益生菌治療難治性原發(fā)免疫性血小板減少癥的療效及對(duì)腸道菌群變化的影響

黃曉春， 秦麗娟， 莫秋玉

原發(fā)免疫性血小板減少癥(primary immune thrombocytopenia，ITP)是一種自身免疫性出血性疾病，雖然有新藥提高了療效，但因各種原因，仍有少數(shù)是難治病例，持續(xù)血小板減少，面臨大出血風(fēng)險(xiǎn)。近年來，腸道菌群對(duì)免疫功能的影響得到重視，且通過宏基因組關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)10余種疾病如腫瘤、代謝性疾病、自身免疫疾病、心血管疾病、神經(jīng)疾病等[1]的腸道菌群會(huì)發(fā)生改變。有關(guān)難治性ITP腸道菌群變化，以及治療時(shí)加益生菌的報(bào)道少。本研究用16SrDNA高通量測(cè)序技術(shù)，分析益生菌治療難治性ITP患者治療前后的腸道菌群的變化及血小板改善情況，為難治性ITP的治療提供參考。

1 資料與方法

1.1一般資料 將2018年1月至2020年12月在我院就診的符合成人難治性ITP診斷標(biāo)準(zhǔn)[2]的20例患者隨機(jī)分為益生菌組10例和對(duì)照組10例。兩組一般資料情況比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。見表1。本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者簽署知情同意書。

表1 兩組一般資料情況比較[n，M(P25，P75)]

1.2治療方法 益生菌組給予達(dá)那唑(江蘇聯(lián)環(huán)藥業(yè)股份有限公司，國藥準(zhǔn)字H20023116)200 mg/d，2次/d；環(huán)孢素(杭州中美華東制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字H10960122)1.5 mg/(kg·d)，2次/d；雙歧桿菌乳桿菌三聯(lián)活菌片(保加利亞乳桿菌、長型雙歧桿菌、嗜熱鏈球菌，規(guī)格0.5 g/片，內(nèi)蒙古雙奇藥業(yè)股份有限公司，國藥準(zhǔn)字S19980004)2片，2次/d。對(duì)照組給予達(dá)那唑200 mg/d，2次/d；環(huán)孢素1.5 mg/(kg·d)，2次/d+維生素C片(規(guī)格：100 mg/片，四川依科制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字H51020251)2片，2次/d。兩組療程均為8周。

1.3實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法 所有研究對(duì)象入組前空腹抽取外周靜脈血2 ml，分離血清，置-20 ℃冰箱保存待檢，用以檢測(cè)干擾素-γ(interferon-γ,IFN-γ)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)及白細(xì)胞介素-12(interleukin-12,IL-12)濃度。益生菌組和對(duì)照組治療8周后，再次抽血復(fù)查上述指標(biāo)。細(xì)胞因子采用定量酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)法。糞便采集，使用糞便采集器(備案號(hào)：粵深械備20170088號(hào))。送廣州金域公司16SrDNA測(cè)序分析雙歧桿菌屬、乳酸桿菌屬、大腸桿菌和糞球菌屬豐度，微生態(tài)分析。經(jīng)16S靶向擴(kuò)增、高通量測(cè)序、物種注釋及豐度分析，將菌群豐度與廣州金域醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心現(xiàn)有的健康腸道菌群數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)。文庫構(gòu)建與高通量測(cè)序方法：文庫構(gòu)建使用賽默飛公司的Ion Plus Fragment Library Kit 48 rxns(NO.28950)試劑盒進(jìn)行，將構(gòu)建好的文庫使用賽默飛公司的Ion 16STM Metagenomics Kit(NO.A26216)試劑盒進(jìn)行測(cè)序，經(jīng)過Qubit定量和文庫檢測(cè)合格后，用二代測(cè)序儀ABIPGM上機(jī)測(cè)序。

1.4觀察指標(biāo)及療效評(píng)定標(biāo)準(zhǔn) 觀察血小板計(jì)數(shù)、腸道微生態(tài)、腸道菌群及細(xì)胞因子變化。所有患者于治療8周后進(jìn)行療效評(píng)定：(1)完全反應(yīng)：無出血，血小板計(jì)數(shù)≥100×109/L；(2)有效：治療后血小板計(jì)數(shù)≥30×109/L并且至少比基礎(chǔ)血小板計(jì)數(shù)增加2倍且沒有出血；(3)無效：治療后血小板計(jì)數(shù)<30×109/L或者血小板計(jì)數(shù)增加不到基礎(chǔ)值的2倍或者有出血[2]。

2 結(jié)果

2.1兩組療效及治療前后血小板計(jì)數(shù)比較 治療后，益生菌組完全反應(yīng)0例，有效5例(50%)，無效5例(50%)，對(duì)照組均為無效，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-2.517，P=0.012)。治療前，兩組血小板計(jì)數(shù)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。治療后，益生菌組血小板計(jì)數(shù)顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。見表2。

表2 兩組治療前后血小板計(jì)數(shù)比較

2.2兩組治療前后腸道微生態(tài)比較 治療前，兩組腸道多樣性、厚壁菌門/擬桿菌門比值及腸型比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。治療8周后，益生菌組厚壁菌門/擬桿菌門比值顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。見表3。

表3 兩組治療前后腸道微生態(tài)比較

2.3兩組治療前后腸道菌群豐度比較 治療前益生菌組和對(duì)照組腸道菌群豐度比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。治療后，益生菌組乳酸桿菌屬豐度及雙歧桿菌屬豐度均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，大腸桿菌豐度顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，兩組糞球菌屬豐度比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表4。

表4 兩組治療前后腸道菌群豐度比較[M(P25，P75)]

2.4兩組治療前后細(xì)胞因子變化比較 治療前，兩組TNF-α、IL-12及IFN-γ比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。治療后，益生菌組TNF-α、IL-12及IFN-γ均顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。見表5。

表5 兩組治療前后細(xì)胞因子變化比較

2.5不良反應(yīng) 所有患者未見明顯不良反應(yīng)。

3 討論

3.1ITP的發(fā)病機(jī)制目前尚未完全清楚，但確定是免疫失耐受導(dǎo)致的疾病，其中抗體介導(dǎo)和T細(xì)胞介導(dǎo)的血小板破壞是關(guān)鍵。T細(xì)胞的損傷、細(xì)胞因子失衡都是重要特點(diǎn)[3]。腸道菌群是居住在人體內(nèi)的最主要和最多樣的微生物群落，腸道菌群及其代謝產(chǎn)物能活化免疫細(xì)胞，參與機(jī)體獲得性免疫應(yīng)答[4]。目前，對(duì)ITP的腸道菌群研究較少。宏基因組學(xué)研究極大擴(kuò)展了微生物的研究范圍，可解釋微生物群落多樣性、種群結(jié)構(gòu)及環(huán)境之間的關(guān)系，目前腸道宏基因組學(xué)常用16SrDNA研究。本研究用此方法檢測(cè)難治性ITP患者的腸道生態(tài)，觀察部分腸道微生物群的變化。大多數(shù)的研究結(jié)果表明疾病狀態(tài)時(shí)腸道菌群的改變以乳酸桿菌、雙歧桿菌等有益菌的相對(duì)減少和腐敗梭菌等潛在致病菌的相對(duì)增多為主[5]。本研究顯示，難治性ITP患者腸道乳酸桿菌屬、雙歧桿菌屬豐度明顯減少，大腸桿菌豐度升高，與其他疾病狀態(tài)時(shí)有類似改變，提示機(jī)體免疫狀態(tài)與腸道菌群有關(guān)聯(lián)。已有研究發(fā)現(xiàn)腸道菌群可以促進(jìn)分泌型免疫球蛋白A生成，協(xié)助維持調(diào)節(jié)T細(xì)胞平衡，參與腸道適應(yīng)性免疫[6]。還有報(bào)道腸道微生物群可以促進(jìn)T淋巴細(xì)胞往抑制性淋巴細(xì)胞分化，誘導(dǎo)免疫耐受，有助于形成適應(yīng)性免疫[7]，這就提示腸道菌群改變可能會(huì)破壞免疫穩(wěn)態(tài)，破壞血小板。

3.2腸道細(xì)菌分為益生菌、條件致病菌和致病菌。腸道表層主要是大腸埃希菌、腸球菌，中層主要是厭氧菌，深層主要是乳酸桿菌和雙歧桿菌[8]。有研究發(fā)現(xiàn)正常人群腸道菌中擬桿菌門和厚壁菌門占明顯優(yōu)勢(shì)，二者占總量90%以上[9-10]。與一項(xiàng)納入9例ITP患者與10名健康成人的研究相似，其糞便樣本進(jìn)行16SrDNA高通量測(cè)序比較，也發(fā)現(xiàn)ITP患者腸道菌群存在擬桿菌增多，厚壁菌減少的情況[11]。用宏基因組學(xué)分析糞便，ITP患者可以檢測(cè)到8個(gè)菌門，正常對(duì)照者檢測(cè)到10個(gè)菌門，ITP厚壁菌門比例下降，腸道菌群發(fā)生了傾斜，且檢測(cè)到血小板活化狀態(tài)與腸道菌群構(gòu)成相關(guān)[11]。本研究只對(duì)豐度排前五的菌門進(jìn)行分析，未能完全反映菌門水平的變化。有報(bào)道長期服用益生菌和益生元調(diào)整腸道菌群，可發(fā)揮疾病治療作用[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，治療前難治性ITP乳酸桿菌屬、雙歧桿菌屬豐度下降，大腸桿菌豐度增加。補(bǔ)充益生菌后，在益生菌組中，乳酸桿菌屬、雙歧桿菌屬豐度增加明顯，大腸桿菌豐度下降，與治療前比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與對(duì)照組治療后比較，變化也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，支持補(bǔ)充益生菌有治療作用。

3.3腸道菌群失調(diào)可引起腸道黏膜屏障受損，內(nèi)毒素及致病菌可入血，引起機(jī)體產(chǎn)生炎性介質(zhì)釋放誘發(fā)人體一系列炎癥和免疫反應(yīng)。有隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)證明，補(bǔ)充有多種微生物的益生菌劑，可以降低患者的炎性細(xì)胞因子水平，包括TNF-α、IL-12[13]。腸道菌群對(duì)免疫的影響機(jī)制一直在研究中。有實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)用Schaedler菌群，做出結(jié)腸炎動(dòng)物模型，發(fā)現(xiàn)其通過MYD88信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，由IL-12和IFN-γ等共同調(diào)控，揭示了腸道菌群和腸道屏障的關(guān)系[14]。本研究結(jié)果與前面的研究有共同之處。提示檢測(cè)某些炎癥因子表達(dá)可以協(xié)助評(píng)估疾病變化。提示對(duì)于難治性ITP，補(bǔ)充乳酸桿菌、雙歧桿菌等有益菌，可協(xié)助控制機(jī)體炎癥反應(yīng)，減輕免疫失衡。益生菌治療后，伴隨腸道雙歧桿菌和乳酸桿菌含量升高，大腸桿菌下降，炎癥細(xì)胞因子下降明顯，血小板改善明顯，提示免疫異常有改善。關(guān)于機(jī)體免疫和腸道菌群的機(jī)制有多個(gè)研究，擬桿菌門代表脆弱擬桿菌可通過合成多聚糖使CD4+T細(xì)胞分化為Foxp3+調(diào)節(jié)T細(xì)胞，引起免疫抑制，維持機(jī)體免疫穩(wěn)態(tài)[15]。治療艾滋病患者時(shí)補(bǔ)充益生菌，發(fā)現(xiàn)其可以降低CD4+的活化過程，改變機(jī)體免疫狀態(tài)[16]。腸道菌群的代謝產(chǎn)物，如短鏈脂肪酸、乙酸丙酸丁酸通過不同的通路作用于T淋巴細(xì)胞，但都參與了宿主免疫狀態(tài)的改變[17]。尤其腸道微生物相關(guān)分子模式，這是一類由腸道微生物表達(dá)的、反映微生物進(jìn)化水平的分子。其中Toll樣受體，是腸道免疫系統(tǒng)介導(dǎo)識(shí)別和殺滅細(xì)菌的重要組成部分，有維持腸道穩(wěn)態(tài)的作用，其表達(dá)與擬桿菌、腸桿菌及腸球菌的含量呈正相關(guān)，與雙歧桿菌和乳酸桿菌的含量呈負(fù)相關(guān)[18]，這突出了雙歧桿菌、乳酸桿菌及腸球菌等的重要性。

3.4本研究初步表明，難治性ITP存在腸道菌群失調(diào)，炎癥細(xì)胞因子也有變化，用環(huán)孢素、達(dá)那唑加益生菌治療組，比較未加益生菌治療組，血小板數(shù)值升高較明顯，腸道菌群有改善，炎癥因子下降明顯。提示補(bǔ)充益生菌制劑可以改善腸道益生菌群的豐度，改善腸道菌群平衡，有利于提高ITP的血小板數(shù)值，可以作為治療ITP的一種策略。本研究由于樣本較少，且只專注于部分菌群的研究，具有局限性。期待未來有大樣本隨機(jī)對(duì)照研究，進(jìn)一步探討益生菌對(duì)難治性ITP治療的影響。