復(fù)方黑骨藤抗類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎作用及機(jī)制的研究

侯玉婷,　黎　霞,　張　宏,　王菡鈺,　張曉凰,　湯義珍

(四川師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 四川 成都 610101)

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復(fù)方黑骨藤抗類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎作用及機(jī)制的研究

侯玉婷,黎霞,張宏*,王菡鈺,張曉凰,湯義珍

(四川師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 四川 成都 610101)

摘要：目的：研究復(fù)方黑骨藤對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)的治療作用及其作用的分子機(jī)制.方法：將實(shí)驗(yàn)大鼠分組并建立佐劑性關(guān)節(jié)炎(AA)動(dòng)物模型，觀察復(fù)方黑骨藤低、中、高劑量對(duì)AA大鼠足腫脹、體重、器官指數(shù)及血清白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)含量水平的影響.結(jié)果：復(fù)方黑骨藤能有效抑制AA大鼠足腫脹，降低胸腺指數(shù)，下調(diào)AA大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α的含量水平.結(jié)論：復(fù)方黑骨藤具有良好的抗RA作用，其作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)免疫器官功能及減少IL-1、IL-6、TNF-α的產(chǎn)生，從而達(dá)到抗炎消腫和阻止關(guān)節(jié)軟骨破壞的作用有關(guān).

關(guān)鍵詞：復(fù)方黑骨藤; 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎; 白細(xì)胞介素-1β; 腫瘤壞死因子-α; 白細(xì)胞介素-6

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)是以關(guān)節(jié)滑膜為靶器官的影響活動(dòng)關(guān)節(jié)的自身免疫性疾病，其主要病理基礎(chǔ)為滑膜炎癥[1]，主要表現(xiàn)為免疫調(diào)節(jié)失衡、關(guān)節(jié)組織慢性炎癥病變.其發(fā)病機(jī)制涉及抗原、免疫細(xì)胞、細(xì)胞因子等多種因素參與的一系列免疫反應(yīng)[2-3]，入侵的抗原被滑膜細(xì)胞吞噬、加工、處理后，將抗原信息傳遞給并激活T淋巴細(xì)胞，使之釋放出多種細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子及各種遞質(zhì)，最終導(dǎo)致了滑膜炎及血管翳的生成，進(jìn)而出現(xiàn)關(guān)節(jié)畸形及功能喪失[4].黑骨藤具有祛風(fēng)除濕、舒筋活血、止痛等功效，主治風(fēng)濕麻木疼痛，跌打損傷、骨折、骨痛等[5]，藥理研究表明它在治療風(fēng)濕與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等疾病方面有明顯的療效[6]，且作用明顯，毒副作用小.復(fù)方黑骨藤是以黑骨藤為主藥，配以秦艽、元胡兩味中藥經(jīng)乙醇超聲提取后所得.

1材料

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)SD大鼠，雄性，體質(zhì)量(180±10) g.由四川省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物專委會(huì)養(yǎng)殖場(chǎng)提供，生產(chǎn)許可證為SCXK(川)2013-24.

1.2藥材與藥品黑骨藤PeriplocaforrestiiSchltr. 藥材購買于西昌藥材市場(chǎng)，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)張藝鑒定；秦艽(GentianamacrophyllaPall.,批號(hào)：20130526)及元胡(Rhizomacorydalis，批號(hào)：20130605)均購買與北京同仁堂股份有限公司.醋酸潑尼松片(批號(hào)：國(guó)字準(zhǔn)藥：H33021207，規(guī)格5 mg/片，浙江仙琚制藥股份有限公司生產(chǎn))；雷公藤多苷片(批號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字Z31020415，規(guī)格10 mg/片，上海復(fù)旦復(fù)華藥業(yè)有限公司生產(chǎn))；復(fù)方黑骨藤(高、中、低劑量組)由本實(shí)驗(yàn)室自制.

1.3試劑與儀器弗氏完全佐劑Freund’ scomplete adjuvant,FCA，sigma公司生產(chǎn))，IL-1β、IL-6、TNF-α定量ELISA試劑盒(均由上海邦奕公司生產(chǎn)，批號(hào)分別為DRE20113，DRE20064，DRE20040).全波長(zhǎng)紫外分光光度計(jì)(Mss，成都軍能海爾思科技有限公司)，離心機(jī)(Anke TGL-16G，上海安亭科學(xué)儀器廠)，動(dòng)物天平(ESJ120-3，沈陽龍騰電子稱量?jī)x器有限公司)，PV-200足腫脹測(cè)定儀(TW025-0812，成都泰盟科技發(fā)展有限公司生產(chǎn)).

2方法

2.1動(dòng)物分組及造模取SD健康雄性大鼠70只，鼠齡3月，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，實(shí)驗(yàn)前將動(dòng)物隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型組、醋酸潑尼松組、雷公藤多苷片組、復(fù)方黑骨藤(高、中、低劑量)組共7組，每組各10只.實(shí)驗(yàn)當(dāng)天，參照文獻(xiàn)[7]的佐劑性關(guān)節(jié)炎造模方法，除空白組外，每只大鼠右后足趾皮下注射0.1 mL弗氏完全佐劑致炎，空白組注射等量0.9%氯化鈉溶液.大鼠注射弗氏完全佐劑6 h后，足腫脹開始持續(xù)增加，膝關(guān)節(jié)變大，說明造模成功.

2.2給藥致炎24 h后，分別給實(shí)驗(yàn)鼠灌胃相應(yīng)的藥液，空白組和模型組每天灌胃質(zhì)量分?jǐn)?shù)5‰ CMC-Na溶液；陽性組分別灌胃醋酸潑尼松29.2 mg·kg-1·BW、雷公藤多苷37.5 mg·kg-1·BW；復(fù)方黑骨藤高、中、低劑量組分別灌胃劑量67、44、22 mg，每天每只大鼠灌胃1次，2 mL/只.連續(xù)灌胃21 d.

2.3大鼠足腫脹的測(cè)定用PV-200足腫脹測(cè)定儀分別于造模后第18小時(shí)、2、4、7、11、14、21天測(cè)量各組大鼠左、右足足跖容積，計(jì)算出足腫脹容積差值(足腫脹容積差=右足足拓容積-左足足拓容積).

2.4大鼠體重的測(cè)定于致炎前和致炎后第2、8、15、21天稱量大鼠體重，統(tǒng)計(jì)各組大鼠體重變化.

2.6血漿中IL-1β、IL-6、TNF-α的含量測(cè)定持續(xù)給藥21 d后將大鼠處死，心臟取血，檢測(cè)血液中IL-1β、IL-6、TNF-α的含量.測(cè)定方法為：血液以3 000 r/min離心10 min，取上清液，采用ELISA方法分別測(cè)得血漿中IL-1β、IL-6、TNF-α的含量.

3結(jié)果

3.1藥物對(duì)AA大鼠足腫脹的影響造模后，模型組從第1天起持續(xù)腫脹至第4天，而后開始逐漸消退；第11天后腫脹繼續(xù)發(fā)生，與空白組對(duì)照有極顯著差異(P<0.01).陽性組、復(fù)方黑骨藤組與模型組比較差異顯著(P<0.05)；雷公藤多苷組、復(fù)方黑骨藤高、中、低劑量組均能明顯減輕AA大鼠膝關(guān)節(jié)炎癥，使腫脹度明顯下降(P<0.05)；醋酸潑尼松組對(duì)AA大鼠膝關(guān)節(jié)炎癥的改善極明顯，使腫脹度能夠顯著下降(P<0.01).

表 1　復(fù)方黑骨藤對(duì)SD大鼠膝關(guān)節(jié)病變的影響+s)

注:與模型組對(duì)比1:P<0.05；與模型組對(duì)比2:P<0.01；與空白組對(duì)比3:P<0.01.

3.2藥物對(duì)AA大鼠體重的影響從表2可知，模型對(duì)照組、醋酸潑尼松組于注射佐劑后第8天與空白組大鼠體重對(duì)照，差異極顯著(P<0.01)，注射佐劑后大鼠的體重發(fā)生了變化，先正常生長(zhǎng)，后體重開始增長(zhǎng)緩慢.雷公藤多苷組、復(fù)方黑骨藤組與模型組大鼠體重比較，于21 d后出現(xiàn)顯著性差異，且各組大鼠的活動(dòng)，進(jìn)食正常，體重增加，且較空白組沒有顯著性差異.

3.3藥物對(duì)AA大鼠個(gè)臟器指數(shù)的影響從表3可知，醋酸潑尼松對(duì)胸腺、脾臟有顯著抑制作用，較模型組差異極顯著(P<0.01)，胸腺、脾臟出現(xiàn)了萎縮；復(fù)方黑骨藤高、中劑量組也能夠降低胸腺指

表 2　復(fù)方黑骨藤對(duì)AA大鼠體重的影響

注:與模型組對(duì)比1:P<0.05；與模型組對(duì)比2:P<0.01；與空白組對(duì)比3:P<0.01.

表 3　復(fù)方黑骨藤對(duì)AA大鼠各臟器指數(shù)的影響+s,n=10)

注:與模型組對(duì)比1:P<0.05；與模型組對(duì)比2:P<0.01；與空白組對(duì)比3:P<0.01.

表 4　復(fù)方黑骨藤對(duì)AA大鼠血漿中IL-1β、IL-6、 TNF-α含量的影響

注:與模型組對(duì)比1:P<0.05；與模型組對(duì)比2:P<0.01；與空白組對(duì)比3:P<0.01.

數(shù)，與模型組比較有顯著差異(P<0.05)，但不及醋酸潑尼松組.雷公藤多苷片和復(fù)方黑骨藤組的腎臟、脾臟、指數(shù)較空白組的高；醋酸潑尼松組、雷公藤多苷組、劑量復(fù)方黑骨藤組的肝臟指數(shù)較模型組的高.

3.4藥物對(duì)AA大鼠血漿中IL-1β、IL-6、TNF-α含量的影響從表4可見，醋酸潑尼松降低了AA大鼠血漿中IL-1β、IL-6、TNF-α的含量水平，與模型組比較差異極顯著(P<0.01)；雷公藤多苷片組、低、中、高劑量復(fù)方黑骨藤組與模型組比較也有顯著性差異(P<0.05)，表明雷公藤與復(fù)方黑骨藤均有不同程度的降低血漿中IL-1β、IL-6、TNF-α的含量水平.低劑量復(fù)方黑骨藤組與雷公藤多苷組之間的差異不顯著.

4討論

RA是一種嚴(yán)重影響人類健康的以關(guān)節(jié)滑膜炎癥病變?yōu)橹饕攸c(diǎn)的全身性、慢性、自身免疫性疾病，胸腺、脾臟等指數(shù)的變化也是反映動(dòng)物機(jī)體免疫功能的最基本和最常規(guī)的指標(biāo)之一.作為初步觀察藥物對(duì)免疫功能影響的指標(biāo)，本試驗(yàn)?zāi)壳把芯拷Y(jié)果表明，復(fù)方黑骨藤能顯著降低胸腺指數(shù)，提高腎臟、肝臟、脾臟指數(shù)，提示黑骨藤可能通過調(diào)節(jié)免疫器官功能來提高抗類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎作用的能力，其與雷公藤多苷沒有顯著性差異，但不及醋酸潑尼松.醋酸潑尼松對(duì)AA大鼠的體重增長(zhǎng)有較大的影響，并使其胸腺極度萎縮，表現(xiàn)出較強(qiáng)的免疫抑制作用.

國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)RA的發(fā)生發(fā)展與細(xì)胞因子有密切關(guān)系，RA發(fā)生機(jī)制是由于患者體內(nèi)細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)自身調(diào)節(jié)系統(tǒng)被破壞，細(xì)胞因子異常產(chǎn)生及功能紊亂所引起[8].在細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)中以白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白細(xì)胞介素-6(IL-6)為代表的致炎性細(xì)胞因子研究的比較多，它們?cè)谟|發(fā)滑膜細(xì)胞激活導(dǎo)致關(guān)節(jié)受損和誘導(dǎo)炎癥過程中起著重要作用[9].IL-1β和TNF-α主要由單核細(xì)胞及巨噬細(xì)胞產(chǎn)生[10]，二者相互協(xié)調(diào)、促進(jìn)，它們的效應(yīng)及靶細(xì)胞的范圍有很大的相似性，均是RA致病機(jī)理中具中心地位的促炎癥細(xì)胞因子，參與RA發(fā)生發(fā)展的全過程.IL-1β、TNF-α均可通過刺激滑膜組織滑膜細(xì)胞核軟骨細(xì)胞中IL-6、前列腺素E2、膠原酶和基質(zhì)金屬蛋白酶的合成釋放，引起RA患者免疫功能紊亂，局部炎癥反應(yīng)加劇，骨與軟骨基質(zhì)不可逆破壞，以及血管翳形成[9,11]；同時(shí)使破骨細(xì)胞減少糖蛋白合成，增加糖蛋白降解，并產(chǎn)生膠原酶和其他中性蛋白酶，釋放骨鈣等，從而導(dǎo)致骨和軟骨破壞[12].大量研究表明TNF-α和IL-1β在滑膜炎癥中高度表達(dá)，通過抗腫瘤壞死因子α和白細(xì)胞介素β的治療，減少TNF-α和IL-1β表達(dá)，對(duì)治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎有確切的療效[4,13].IL-6是一種促炎癥細(xì)胞因子，能增強(qiáng)IL-1和TNF-α的效應(yīng)，被認(rèn)為是TNF-α的某些生物效應(yīng)的放大因子[14].IL-6能夠促進(jìn)B細(xì)胞增殖，并分化為免疫球蛋白分泌細(xì)胞，促進(jìn)肝臟合成急性相關(guān)蛋白和促進(jìn)類風(fēng)濕因子的合成[15].此外IL-6可以通過提高骨細(xì)胞和滑膜細(xì)胞中細(xì)胞核因子κβ活化因子配體的釋放，促進(jìn)破骨細(xì)胞生成因子表達(dá)[16].而且研究也表明RA患者血清及滑膜液中IL-6及IL-6R濃度升高，IL-6的水平和疾病活動(dòng)性及臨床表現(xiàn)有密切關(guān)系[17].本研究發(fā)現(xiàn)模型組AA大鼠血清中IL-1β、TNF-α、IL-6含量均顯著高于空白組大鼠(均P<0.01)，證明細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)失衡在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的病程發(fā)展中發(fā)揮重要作用.AA大鼠經(jīng)過治療后，細(xì)胞因子水平明顯降低，其中醋酸潑尼松和高劑量復(fù)方黑骨藤下降最為明顯(P<0.01)，雷公藤多苷和低、中劑量復(fù)方黑骨藤組下降比較明顯(P<0.01，P<0.05)，表明醋酸潑尼松、雷公藤多苷、復(fù)方黑骨藤均可降低細(xì)胞因子水平，且中劑量復(fù)方黑骨藤較雷公藤多苷片效果更加明顯.說明復(fù)方黑骨藤能減少IL-1β、IL-6及TNF-α的產(chǎn)生，從而達(dá)到抗炎及阻止軟骨破壞的作用來發(fā)揮抗RA的作用.這可能是復(fù)方黑骨藤方治療RA的途徑之一，這與其他研究成果相似[18-24].

該研究為復(fù)方黑骨藤用于治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等自身免疫性疾病的分子機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，同時(shí)更進(jìn)一步地驗(yàn)證了在關(guān)節(jié)抗炎和免疫抑制及阻止軟骨破壞的作用方面，顯示了復(fù)方黑骨藤具有較大的開發(fā)和應(yīng)用前景.

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(編輯周俊)

Effects and Mechanism ofPeriplocaforrestiiSchltr.Compound Against Rheumatoid Arthritis

HOU Yuting,WANG Hanyu,LI Xia,ZHANG Hong,ZHANG Xiaohuang,TANG Yizhen

(SchoolofLifeSciences,SichuanNormalUniversity,Chengdu610101,Sichuan)

Abstract：To achieve the anti-arthritic effects and the possible molecular mechanism against rheumatoid arthritis (RA), the Periploca forrestii Schltr. Compounds were studied by observing the changes of paw swelling, body weight, viscera index and levels of interleukin 1β(IL-1β), interleukin 6(IL-6)and tumor necrosis factor α(TNF-α) after medication with establishing Freund’s adjurant arthritis (AA) rat model. It shows that Periploca forrestii Schltr. compound effectively inhibits articular swelling, decreases thymus index and regulates down the content of IL-1β, IL-6 and TNF-α in the serum of AA rats by reducing the production of IL-1β, IL-6 and TNF-α as well as inhibiting joint damage.

Key words：Periploca forrestii Schltr compound; rheumatoid arthritis; interleukin-1β; tumor necrosis factor-α; interleukin-6

doi:10.3969/j.issn.1001-8395.2016.01.022

中圖分類號(hào)：R285.5

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1001-8395(2016)01-0123-05

*通信作者簡(jiǎn)介：張宏(1965—)，女，教授，主要從事天然產(chǎn)物化學(xué)的研究,E-mail:401923129@qq.com

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金(31240087)

收稿日期:2015-03-25