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    根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)水稻成熟胚及抗褐飛虱基因植株的獲得

    2016-05-14 07:12:08李三和韓光明閘雯俊劉凱胡剛游艾青
    湖北農(nóng)業(yè)科學(xué) 2016年9期
    關(guān)鍵詞:飛虱粳稻轉(zhuǎn)基因

    李三和 韓光明 閘雯俊 劉凱 胡剛 游艾青

    摘要:以水稻(Oryza sativa L.)秈型兩系恢復(fù)系M5274和晚粳稻不育系N55S成熟胚為材料,以攜帶有雙元載體的根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105為載體進行抗飛虱基因Bph14、Bphi008A、Osgl的遺傳轉(zhuǎn)化,共獲得515棵再生植株,包括198株Bph14轉(zhuǎn)基因植株、72株Bphi008A轉(zhuǎn)基因植株和245株Osz!轉(zhuǎn)基因植株。PCR檢測結(jié)果表明,獲得的515株再生植株中,有244株陽性轉(zhuǎn)基因植株,3個不同抗褐飛虱基因中,轉(zhuǎn)Bvh14基因的再生苗陽性率最高,增加篩選次數(shù)能有效減少轉(zhuǎn)化所得的假陽性植株。

    關(guān)鍵詞:水稻(Oryza sativa L.);根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)介導(dǎo)轉(zhuǎn)化;抗褐飛虱基因

    中圖分類號:S511 文獻標(biāo)識碼:A 文章編號:0439-8114(2016)09-2392-04

    近年來,褐飛虱遷入中國的蟲量大,由于目前大多數(shù)水稻(Orvza sativa L.)品種不抗蟲,尤其是一些主要的雜交稻品種,對褐飛虱等蟲害還有“超感蟲性”(hyper-susceptibility)。目前,水稻褐飛虱已經(jīng)成為一種爆發(fā)力強、對水稻危害性極大的蟲害。由于褐飛虱的危害多發(fā)生在水稻成熟灌漿期,此時若大量使用殺蟲劑,對水稻的污染會非常嚴(yán)重,這也是中國水稻生產(chǎn)中迫切需要解決的重要問題。研究證明,利用抗褐飛虱基因培育抗蟲水稻品種是褐飛虱綜合防治中經(jīng)濟有效的方法。通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)與常規(guī)育種技術(shù)相結(jié)合培育抗褐飛虱水稻品種,有效控制褐飛虱的發(fā)生與危害,可確保中國水稻生產(chǎn)持續(xù)穩(wěn)定發(fā)展和國家糧食安全。根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)是對天然載體轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的一種模仿,已在水稻轉(zhuǎn)基因育種及功能基因組研究中被廣泛應(yīng)用,1994年以后,由于技術(shù)上的突破。相繼在不同水稻品種中獲得成功,轉(zhuǎn)化效率也大大提高,如粳稻的轉(zhuǎn)化率一般在30%左右,最高可達(dá)到64.6%。本研究以育種上應(yīng)用的典型秈型兩系恢復(fù)系M5274和晚粳稻不育系N55S為材料,利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法對褐飛虱抗性基因Bph14、Bphi008A、Osgl進行遺傳轉(zhuǎn)化,目的是通過3個抗褐飛虱基因的導(dǎo)入,探索水稻抗褐飛虱育種的新途徑,以期提高其產(chǎn)量和品質(zhì)。

    1 材料與方法

    1.1 植物受體材料

    兩系恢復(fù)系M5274、晚粳稻不育系N55S,由湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所選育。

    1.2 農(nóng)桿菌菌株與質(zhì)粒載體

    根癌農(nóng)桿菌菌株EHA105,質(zhì)粒PCAMBIA1300的T-DNA區(qū)含有潮霉素抗性基因(Hygr),抗褐飛虱基因Bph14、Bphi008A、Osgl由武漢大學(xué)提供。

    1.3 材料的處理及接種

    選取健康飽滿無病斑的成熟種子,除去穎殼,用75%乙醇浸泡1min,然后將種子置于新配制的0.1%氯化汞溶液中,攪拌10-12min。滅菌后用無菌水沖洗4-5次,最后將種子取出置于無菌濾紙上,待種子表面干燥后,以平擺法將其接種于各自不同的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上,每瓶12-14粒。每個品種接30瓶。

    1.4 水稻組織培養(yǎng)

    粳稻組織培養(yǎng)培養(yǎng)基見表1,秈稻組織培養(yǎng)基為LY培養(yǎng)基,購自武漢博遠(yuǎn)生物科技有限公司。將成熟胚表面按“1.3”的方法消毒后接種于愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。

    1.5 農(nóng)桿菌的培養(yǎng)及其介導(dǎo)的水稻轉(zhuǎn)化

    根癌農(nóng)桿菌的培養(yǎng)及其介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化過程參照Hiei等的方法。

    1)劃菌:取轉(zhuǎn)化后經(jīng)檢測有所需載體的農(nóng)桿菌保存菌液5-10μL,至YEB(加入濃度為100mg/L的卡那霉素)的固體培養(yǎng)基上涂板,30℃黑暗培養(yǎng),直到長出單菌落。將單菌落二次劃線培養(yǎng)農(nóng)桿菌24-36h,刮菌體于懸菌培養(yǎng)基中,30℃180r/min搖菌3-4h,調(diào)整菌液OD600nm至所需值。

    2)侵染:用懸浮培養(yǎng)基稀釋菌液,直到OD600nm為0.1-0.9,將含農(nóng)桿菌菌液倒入已放好愈傷的培養(yǎng)瓶中,根據(jù)菌液濃度在30℃搖床上侵染5-30min。倒掉菌液,用滅菌的濾紙將菌液吸干,用鑷子把愈傷組織轉(zhuǎn)移到共培養(yǎng)培養(yǎng)基上,20℃黑暗培養(yǎng)48-72h。

    3)洗菌:把共培養(yǎng)基上的愈傷組織轉(zhuǎn)入滅菌三角瓶中,用無菌水清洗5-6次,直到水不再渾濁。然后加入滅菌水(含有500mg/L頭孢霉素)120r/min28℃搖菌15-20min。

    4)晾干愈傷:把水倒掉,把愈傷組織轉(zhuǎn)移到放有滅菌濾紙的培養(yǎng)皿中,在超凈臺吹40-50min。

    5)把晾干的愈傷組織轉(zhuǎn)移到篩選培養(yǎng)基上進行篩選培養(yǎng),分別進行一輪和兩輪篩選培養(yǎng)。每輪25d左右,比較篩選的有效性。

    6)把篩選出的抗性愈傷組織進行預(yù)分化、分化和生根培養(yǎng)。

    1.6 轉(zhuǎn)基因水稻植株的PCR鑒定

    1.6.1 轉(zhuǎn)基因植株總DNA的提取 按CTAB法從水稻新鮮葉片中提取總DNA。

    1.6.2 潮霉索抗性基因的PCR檢測 根據(jù)轉(zhuǎn)化載體中Hygr基因DNA片段的序列設(shè)計引物進行PCR擴增,PCR引物為Primer1(5'-GCCTGACCTATTG-CATCTCC-3')、Primer2(5'-CCTCGCTCCAGTCAAT-GACC-3')。PCR反應(yīng)體系:總體系為20txL,DNA模板50ng,10xbuffer2,0μL,2mmol/L dNTP1.5μL,25mmol/L MgCl22.0μL,10μmol/L引物各0.4μL,Taq酶1U。加滅菌ddH2O至20μL。PCR反應(yīng)程序:94℃變性3min:94℃變性1min,56℃退火1min,72℃延伸1.5min,35個循環(huán):72℃延伸5min。

    1.6.3 目的基因Bph14的檢測 根據(jù)Bph14基因序列設(shè)計引物,檢測水稻的基因組DNA中是否含有該基因。PCR擴增引物:正向5-GGCAGATCATCACCAACTCC-3,反向5-GGCGACTGCGAATGCTAT-3,產(chǎn)物大小為566bp。PCR反應(yīng)體系:總體系為20μL,DNA模板50ng,10×buffer2.0×L。2mmol/LdNTP1,5μL,25mmol/LMgCl22.0×L,10μmol/L引物各0.4μL,Taq酶1U,加滅菌ddH2O至20μL。PCR反應(yīng)程序:94℃。變性5min:94℃,變性1min。58℃退火1min,72℃延伸1min,35個循環(huán):72℃延伸5min。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 粳稻N55s轉(zhuǎn)基因植株的獲得

    根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)粳型稻N55S只進行第一輪篩選后,分化生根,獲得轉(zhuǎn)Bph14基因的總苗數(shù)為40株,陽性株數(shù)21株,陽性植株比率為52.5%:獲得轉(zhuǎn)Bphi008A基因的再生苗16株,其中抗性植株5株,陽性植株比率為31.3%:獲得轉(zhuǎn)Osgl基因的再生苗35株,其中陽性植株12株。陽性植株比率為34.3%。進行兩輪篩選后。分化生根。獲得轉(zhuǎn)Bph14基因總苗數(shù)為45株,其中陽性植株27株,陽性植株比率為60.0%:獲得轉(zhuǎn)Bphi008A基因總苗數(shù)22株,其中陽性株數(shù)為8株,陽性植株比率為36.4%:獲得轉(zhuǎn)Osgl基因總苗數(shù)94株,其中陽性植株36株,陽性植株比率為38v3%(表2)。根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)粳型稻N55S轉(zhuǎn)抗褐飛虱基因的結(jié)果表明,不論是一輪篩選還是兩輪篩選,Bph14基因轉(zhuǎn)化效率最高,Bphi008A基因轉(zhuǎn)化效率最低,Osgl基因轉(zhuǎn)化效率居中,但Bphi008A基因與Osgl基因轉(zhuǎn)化效率相差不大。

    2.2 秈稻M5274轉(zhuǎn)基因植株的獲得

    根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)秈型稻M5274經(jīng)第一輪篩選后,分化生根,獲得轉(zhuǎn)Bph14基因總苗數(shù)46株,陽性株數(shù)35株,陽性植株比率為76.1%:獲得轉(zhuǎn)Bphi008A基因26株轉(zhuǎn)基因苗,其中抗性植株2株,陽性植株比率為7.7%;獲得轉(zhuǎn)Osgl基因19株轉(zhuǎn)基因苗,陽性植株6株,陽性植株比率為31.6%。第二輪篩選后,獲得轉(zhuǎn)Bph14基因再生苗數(shù)為67株,其中陽性植株55株。陽性植株比率為82.1%:獲得轉(zhuǎn)Bphi008A基因再生苗數(shù)8株,其中陽性株數(shù)為2株。陽性植株比率為25.0%:獲得轉(zhuǎn)Osgl基因再生苗97株,其中陽性植株35株,陽性植株比率為36.1%(表3)。與前面結(jié)果類似,根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)秈型稻M5274轉(zhuǎn)抗褐飛虱基因試驗中,增加篩選可以提高獲得陽性再生苗的比例,且Bph14基因轉(zhuǎn)化效率最高。其次是Osgl基因,Bphi008A基因轉(zhuǎn)化效率最低。

    2.3 PCR檢測

    為了獲得轉(zhuǎn)基因的直接證據(jù),提取了轉(zhuǎn)基因植株的葉片總DNA,除了進行了PCR擴增檢測潮霉索抗性基因Hygr外。部分轉(zhuǎn)化Bph14基因的材料還檢測了目的基因。結(jié)果表明,轉(zhuǎn)基因植株中均能擴增到566bp潮霉素抗性基因Hygdr的DNA條帶,呈陽性反應(yīng),而未轉(zhuǎn)基因植株則沒有擴增到DNA條帶(圖1),從而證明目的基因已整合到轉(zhuǎn)基因植株中。

    3 討論

    農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化技術(shù)是水稻基因轉(zhuǎn)化的首選方式。農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化方法的優(yōu)點是轉(zhuǎn)化效率高。轉(zhuǎn)基因重排比例少,插入拷貝數(shù)少。單拷貝數(shù)植株比例高。影響農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化效率的因素有菌株類型、水稻基因類型、培養(yǎng)基成分組成、組織培養(yǎng)條件等。不同水稻品種需要不同的轉(zhuǎn)化條件,愈傷組織經(jīng)過多代培養(yǎng)后易產(chǎn)生體細(xì)胞突變,不利于轉(zhuǎn)化體的篩選:同時,多代培養(yǎng)后愈傷組織衰老死亡,轉(zhuǎn)化效率降低。作者曾將未經(jīng)繼代培養(yǎng)的愈傷組織進行轉(zhuǎn)化,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化效率也很低,這說明細(xì)胞的周期狀態(tài)影響轉(zhuǎn)化效率。已有研究表明,當(dāng)愈傷組織處于細(xì)胞周期S期和G2期的比例最高時,轉(zhuǎn)化效率最高,S期是細(xì)胞DNA復(fù)制期。此時轉(zhuǎn)化有利于轉(zhuǎn)入的T-DNA鏈轉(zhuǎn)變成雙鏈,增加遺傳和整合的穩(wěn)定性。黃紅梅等研究結(jié)果表明,愈傷組織經(jīng)過繼代培養(yǎng)6-7d后轉(zhuǎn)化率高達(dá)95%,本研究通過已優(yōu)化的粳稻培養(yǎng)基體系和秈稻培養(yǎng)基試劑盒分別對粳稻N55S和秈稻M5274進行抗褐飛虱基因根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化,其中粳稻和秈稻轉(zhuǎn)化效率分別為42.5%和45.5%,但3種抗褐飛虱基因?qū)竞投i稻的轉(zhuǎn)化效率不同,其中Bph14最高,Bphi008A最低,Osgl居中。粳稻和秈稻各自不同時期轉(zhuǎn)化效率的差異可能和組織培養(yǎng)條件和抗褐飛虱基因有密切關(guān)系,有待進一步研究。

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