黃花蒿促分裂原活化蛋白激酶基因及其在重金屬鎘脅迫下表達分析

周良云 呂朝耕 康傳志 王升 唐金富 康利平 郭蘭萍

[摘要]為了考察黃花蒿在重金屬鎘脅迫下，是否存在相應的促分裂原活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase，MAPK）基因參與鎘信號的傳導。該文通過對SRA數據庫中的黃花蒿轉錄組進行拼接組裝、BLAST以及對所得序列進行保守結構域分析，最終獲得17條黃花蒿MAPK基因，命名為AaMAPK1～AaMAPK17。在這17個MAPK基因中，有16個含有T[D/E]Y保守結構域。實驗利用Realtime PCR方法，分析了黃花蒿在重金屬鎘脅迫下17個MAPK基因的表達情況。結果顯示AaMAPK3，AaMAPK10的表達下調，MAPK7，MAPK9，MAPK12的表達上調。這表明了黃花蒿中可能存在相應的MAPK基因參與了鎘信號傳導。

[關鍵詞]黃花蒿；MAPK基因；鎘脅迫；表達分析

促分裂原活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase，MAPK）是絲/蘇氨酸蛋白質激酶的一個大家族，廣泛存在于真核生物中。MAPK級聯途徑包括3種蛋白激酶：MAPKKK，MAPKK，MAPK[1]。植物在響應外界的生物和非生物脅迫時，可以通過該級聯途徑將上游信號和下游的應答分子聯系起來[2]。MAPKKK是位于級聯途徑上游的組件，通過信號分子的受體或其本身直接感受胞外刺激而被磷酸化激活。激活后的MAPKKK通過磷酸化MAPKK保守基序S/TX35S/T中的絲氨酸或絲氨酸/蘇氨酸殘基以激活MAPKK。MAPK是位于級聯途徑下游的組件，它含有一個非常保守的TXY（目前只發(fā)現TDY，TEY 2種）基序。MAPK的激活需要上游的MAPKK對它雙重磷酸化，磷酸化位點是TXY基序中的酪氨酸和蘇氨酸殘基[2]。被激活的MAPK進入到細胞核內，再通過激活特定轉錄因子來調節(jié)功能基因的表達，或停留在細胞質中激活其它蛋白激酶，最終引起植物細胞響應內外刺激產生一系列生理生化反應[3]。隨著人們對植物體MAPKs作用研究的深入，越來越多的數據顯示MAPKs在植物信號傳導過程中起著重要的作用。許多植物體內的MAPKs可以被生物因子（如微生物病原體感染）和非生物因子（如重金屬、干旱、高鹽、寒冷、過高或過低的滲透壓）所激活[12]。

黃花蒿Artemisia annua L為菊科一年生植物，其地上部分即為我國傳統中藥青蒿，具有清虛熱、涼血、截瘧等功效[4]?，F代藥理研究表明，黃花蒿的抗瘧活性成分為青蒿素。雖然青蒿素已可以人工合成，但由于成本高、毒性大而未能投產。目前，通過人工栽培從原植物黃花蒿中提取分離依然是青蒿素的主要商業(yè)來源。本實驗室前期研究顯示[56]，在不同濃度重金屬鎘脅迫黃花蒿的土壤栽培以及水溶液培養(yǎng)實驗中均能觀察到一定濃度的重金屬鎘顯著提高了青蒿素的合成與積累。然而，關于黃花蒿通過什么途徑將外界鎘信號傳遞到胞內進而引起其次生代謝產物的合成發(fā)生變化依然未有相關報道。Liu等 [7]發(fā)現，擬南芥在鎘脅迫下，MAPK3和MAPK6的基因被激活。然后當預先使用活性氧清除劑時，可有效地抑制MAPK3和MAPK6的活性。該結果表明，擬南芥在重金屬鎘脅迫下信號傳導通路是鎘ROSMAPK3/MAPK6。另外，在鎘脅迫紫花苜蓿的研究中同樣發(fā)現了MAPK級聯途徑參與鎘信號的傳導，其傳導通路為鎘SIMK/SAMK/MMK2/MMK3[8]。為了考察黃花蒿在重金屬鎘脅迫下，是否存在相應的MAPK基因參與鎘信號的傳導。本研究通過在水培液中添加不同濃度鎘的方法脅迫處理黃花蒿，并于處理后不同時間收集葉片組織，對其MAPK基因進行差異表達分析，鑒定可能參與鎘信號傳導的MAPK基因。

1材料

實驗所用黃花蒿A annua種子來源于西南瀕危藥材資源開發(fā)國家工程實驗室桂蒿3號種子。播種前，將蛭石滅菌，分裝于花盆中，每個花盆裝蛭石至三分之二高度處，黃花蒿生長期間，每3 d澆1次營養(yǎng)液，每天澆1次蒸餾水，保持蛭石一定的含水量，待生長至5 cm左右高度，隨機選取黃花蒿幼苗置于含1 L pH 58 Hoagland營養(yǎng)液的水培罐中培養(yǎng)，每罐3株，用洗凈滅菌的海綿包住苗莖固定，2 d更換1次營養(yǎng)液。培養(yǎng)條件：溫度 25 ℃；鈉燈為光源，每天光照12 h。

水溶液培養(yǎng)黃花蒿40 d后，以Cd（NO3）2·4H2O的形式添加到營養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)，實驗設定2個處理組：分別為20，80 μmol·L-1。以0 μmol·L-1為對照組，以1罐為1個重復，每個處理設6個重復。取樣時間設定為0，4，8，12，24，48，60，72 h。樣品用液氮速凍后，置于-80 ℃保存。

2方法

21數據下載NCBI的SRA（The Sequence Read Archive）數據庫中存儲了大量由二代測序平臺包括Roche 454 GS System，Illumina Genome Analyzer，Applied Biosystems SOLiD System等測得的原始序列。SRA數據庫收錄了黃花蒿的成熟葉片腺毛、幼葉腺毛、子葉、分生組織以及花蕾腺毛5個組織的轉錄組序列，這5個轉錄組序列均由Roche 454 GS FLX平臺測得。

22數據組裝用SRA Toolkit （http：//eutilsncbinihgov/Traces/sra/？view=software）將從NCBI下載的SRA文件轉成SFF格式文件，然后用454 Data Analysis Software package （http：//www454com/products/analysissoftware/）中的sffinfo （s參數）提取SFF文件中的序列信息得到FASTA格式的序列文件。用轉錄組拼接軟件Trinity （http：//trinityrnaseqsourceforgenet）把5個庫的FASTA序列文件進行拼接，使用參數seqType fa single CPU 8，從而把測序數據拼接成轉錄本序列。在拼接結果中，選最長的轉錄本序列作為該基因的代表轉錄本（Unigene）。

23AaMAPK家族基因的獲取以擬南芥的MAPKs為query序列，1×10-6作為E Value的臨界值，進行本地BLAST，所得序列進行保守域和Pfam分析，以獲取黃花蒿的MAPKs基因。

24引物設計從Unigene中調出AaMAPKs基因序列，根據Realtime PCR引物設計需滿足的條件通過Primer Premier 50軟件設計特異性引物，并交由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。

25總RNA的提取與實時熒光定量分析從-80 ℃冰箱取出試驗材料，在EP管中加入磁珠，用球磨粉碎機粉碎?？俁NA的提取參照QIAGEN公司的RNeasy Plant Mini Kit （cat nos 74903 and 74904）和RNaseFree DNase Set（cat no79254）說明操作。使用Takara公司的反轉錄試劑盒（PrimerScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit）進行反轉錄，生成單鏈cDNA。冰上配置反應體系為10 μL，包含5 μL Power SYBR Green PCR Master Mix （Applied Biosystems，USA），1 μL cDNA，1 μL primers （上下游引物已混合，各引物的量約為25 mmol·L-1），ddH2O 3 μL，在ABI 7500定量分析儀上進行反應。PCR擴增條件為：酶活化（50 ℃，2 min）；預變性（95 ℃，10 min）；變性（95 ℃ 15 s），退火和延伸（60 ℃ 1 min）40個循環(huán)。最后添加溶解曲線設置。相對定量分析結果采用2-ΔΔCT法計算[9]。

26數據處理實驗結果使用Excel 2007進行數據分析并繪圖。

3結果

31數據組裝對SRA庫中的數據組裝，組裝結果共獲得25 168條Contigs，其中長度大于1 000 bp的Contig共有3 292條，長度大于500 bp的Contig共有12 743條。組裝后的Contig平均長度為627 bp，最長Contig為5 709 bp，其中N50為691 bp，N90為357 bp。

32AaMAPKs基因及其引物特異性檢測通過Blast和結構域的分析，在黃花蒿Unigene數據中得到17條序列，其中有10個TEY類型的MAPKs基因，6個TDY類型的MAPKs基因，1個未知類型。根據搜索到的MAPKs基因序列設計并合成相關基因的特異性引物，結果見表1。各MAPKs基因命名先分TEY和TDY 2大類，再按得到的序列長短依次命名。實驗結果顯示所有引物的PCR產物熔解曲線均是單峰，表明引物特異性好。各引物的熔鏈溫度（Tm）分別為：MAPK1 7908；MAPK2 7575；MAPK3 7723；MAPK4 763；MAPK5 7463；MAPK6 7445；MAPK7 7556；MAPK8 7815；MAPK9 7297；MAPK10 7519；MAPK11 7815；MAPK12 789；MAPK13 7878；MAPK14 7518；MAPK16 776；MAPK17 7815。

33AaMAPKs基因表達差異分析在黃花蒿Unigene中共搜索到17個MAPK基因，其中MAPK15在黃花蒿葉片中表達量較低，因此在本試驗中沒有檢測其相對表達量。16個AaMAPKs基因相對表達量見圖1。由圖可見隨著處理時間的延長，AaMAPK3，AaMAPK10 2個基因在對照組中的表達量始終高于20，80 μmol·L-1處理組，說明了黃花蒿在鎘的誘導下AaMAPK3，AaMAPK10基因的表達水平受到了抑制。AaMAPK3，AaMAPK10均屬于TEY類型基因。AaMAPK7，AaMAPK9，AaMAPK12在20，80 μmol·L-1處理組中的表達量均高于對照組且處理濃度越高表達量越高，說明鎘對黃花蒿中AaMAPK7，AaMAPK9，AaMAPK12的表達表現出促進作用。其中AaMAPK7，AaMAPK9屬于TEY類型，AaMAPK12屬于TDY類型。隨著處理時間的變化，AaMAPK6基因在對照組和各處理組中表達趨勢基本一致，且相對于0 h表達量均較高?？紤]到在取樣過程中要剪取葉片，對植株造成了損傷，因此推測AaMAPK6基因的表達可能與機械損傷有關，說明機械損傷在一定程度上能夠促進AaMAPK6的表達。通過結構域的分析AaMAPK6基因屬于TEY類型。

4討論

將黃花蒿SRA數據庫中5個EST庫進行組裝得到了質量較高的黃花蒿Unigene，為搜索黃花蒿的AaMAPKs基因提供可靠的檢索數據庫。目前，已有許多植物MAPK基因被分離出來，其中擬南芥有20個[10]，水稻有17個[11]，玉米有19個[12]，煙草17個[13]，番茄16個[14]。本研究通過Blast和結構域的分析，在黃花蒿Unigene數據庫中共檢索到了17條序列。其中有10個TEY類型的MAPKs基因，6個TDY類型的MAPKs基因，1個未知類型。而在模式植物擬南芥中的20個MAPKs基因中，12個屬于TEY類型，8個屬于TDY類型[15]。這說明不同物種之間MAPK基因的數目和結構域分類不同，這些基因可能參與植物不同的生理活動。

實驗通過對鎘誘導下黃花蒿中MAPK基因的表達進行差異性分析，發(fā)現有2個MAPK基因（AaMAPK3和AaMAPK10）的表達量下調，3個MAPK基因（MAPK7，MAPK9，MAPK12）的表達量上調，這說明了黃花蒿中存在相應的MAPK基因參與了鎘信號的傳導作用。有趣的是，本研究中發(fā)現AaMAPK3，AaMAPK10 2個基因在重金屬鎘作用下表達量下降。然而到目前為止有關植物在重金屬鎘及其他外源物作用下，MAPK基因表達下調鮮有報道[16]。同時，表達下調的MAPK基因在植物信號傳導過程中承擔著何種作用仍然未知。另外，通過對實驗數據的分析推測黃花蒿中存在一個MAPK基因對機械損傷有響應作用，并且在損傷下該基因的表達量升高。

[參考文獻]

[1]Nakagami H， Pitzschke A， Hirt H. Emerging MAP kinase pathways in plant stress signalling[J]. Trends Plant Sci， 2005， 10（7）： 339.

[2]Opdenakker K， Remans T， Vangronsveld J， et al. Mitogenactivated protein （MAP） kinases in plant metal stress： regulation and responses in comparison to other biotic and abiotic stresses[J]. Int J Mol Sci， 2012， 13（6）： 7828.

[3]Jonak C， krész L， Bgre L， et al. Complexity， cross talk and integration of plant MAP kinase signalling[J]. Curr Opin Plant Biol， 2002， 5（5）： 415.

[4]中國藥典. 一部[S]. 2010： 184.

[5]韓小麗， 黃璐琦， 郭蘭萍， 等. 土壤青蒿系統中鎘 （Cd） 遷移規(guī)律及 Cd 對青蒿生長和青蒿素含量的影響[J]. 中國中藥雜志， 2010，35（13）： 1655.

[6]Li X， Zhao M， Guo L， et al. Effect of cadmium on photosynthetic pigments， lipid peroxidation， antioxidants， and artemisinin in hydroponically grown Artemisia annua[J]. J Environ SciChina， 2012， 24（8）： 1511.

[7]Liu X M， Kim K E， Kim K C， et al. Cadmium activates Arabidopsis MPK3 and MPK6 via accumulation of reactive oxygen species[J]. Phytochemistry， 2010， 71（5）： 614.

[8]Jonak C， Nakagami H， Hirt H. Heavy metal stress. Activation of distinct mitogenactivated protein kinase pathways by copper and cadmium[J]. Plant Physiol， 2004， 136（2）： 3276.

[9]Schmittgen T D， Livak K J. Analyzing realtime PCR data by the comparative CT method[J]. Nat Protoc， 2008， 3（6）： 1101.

[10]Mizoguchi T， Hayashida N， YamaguchiShinozaki K， et al. ATMPKs： a gene family of plant MAP kinases in Arabidopsis thaliana[J]. FEBS Lett， 1993， 336（3）： 440.

[11]Lieberherr D， Thao N P， Nakashima A， et al. A sphingolipid elicitorinducible mitogenactivated protein kinase is regulated by the small GTPase OsRac1 and heterotrimeric Gprotein in rice[J]. Plant Physiol， 2005， 138（3）： 1644.

[12]Lalle M， Visconti S， Marra M， et al. ZmMPK6， a novel maize MAP kinase that interacts with 1433 proteins[J]. Plant Mol Biol， 2005， 59（5）： 713.

[13]Wilson C， Anglmayer R， Vicente O， et al. Molecular cloning， functional expression in Escherichia coli， and characterization of multiple mitogenactivatedprotein kinases from tobacco[J]. Eur J Biochem， 1995， 233（1）： 249.

[14]Kong F， Wang J， Cheng L， et al. Genomewide analysis of the mitogenactivated protein kinase gene family in Solanum lycopersicum[J]. Gene， 2012， 499（1）： 108.

[15]Ichimura K， Shinozaki K， Tena G， et al. Mitogenactivated protein kinase cascades in plants： a new nomenclature[J]. Trends Plant Sci， 2002， 7（7）： 301.

[16]于瑩， 陳宏宇， 程莉莉， 等. 亞麻MAPK 基因克隆及鹽堿脅迫下的表達分析[J]. 東北農業(yè)大學學報， 2015（3）： 4.

[責任編輯呂冬梅]