茉莉酸甲酯對莧菜中莧紅素積累的影響

金 顥， 朱昌華， 夏 凱， 甘立軍

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 南京 210095)

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茉莉酸甲酯對莧菜中莧紅素積累的影響

金 顥， 朱昌華， 夏 凱， 甘立軍

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 南京 210095)

摘要莧紅素是一種重要的次生代謝物質(zhì)，其合成受到光照等因素的誘導(dǎo)。分別以莧菜(Amaranthus mangostanus L.)子葉以及四葉期幼苗為材料，研究了茉莉酸甲酯(methyl jasmonate, MeJA)在莧紅素積累中的作用。結(jié)果表明：0.02～20 mg/L MeJA在光照及黑暗下均能顯著促進(jìn)莧菜子葉莧紅素的積累，且具有明顯的濃度效應(yīng)。在光照下20 mg/L MeJA處理所誘導(dǎo)的莧紅素含量是對照組(光照)子葉莧紅素含量的2.23倍，同時(shí)是黑暗下不加MeJA的對照組的10.91倍。對莧菜幼苗而言，茉莉酸甲酯可以促進(jìn)莧菜幼苗中莧紅素的積累，1.25～10 mg/L范圍的茉莉酸甲酯均有效促進(jìn)了莧紅素的積累，且10 mg/L 作用效果最顯著。但高濃度的茉莉酸甲酯會抑制莧菜幼苗的生長及葉片的展開。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，MeJA可引起酪氨酸酶活的上升進(jìn)而促進(jìn)莧紅素的合成。綜上所述，茉莉酸甲酯可以促進(jìn)莧菜子葉以及幼苗葉片和莖稈中莧紅素的積累，但同時(shí)對于莧菜幼苗的生長有一定的抑制效應(yīng)。

關(guān)鍵詞莧菜；茉莉酸甲酯；機(jī)械傷害；莧紅素

Inductive effect of methyl jasmonate on amaranthin accumulation in Amaranthus mangostanus L. seedlings

JIN Hao, ZHU Chang-hua, XIA Kai, GAN Li-jun

(College of Life Sciences, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

AbstractAmaranthin is one of the important plant secondary metabolites. Light can trigger the initiation of amaranthin biosynthesis in cotyledons ofAmaranthusmangostanusL. In this paper, withAmaranthusmangostanusL. as the material, the effect of MeJA (Methyl Jasmonate) on amaranthin synthesis was explored. MeJA ( 0.02-20 mg/L) induced amaranthin accumulation was dose-dependent both in light and darkness. When in darkness, 20 mg/L MeJA induced 10.91 fold amaranthin contents that of controls. While in light, the 20 mg/L MeJA induced 2.23-fold amaranthin in cotyledons exposed to light only. When used 4-leaf stage seedlings as material, MeJA (1.25-10 mg/L) could promote amaranthin accumulation both in cotyledons， leave, and stems ofAmaranthusmangostanusL. effect of 10 mg/L MeJA was the best, but high concentrations of MeJA could inhibit the growth of the seedlings and leaf expansion. The following experiments indicated that MeJA could induce amaranthin accumulation by promoting the activity of tyrosinase. From above, MeJA could promote amaranthin accumulation both in seedlings and cotyledon ofAmaranthusmangostanusL., but the application of MeJA had inhibitory effect on the plant growth and development.

KeywordsAmaranthusmangostanusL.; methyl jasmonate; mechanicnl wounding; amaranthin

莧紅素作為一種重要的次生代謝物質(zhì)[1]，在生物制藥、食品添加、工業(yè)制造等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，其產(chǎn)生的機(jī)制也被人們關(guān)注并研究[2]。早先的研究發(fā)現(xiàn)光是調(diào)控莧紅素合成的重要因素[3， 4]。另外，細(xì)胞分裂素類物質(zhì)如激動素、玉米素、6-BA等均可以促進(jìn)在光照條件下或黑暗下莧屬植物莧菜紅素類物質(zhì)的積累[5， 6]。作為甜菜紅素中的一種，其合成中研究較多的酶類有酪氨酸酶、多巴雙加氧酶、葡糖基轉(zhuǎn)移酶等[7]。研究人員在太陽花愈傷組織中檢測到酪氨酸羥化酶的活性[8]，該酶是檢測甜菜紅素合成的重要指標(biāo)。同時(shí)，果蔬在生產(chǎn)、加工運(yùn)輸?shù)冗^程中很容易受到機(jī)械傷害，因此，傷害以及茉莉酸對植物的影響的研究也一直為人們所關(guān)注[9]。

茉莉酸甲酯(methyl jasmonate, MeJA)是調(diào)控植物次生代謝物合成的重要激素[10]，可以作為信號分子激發(fā)植物的化學(xué)防御[11]，植物在受到機(jī)械損傷后，往往會產(chǎn)生一些諸如酚類、生物堿、萜類等次生代謝物質(zhì)[10, 12]。比如外源施用MeJA能提高花燭佛焰苞花青苷的含量[13]；傷害以及茉莉酸可以提高喜樹幼苗中喜樹堿的含量[14]；茉莉酸甲酯可以促進(jìn)馬齒莧屬(Portulaca)中甜菜紅素的積累等[9]。但MeJA對莧紅素的合成還未見系統(tǒng)地報(bào)道，因此我們探究了外源茉莉酸甲酯對于莧菜子葉以及幼苗中莧紅素積累的影響。

1材料和方法

1.1材料培養(yǎng)

1.1.1莧菜種子處理選取大小、飽滿度均一的莧菜(AmaranthusmangostanusL.)種子，經(jīng)去離子水沖洗以及1%次氯酸鈉消毒10 min。將種子均勻播于鋪有3層濾紙的培養(yǎng)盤中黑暗萌發(fā)48 h(相對濕度為70%，溫度25℃±0.5℃)后，將已萌發(fā)的莧菜種子于綠光燈下取出，去除種皮，并選取長勢一致的材料，用剪刀剪去根部及部分胚軸，留下長約3～4 mm實(shí)驗(yàn)用。

1.1.2苗期莧菜的培養(yǎng)將莧菜(AmaranthusmangostanusL.)種子均勻鋪散于小花盆中，采用蛭石：營養(yǎng)土(體積比為2∶1)培養(yǎng)幼苗。所有莧菜幼苗均于南京農(nóng)業(yè)大學(xué)牌樓實(shí)驗(yàn)基地的溫室中培養(yǎng)(白天溫度18℃～26℃；夜間溫度12℃～15℃)。待莧菜苗長至4葉期，用不同方式處理。之后每隔1 d取樣測定各項(xiàng)指標(biāo)。

1.1.3莧菜子葉期處理茉莉酸甲酯處理：將30根子葉均勻放于鋪有2層濾紙的9 mm培養(yǎng)皿中，將茉莉酸甲酯溶液(茉莉酸甲酯用少量乙醇助溶，之后稀釋為所用濃度)加入培養(yǎng)皿中，其濃度梯度為：0、0.02、0.2、2和20 mg/L。光照組的培養(yǎng)皿放于光下(10 000 lx)照射9 h之后轉(zhuǎn)至黑暗中，兩組同樣在24 h時(shí)分別取樣并拍照觀察。對照組的培養(yǎng)皿中加入磷酸緩沖液(pH 6.3)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次以上。

1.1.4苗期茉莉酸甲酯處理待溫室中的莧菜幼苗長至4葉期時(shí)，用茉莉酸甲酯對幼苗噴施處理，濃度為：0、1.25、2.5、5和10 mg/L。對照組噴施清水。處理當(dāng)天以及之后每隔1 d進(jìn)行取樣測定莧紅素的含量，另外在處理后第10天，取樣測定莧菜生長指標(biāo)及莧紅素的含量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次以上。

1.2測定指標(biāo)

1.2.1莧菜幼苗葉片及莖稈中莧紅素含量的測定

參照Piattelli[15]的方法并進(jìn)行一定的改進(jìn)。分別稱取莧菜幼苗的第4、第5及第6葉片及莖稈的鮮重，使用液氮研磨充分，加入適量的去離子水，在4℃下8 000 r/min離心15 min，之后取上清液用于531 nm處吸光值的測定。根據(jù)甜菜素的消光系數(shù)5.66×104計(jì)算莧紅素的含量[23]。

1.2.2酪氨酸酶活性的測定參照Yamamoto[8]的方法，并進(jìn)行一定的修改。3 mL反應(yīng)液(60 mmol/L磷酸緩沖液(pH 6.3); 2 mmol/L酪氨酸，30 mmol/L抗壞血酸以及0.1 mg/L過氧化氫酶)，在25℃下放置15 min后，加入200 μL酪氨酸酶提取液，反應(yīng)開始，30 min后加入2 mL 50%的磷酸溶液終止反應(yīng)。之后于4℃下10 000 r/min離心15 min，用上清液在279 nm 測定其吸光度，使用煮過的酪氨酸酶提取液，按照同樣的操作步驟作對照。定義吸光度改變0.01為一個(gè)酪氨酸酶活力單位，酶活性以U/mg·protein表示。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次以上。

1.3數(shù)據(jù)處理和分析

用GraphPad5.01、Excel2003及PhotoShopCS4等進(jìn)行作圖及數(shù)據(jù)分析，用Spass16.0進(jìn)行差異顯著性分析。

2結(jié)果與分析

2.1茉莉酸甲酯促進(jìn)子葉中莧紅素的積累

圖1 茉莉酸甲酯在光/暗下促進(jìn)莧菜子葉中莧紅素積累的效應(yīng)

其中光照強(qiáng)度為10 000 lx，溫度25℃; 所有處理放于黑暗中保存24 h再進(jìn)行莧紅素的測定；a、b、c等字母表示各組MeJA處理的莧紅素含量在P< 0.05水平上的顯著性差異。

如圖1所示，光/暗下MeJA均可以促進(jìn)莧菜子葉中莧紅素的積累。黑暗下，0.02 mg/L MeJA誘導(dǎo)莧菜子葉莧紅素的合成量是對照的2.7倍，當(dāng)MeJA的濃度為20 mg/L時(shí)，黑暗下誘導(dǎo)的莧紅素的含量是對照組的5.96倍。光和MeJA的共同誘導(dǎo)可以促進(jìn)更多的莧紅素的合成。20 mg/L 的MeJA光下所誘導(dǎo)的莧紅素含量是僅光照9 h所誘導(dǎo)莧紅素含量的2.23倍，同時(shí)是暗下對照組的10.91倍。

2.2茉莉酸甲酯對莧菜幼苗株高和地上部鮮重的影響

表1 茉莉酸甲酯對莧菜幼苗株高以及地上部鮮重的影響

在第0天時(shí)噴施MeJA，每隔1 d采樣測定數(shù)據(jù)；小寫字母a、b、c、d等表示不同濃度MeJA處理組的株高及地上部鮮重在P< 0.05水平上有顯著性差異。

表 2 茉莉酸甲酯對莧菜幼苗根長和地下部鮮重的影響

在第0天時(shí)噴施MeJA，每隔1 d采樣測定數(shù)據(jù)；小寫字母a、b、c、d等表示不同濃度MeJA處理組的根長及地下部鮮重在P< 0.05水平上有顯著性差異。

圖 2茉莉酸甲酯處理對莧菜幼苗葉片及

Fig 2 Effect of MeJA on amaranthin accumulation in the leaf and the stem ofAmaranthusmangostanusL. Bars with a, b, c etc indicate significant differences compared to corresponding control samples atP< 0.05 level.

a： 莖稈； b： 第4葉； c： 第5葉； d： 第6葉。

由表1可見，在處理第8天時(shí)，5 mg/L MeJA處理的幼苗株高是對照的93%，地上部鮮重是對照的87%；而10 mg/L MeJA處理的莧菜幼苗的株高在第8天時(shí)，株高是對照的80%，地上部鮮重是對照的72%。以上說明，對莧菜幼苗噴施MeJA時(shí)，低濃度的溶液對于幼苗的株高及地上部鮮重?zé)o明顯影響；高濃度的溶液對幼苗的株高的伸長以及地上部鮮重出現(xiàn)顯著的抑制作用。

2.3茉莉酸甲酯對莧菜幼苗根長和地下部鮮重的影響

由表2可知， 10 mg/L MeJA處理的莧菜幼苗的根長有明顯下降趨勢，在處理第8天時(shí)，根長是對照組的63%，地下部鮮重卻與對照組相當(dāng)，差異不顯著, 結(jié)合實(shí)際分析，在MeJA處理后，莧菜幼苗的不定根的數(shù)量增多，使得根部雖長度受到抑制，但重量仍不受影響甚至有所增加。

2.4茉莉酸甲酯處理對莧菜葉片及莖稈中莧紅素積累的濃度效應(yīng)

由圖2可見，用不同濃度的MeJA處理莧菜幼苗10 d后，MeJA的濃度為5 mg/L時(shí)，莖稈中的莧紅素的含量與對照相比，差異達(dá)到顯著水平，而當(dāng)MeJA的濃度為10 mg/L時(shí)，莖稈部位的莧紅素的含量是對照的1.70倍。對于幼苗的第4、第5及第6葉片，1.25～10 mg/L范圍的MeJA均有效促進(jìn)了莧紅素的積累，且10 mg/L 作用效果最顯著，第4、第5及第6張葉片中莧紅素的含量分別是對照的2.53、4.22及5.11倍。

2.5 茉莉酸甲酯處理時(shí)莧菜葉片及莖稈中莧紅素的時(shí)間變化

圖 3 茉莉酸甲酯處理后莧菜幼苗葉片及

a： 莖稈； b： 第4葉; c: 第5葉; d: 第6葉； control：噴施清水處理; MeJA1.25：MeJA噴施濃度為1.25 mg/L； MeJA10: MeJA噴施濃度為10 mg/L。

由圖3可見，莧紅素含量隨著時(shí)間的推移均呈現(xiàn)下降的趨勢。在第10天時(shí), 對照組莖稈中莧紅素含量是處理當(dāng)天的36.4%，而第4、第5及第6葉中的含量分別是處理當(dāng)天(五葉、六葉與新生葉完全長出時(shí)比較)的35.9%、16.8%和49%。10 mg/L MeJA處理組的莧紅素含量一直在較高水平，下降趨勢也較對照組緩慢。結(jié)果表明，在莧菜的生長過程中，不同部位的莧紅素的含量會隨著時(shí)間的推移而降低，且老葉中莧紅素的含量高于新生葉中的含量。

2.6茉莉酸甲酯及機(jī)械傷害對莧菜處理葉片中酪氨酸酶活性的影響

由圖4可知，MeJA處理幼苗后，葉片中的酪氨酸酶的羥化活性呈現(xiàn)上升趨勢，在處理后1 d，MeJA處理組葉片酪氨酸酶的羥化活性達(dá)到62 U/mg·Pro，是處理當(dāng)天葉片的1.76倍，但在之后的幾天里，MeJA處理組的酶活呈現(xiàn)下降的趨勢；機(jī)械傷害組的葉片中酪氨酸酶的羥化活性也在處理后出現(xiàn)上升的現(xiàn)象，在處理后第2天達(dá)到最高，56 U/mg·Pro，而在之后，機(jī)械傷害組的酪氨酸酶羥化活性隨時(shí)間推移而出現(xiàn)下降。用MeJA和機(jī)械傷害處理后，葉片中的酪氨酸酶均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，也許是因?yàn)槊富钚缘膯适У纫蛩卦斐伞?/p>

圖4 茉莉酸甲酯以及機(jī)械傷害處理后莧菜幼苗葉片中

Control：噴施清水處理; MeJA10：MeJA噴施濃度為10 mg/L; Wounding：機(jī)械傷害處理。

3討論

環(huán)境或者一些生物非生物脅迫均會引起植物次生物質(zhì)的代謝，傷害是一種常見的刺激信號，可以激發(fā)植物體內(nèi)茉莉酸信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)，進(jìn)而引起植物的防御系統(tǒng)，加強(qiáng)了植物次生代謝，使植物獲得抗性。同時(shí)，茉莉酸甲酯是調(diào)控植物次生代謝物合成的重要激素，可以調(diào)控多種植物次生代謝物質(zhì)的產(chǎn)生。在本文中，我們發(fā)現(xiàn)，茉莉酸甲酯明顯促進(jìn)莧菜子葉以及幼苗中莧紅素的積累。Cao等[16]研究表明，茉莉酸可以作為誘導(dǎo)物強(qiáng)烈促進(jìn)莧菜萌發(fā)期時(shí)莧紅素的積累，且在茉莉酸濃度為100 μmol/L時(shí)，莧紅素的積累量達(dá)到最高，我們的結(jié)果與之相似。

同時(shí)，茉莉酸甲酯作為傷信號，外源施加于植物時(shí)往往給植物的生長發(fā)育帶來很大的影響。Singh等[17]的研究表明，在水稻中，外源施加茉莉酸甲酯可以緩解鈣離子引起的氧化性脅迫，但同時(shí)也在一定程度上抑制了水稻幼苗的生長。謝陽姣等[18]的研究表明，用茉莉酸甲酯噴施苦玄參幼苗，雖然提高了苦玄參苷的積累量，但同時(shí)會抑制其株高、葉片以及分枝的生長，將其成熟期提前，縮短了其生育期。在本文中，葉面噴施茉莉酸甲酯在一定程度上抑制了莧菜幼苗株高的生長以及葉片的展開，降低了幼苗生物量的積累。所以，在生產(chǎn)中若是為了提升生物量，茉莉酸甲酯的應(yīng)用會使莧菜的生育期縮短，生物量下降，這無疑在一定程度上限制了其應(yīng)用；但是若以獲得更多的莧紅素的產(chǎn)量為目的，可以考慮合理地應(yīng)用茉莉酸甲酯，選擇合適的濃度，在幼苗將近成熟的時(shí)期使用，將會獲得較好的效果。

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中圖分類號Q946；TS264.4

文獻(xiàn)標(biāo)識碼A

文章編號2095-1736(2016)02-0054-05

作者簡介：金顥，碩士研究生，從事植物激素生理和生物技術(shù)研究，E-mail：806496252@qq.com。通信作者：甘立軍，副教授，從事植物激素生理生化研究, E-mail:ganlj@njau.edu.cn。

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30300216)

收稿日期：2015-08-05；修回日期：2015-08-28

doi∶10.3969/j.issn.2095-1736.2016.02.054