Th17/Treg在兒童腺樣體肥大發(fā)病機制中的作用△

倪坤　趙利敏　吳佳欐　陳偉　李曉艷

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·臨床研究·

Th17/Treg在兒童腺樣體肥大發(fā)病機制中的作用△

倪坤趙利敏吳佳欐陳偉李曉艷

【摘要】目的研究腺樣體不同肥大程度患兒外周血及腺樣體組織中輔助性T細胞17(Th17)和調(diào)節(jié)性T細胞(Treg)比值及相關因子白細胞介素17(IL-17)、IL-10、轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)的含量是否有差異。方法將86例經(jīng)多導睡眠監(jiān)測(PSG)診斷為阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征(OSAHS)的患兒根據(jù)腺樣體大小分為中度肥大組(腺樣體Ⅲ度肥大)、重度肥大組(腺樣體Ⅳ度肥大)和輕度肥大組(腺樣體Ⅰ～Ⅱ度肥大，即對照組)。采用流式細胞儀測定入組病例外周血及腺樣體組織中的Th17、Treg含量，酶聯(lián)免疫吸附試驗測定IL-17、IL-10、TGF-β的含量。結果外周血及腺樣體組織中，Th17/Treg比值在腺樣體肥大組均增加，重度肥大組Th17/Treg比值升高程度比中度肥大組更明顯(P<0.05)。TGF-β含量隨著腺樣體肥大的嚴重程度增加而明顯降低(P<0.05)，IL-17、IL-10含量變化與腺樣體大小無明顯關系(P>0.05)。結論Th17/Treg在腺樣體肥大患兒外周血及腺樣體局部均升高，并且與腺樣體肥大程度相關。(中國眼耳鼻喉科雜志，2016，16：103-106,110)

【關鍵詞】腺樣體肥大；Th17/Treg；轉(zhuǎn)化生長因子β；兒童

△基金項目：上海市衛(wèi)生局青年科研項目(20124Y058)；上海市科學技術委員會科研計劃項目(12411952407)

腺樣體肥大是我國兒童中的常見病、多發(fā)病，該病可導致分泌性中耳炎、鼻竇炎、鼾癥等多種疾病的發(fā)生。腺樣體組織屬于上呼吸道黏膜相關淋巴系統(tǒng)，是咽淋巴環(huán)的重要組成部分，鼻咽部及其毗鄰部位的炎癥或腺樣體自身的炎癥反復刺激使腺樣體發(fā)生病理性增生[1]。腺樣體暴露于氣道，受多種外界刺激后發(fā)生免疫激活，啟動免疫反應，局部效應免疫細胞和調(diào)節(jié)免疫細胞之間平衡的異常導致炎癥反應遷延不愈，久之引起腺樣體增生、肥大。已有國內(nèi)、外學者研究發(fā)現(xiàn)，腺樣體肥大患者腺樣體組織或外周血液中效應T細胞的數(shù)目和功能有變化，研究主要限于輔助性T細胞1 (helper T cell 1, Th1)/Th2平衡紊亂在發(fā)病中的意義。本課題以學齡前兒童為研究對象，通過對外周血及腺樣體組織的檢測分析，初步探討Th17/調(diào)節(jié)性T細胞(regulatory T, Treg)在腺樣體慢性感染導致增生肥大發(fā)病機制中的作用。

1資料與方法

1.1資料2013年9月～2014年12月，就診于我院的患兒86例，其中男性42例、女性44例；平均年齡(5.37±1.21) 歲。經(jīng)詢問病史，排除分泌性中耳炎，心血管、內(nèi)分泌、泌尿系統(tǒng)疾病，代謝性疾病及神經(jīng)肌肉?。焕w維鼻咽鏡檢查診斷為腺樣體肥大。所選病例均無阿司匹林特異性反應、支氣管擴張、自身免疫性疾病等病史，2周內(nèi)無上呼吸道感染，無變應性鼻炎、哮喘等變應性疾病史，皮膚點刺試驗結果為陰性。

對86例患兒進行多導睡眠監(jiān)測(polysomnogram, PSG)檢查，根據(jù)2007年《兒童阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征的治療指南》，阻塞性呼吸暫停指數(shù)(obstructive apnea index，OAI)>1次/h或阻塞性呼吸暫停低通氣指數(shù)(obstructive apnea hypopnea index，AHI)>5次/h，最低血氧飽和度<92%時可診斷為阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征(obstructive sleep apnea hypopnea syndrome, OSAHS)。纖維鼻咽鏡檢查：根據(jù)腺樣體堵塞后鼻孔的程度進行分組，堵塞后鼻孔0～25%為Ⅰ度，26%～50%為Ⅱ度，51%～75%為Ⅲ度，76%～100%為Ⅳ度[2]。對86例兒童進行分組，Ⅲ度為中度肥大組，Ⅳ度為重度肥大組，Ⅰ～Ⅱ度為正常組。

1.2實驗方法

1.2.1外周血Th17和Treg的測定

1)外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)的制備。肝素抗凝管采集靜脈血3 mL，分2管裝。采集后在4 h內(nèi)加入等體積的Hank平衡鹽緩沖液(Hank balanced salt solution, HBSS; pH=7.2～7.4)稀釋血液；取與稀釋后血液等體積的淋巴細胞分層液(Ficoll液)，加入離心管中，將稀釋血液小心地加到淋巴細胞分層液上，注意保持兩者界面清晰，室溫下離心20 min，2 000 r/min。用毛細吸管輕輕吸出單個核細胞層，加入含有5 mL HBSS的試管中，充分混勻；1 500 r/min,離心10 min，棄上清液后，再洗1次。棄上清夜，用RPMI-1640重懸單個核細胞，用臺酚藍染色計數(shù)活細胞數(shù)(應在95%以上)。調(diào)節(jié)細胞濃度為2×106細胞/mL。

2)細胞培養(yǎng)。取PBMC懸液(2×106/mL)加入T25培養(yǎng)瓶內(nèi)，每瓶3 mL，加入佛波脂酸(PMA)(50 ng/mL，Sigma公司，美國)，伊屋諾霉素(ionomycin caicium salt)(1 μg/mL，Sigma公司，美國)和布雷菲德菌素A(BFA，10 μg/mL)置培養(yǎng)箱中共刺激培養(yǎng)5 h，37 ℃，5%CO2。

3)上機進行人 Th17/Treg 的流式分選。實驗操作按照BD公司(560762)說明書。

1.2.2腺樣體組織Th17和Treg的測定手術摘除的腺樣體先于75%乙醇溶液中沖洗10 s，或再用磷酸鹽緩沖液 +10%雙抗清洗組織。于RPMI-1640不完全培養(yǎng)液中沖洗10 s。無菌條件下剪除周圍組織，將腺樣體實質(zhì)剪碎，用注射器針芯在40 mmol/L篩網(wǎng)中研磨，用10%胎牛血清+RPMI-1640制成單細胞懸液。通過密度梯度離心方法(Bicoll, Biochrom, 德國)純化其中的單核細胞。倒置熒光顯微鏡下拍照、觀察。單細胞懸液的培養(yǎng)及流式測定同外周血操作。

1.2.3酶聯(lián)免疫吸附試驗法測定白細胞介素-17、白細胞介素-10、轉(zhuǎn)化生長因子-β抽取空腹靜脈血3 mL，置于干管中，經(jīng)2 000 r/min，離心15 min 后取上層清液，-20 ℃保存?zhèn)溆?。制備腺樣體單細胞懸液保存?zhèn)溆?。酶?lián)免疫吸附試驗法( enzyme linked immunosorbent assay, ELISA) 測定白細胞介素17(interleukin 17, IL-17)、IL-10 轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factorβ, TGF-β) 含量，ELISA 試劑盒購自EBIOSCIENCE公司，所有操作嚴格按照試劑盒說明進行。

1.3統(tǒng)計學處理各組數(shù)據(jù)經(jīng)檢驗符合正態(tài)分布，兩兩比較Th17/Treg、IL-17、IL-10、TGF-β的水平。2組間比較采用獨立樣本t檢驗；3組間比較采用方差分析。所有統(tǒng)計學數(shù)據(jù)均由SPSS 17.0軟件完成，組間差異用P<0.05判斷。

2結果

2.1病例基本資料入組病例均為3～6歲學齡前兒童，各組間年齡差異無統(tǒng)計學意義。經(jīng)PSG檢查，對照組AHI及血氧飽和度在正常范圍內(nèi)，OSAHS組AHI均高于對照組(P<0.05)，且夜間最低血氧飽和度與對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義。然而，OSAHS組內(nèi)，中度肥大組與重度肥大組，AHI差異不明顯，缺氧程度的差異也不明顯(表1)。

表1　86例患兒的基本資料

注：a示與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；b示與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)

2.2外周血樣本Th17/Treg比值正常組Th17/Treg比值為0.69±0.68，中度肥大組為6.06±3.32，重度肥大組為12.24±4.58，3組間比較，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.008，P<0.05)；3組間兩兩比較，P值均<0.05，即外周血3組間的Th17/Terg差異顯著(圖1)。

2.3腺樣體組織Th17/Treg比值Th17/Treg比值在對照組、腺樣體中度肥大組及重度肥大組分別為0.80±0.72、6.88±5.87和14.29±1.29。3組間經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.033，P<0.05)。兩兩比較，P值均<0.05，即外周血3組間Th17/Terg比值是有差異的(圖2)。

2.4外周血和腺樣體組織內(nèi)細胞因子測定結果檢測結果詳見表2。TGF-β含量隨著腺樣體肥大的嚴重程度而明顯降低(P<0.05)，IL-17、IL-10含量與腺樣體大小無明顯關系。

圖1.　3組外周血樣本Th17/Treg比值　　　　　　　　　　　　　　　　　圖2.　3組腺樣體組織Th17/Treg比值

注：a示中度肥大組與對照組相比(P=0.018 5，P<0.05)；b示重度肥大組與對照組相比(P=0.000 64，P<0.01)；c示重度肥大組與對照組及中度肥大組相比(P=0.0370，P<0.05)

3討論

腺樣體肥大的發(fā)病機制目前尚不清楚。有許多國、內(nèi)外學者[3-6]研究發(fā)現(xiàn)，腺樣體肥大患者腺樣體組織或外周血中效應T細胞的數(shù)目和功能有變化，對腺樣體肥大主要并發(fā)癥——滲出性中耳炎的研究也提示腺樣體局部Th1、Th2細胞亞群的變化對中耳炎發(fā)病有重要意義[7-10]。Th17細胞是一類獨立于Th1、Th2的T細胞亞群，主要分泌IL-17A。Treg是不同于Th1和Th2細胞的一種免疫調(diào)節(jié)細胞,能使機體通過調(diào)節(jié)外周免疫耐受。Th17主要參與促炎反應，對抗細胞外致病因子的侵害。Treg則在自身免疫耐受及對抗排斥反應和過敏性疾病中發(fā)揮重要作用。Treg的抑制功能通過抑制性細胞因子IL-10和TGF-β介導。有研究[11]表明，在類風濕關節(jié)炎、細菌性肺炎、哮喘和實驗性自身免疫性腦炎等炎癥狀態(tài)下，IL-17水平均顯著升高，機體內(nèi)除了Th1/ Th2 平衡外，還存在Treg /Th17 平衡[12]。Noack等[13]再次重申，Th17具有促炎作用，而Treg具有拮抗作用，二者的發(fā)展相互關聯(lián)，它們之間存在一個可塑性的平衡關系。Th17/Treg平衡紊亂與許多自身免疫性疾病或炎癥性疾病的發(fā)生有關，Th17的功能及其與Treg、Th1、Th2的相互關系越來越引起研究者的關注[14-15]。

在我們的研究結果中，Th17細胞數(shù)目在腺樣體肥大組均明顯增加，Th17/Treg比值與腺樣體大小相關。全身免疫狀態(tài)，即外周血Th17/Treg比值升高與腺樣體肥大嚴重程度相關，腺樣體局部Th17/Treg紊亂亦與腺樣體肥大程度相關。早期研究[16]已知，睡眠紊亂可引起Treg數(shù)量和功能的降低。在一項成人阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征(obstructive sleep apnoea syndrome, OSAS)研究[17]中發(fā)現(xiàn)，OSAS患者外周血中Th17/Treg比值上調(diào)，并與OSAS嚴重程度呈正相關。該研究證實，睡眠紊亂可能是引起全身Th17/Treg平衡紊亂的一個觸發(fā)因素，Th17/Treg比值升高最終引起持續(xù)性全身炎癥狀態(tài)。此研究結果揭示了成人OSAS的全身免疫狀態(tài)。我們的結果也證實，腺樣體肥大導致的OSAHS，患兒外周血Th 17/Treg比值升高，與以往研究結果一致。

小兒鼻咽部淋巴組織的研究[18-19]表明，肺炎鏈球菌感染組Treg數(shù)目增加，Treg的升高可能導致腺樣體局部致病菌持續(xù)存在。Sade等[20]研究發(fā)現(xiàn)，腺樣體肥大患兒腺樣體組織局部Th17/ Treg比值與患兒的臨床評分呈顯著負相關，Th17/ Treg細胞亞群比例下降可能在腺樣體肥大的發(fā)病中起作用。這與我們的結果不同,分析可能是存在病程的影響和(或)全身Th17/ Treg比例對局部Th17/ Treg的影響。急性感染時，局部組織炎性反應，其中IL-17可以促進CD4+T細胞分化為Th17，同時在TGF-β減少的環(huán)境中，抑制Treg的發(fā)育，導致Th17/Treg比例升高。若致病因素導致腺樣體局部Th17下降或是Treg升高，局部慢性炎癥持續(xù)存在，將導致腺樣體增生肥大，此時腺樣體局部Th17/Treg比值下降；而睡眠紊亂將隨著腺樣體增生明顯而逐漸加重，勢必引起全身Treg逐漸下降，即全身Th17/Treg比值持續(xù)升高。全身Th17/Treg比值的長期失衡可能會影響腺樣體局部Th17/Treg比值，導致局部Th17/Treg比值升高，抗炎作用增強恢復。已經(jīng)增生肥大的腺樣體將繼續(xù)阻塞上氣道，睡眠紊亂沒有解決，故全身Th17/Treg比值仍升高。因此，病程末局部及全身的Th17/Treg比值均升高。我們認為，Th17/Treg比值是一個揭示免疫狀態(tài)的重要指標，與兒童腺樣體肥大及OSAHS的嚴重程度密切相關。

TGF-β含量隨著腺樣體肥大的嚴重程度而明顯降低，這提示重度肥大的腺樣體組織中，TGF-β減少明顯，符合長期全身炎癥狀態(tài)下，局部淋巴組織 Treg功能受抑制，Th17增多的免疫反應過程，從而間接支持重度肥大的腺樣體組織中Th17/Treg升高更明顯的結論。但我們也觀察到，IL-17及Treg的重要功能因子IL-10的含量并不像其他文獻報道的在各組間差異有統(tǒng)計學意義，分析可能是在免疫反應中，各因子之間的相互作用呈網(wǎng)狀結構，并不是單純的單向作用；并且在不同的病程階段也發(fā)生不同的免疫反應，呈現(xiàn)不同的功能狀態(tài)，故不能依靠單純的細胞因子含量來解釋病情。

本研究仍存在一定不足。研究病程未細化。本次納入研究的對象病程長短不一，最短為6個月，最長為5年，平均2.3年。不同的病程可能對Th17/Treg比值影響不同。要考慮局部炎性刺激引起的淋巴細胞增生后自身免疫調(diào)節(jié)機制的作用，也應考慮和研究全身比值變化對局部的影響，這些可能與病程長短有重要關系。因為研究未將病程作為研究因素，故缺乏相關解釋的科學依據(jù)。另外還應考慮治療藥物的影響，比如部分患兒有使用鼻用糖皮質(zhì)激素史。此類藥物是否改變局部Th17/Treg比值，還未可知。

綜上所述，本研究提供了直接證據(jù)提示Th17/ Treg在腺樣體肥大患兒外周血及腺樣體局部均升高，并且與腺樣體肥大程度相關，這為研究腺樣體肥大發(fā)病機制提供了數(shù)據(jù)。在本研究結論基礎上，可以進一步細化病程，研究Th17/ Treg比值在腺樣體發(fā)病過程中的變化及其影響因素，從而明確Th17/ Treg比值對臨床上兒童腺樣體肥大的病情評估和治療預后的評價作用。

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(本文編輯楊美琴)

Role of Th17/Treg balance in the pathogenesis of adenoidal hypertrophy in children

NIKun,ZHAOLi-min,WUJia-li,CHENWei,LIXiao-yan.

DepartmentofOtolaryngologyHeadandNeckSurgery,ShanghaiChildren’sHospitalofShanghaiJiaotongUniversity,Shanghai200060,China

【Abstract】ObjectiveTo evaluate the ratio of help T cell 17(Th17) and regulatory T(Treg), as well as the expression of related interleukin 17(IL-17), IL-10, transforming growth factor β (TGF-β), in both peripheral blood and adenoid tissue in children with different degrees of hypertrophy. MethodsEighty-six children were included and were divided into three groups.All the children were grouped according to the polysomnogram( PSG) examination. The children who were diagnosed as obstructive sleep apnea hypopnea syndrome (OSAHS) combined with adenoid hypertrophy of Ⅲ degree were the moderate hypertrophy group, adenoid hypertrophy of IV degree were the severe group, and those who were not OSAHS but with adenoid hypertrophy of Ⅰ～Ⅱ degree were the control group.The peripheral blood and adenoid tissues of all children were collected.The determination of Th17 and Treg content was done by using flow cytometry, and the determination of content of IL-17, IL-10, TGF- β was done by using enzyme linked immunosorbent asscy (ELISA) method. ResultsThe ratioes of Th17/Treg in in peripheral blood and ad enoid tissue were all significantly increased in adenoid hypertrophy groups, especially in severe adenoid hypertrophy group(P<0.05). TGF-β content was decreased significantly with the severity of adenoid hypertrophy (P<0.05), but there was no significant relationship between IL-17, IL-10 content and adenoid size. ConclusionsThe rising of Th17/Treg ratio was observed in both the peripheral blood and adenoid tissues in children with adenoidal hypertrophy, and the increasing degree has a correlation with adenoid size. (Chin J Ophthalmol and Otorhinolaryngol,2016,16:103-106,110)

【Key words】Adenoid hypertrophy；Th17/Treg；Transforming growth factor β;Child

(收稿日期2015-05-11)

DOI:10.14166/j.issn.1671-2420.2016.02.010

通訊作者：李曉艷(Email: chhshent@163.com)

Corresponding author：LI Xiao-yan, Email: chhshent@163.com

作者單位:上海市兒童醫(yī)院上海交通大學附屬兒童醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科上海200060