)，EMT的分子機(jī)制仍然沒(méi)有得到全面完整的分析。但是隨著實(shí)驗(yàn)條件的完善，EMT過(guò)程及發(fā)生機(jī)制的研究將逐漸深入，最終能夠?yàn)閷m頸癌靶向藥物的研制及臨床治療提供可靠的依據(jù)。

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（收稿日期：2016-01-25）