Gankyrin蛋白在喉鱗癌中表達的實驗研究

趙孝通， 張 園， 劉方舟， 李培華

臨床與基礎研究

Gankyrin蛋白在喉鱗癌中表達的實驗研究

趙孝通， 張 園， 劉方舟， 李培華

目的 研究Gankyrin蛋白在喉鱗癌組織及喉鱗癌Hep-2細胞系中的表達。方法 免疫組織化學方法檢測24例喉鱗癌組織、相應癌旁組織及10例正常組織，免疫細胞化學法檢測Hep-2細胞系中Gankyrin蛋白的表達與分布，并計算陽性細胞率，進行統(tǒng)計分析。結果 喉鱗癌組織及Hep-2細胞系中，Gankyrin蛋白主要表達于細胞核。喉鱗癌組織中Gankyrin蛋白表達陽性細胞率(58.5%)明顯高于相應癌旁組織(11.4%)及正常組織(18.1%)，且差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.01)。結論 喉鱗癌組織及喉鱗癌Hep-2細胞系中均有Gankyrin蛋白的表達，可為Gankyrin在喉鱗癌中表達的后續(xù)相關研究提供理論依據(jù)。

喉鱗狀細胞癌; 免疫組織化學; Gankyrin； 腫瘤標記物

喉鱗癌是頭頸部常見的惡性腫瘤，其發(fā)生發(fā)展受體內多種基因及蛋白影響。Gankyrin蛋白又名p28GANK，是近年發(fā)現(xiàn)的癌蛋白。2000年， HIGASHITSUJI等人[1]在人肝癌組織cDNA文庫中發(fā)現(xiàn)了Gankyrin基因，并通過對比肝癌組織與正常組織，首次提出Gankyrin mRNA在肝癌組織中高表達，拉開了人們對Gankyrin研究的序幕?，F(xiàn)有關Gankyrin的研究多集中于消化系統(tǒng)腫瘤，本研究應用免疫組織化學方法對Gankyrin蛋白在喉鱗癌組織與喉鱗癌Hep-2細胞系中的表達進行定位，旨在為進一步研究Gankyrin蛋白表達與喉鱗癌間的關系做基礎研究，并為后續(xù)臨床診療研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組織標本 24例喉鱗癌組織及相應癌旁組織(腫瘤周邊≤2 cm內的組織)、10例正常組織(腫瘤周邊>2 cm外的組織)均取自2013年7月至2014年7月期間在江蘇省腫瘤醫(yī)院頭頸外科住院手術患者，全為男性,24例，年齡50～82歲，中位年齡63歲。標本常規(guī)多聚甲醛固定石蠟包埋，用于免疫組織化學檢測。所選患者術前均未施行放療、化療，術后腫瘤組織經病理科兩位副主任醫(yī)師病理確診。

1.1.2 細胞系 喉鱗癌Hep-2細胞系由南京市鼓樓醫(yī)院沈曉輝副主任醫(yī)師惠贈。

1.1.3 主要試劑與儀器 兔抗人 Gankyrin單克隆抗體購自北京博奧森生物技術有限公司(BIOSS，稀釋比例1∶100)，通用型SP免疫組織化學試劑盒和DAB顯色試劑盒購自福州市邁新生物技術開發(fā)公司，10%胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司，不完全DMEM(高糖)培養(yǎng)基購自GIBCO，CO2培養(yǎng)箱(HERA cell 150)購自Thermo，倒置熒光顯微鏡(Axiovert 200)(ZEISS)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 喉鱗癌Hep-2細胞系在含10%的胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基(含青霉素80 U/ml；鏈霉素0.08 mg/ml；L-谷氨酰胺和碳酸鈉)中生長，于37 ℃，5%CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)，細胞密度達80%后傳代。

1.2.2 喉鱗癌組織的免疫組織化學檢測 實驗采用常規(guī)免疫組織化學方法SP法。組織標本經多聚甲醛固定，石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片，常規(guī)脫蠟，梯度酒精脫水；于枸櫞酸緩沖液(pH=6.0)中行微波抗原修復；滴加過氧化氫，室溫孵化；滴加BSA封閉液，37 ℃加熱20 min；滴加兔抗人Gankyrin單抗(1∶100)，4℃過夜， PBS代替一抗作陰性對照；次日，滴加生物素標記二抗，置37 ℃加熱30 min；滴加標記鏈霉素卵白素工作液，置37 ℃加熱30 min；DAB顯色，蘇木精染色，封片。

1.2.3 喉鱗癌Hep-2細胞系的免疫細胞化學檢測 Hep-2細胞系經常規(guī)消化離心后，取細胞懸液滴至滅菌的蓋玻片，滴加DMEM培養(yǎng)液，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中行細胞爬片24 h；PBS清洗，滴加丙酮固定15 min。細胞爬片制作完成后，余下步驟同SP法免疫組化。

1.3 結果觀察

喉鱗癌組織和喉鱗癌Hep-2細胞系中的Gankyrin蛋白經染色后呈棕黃色顆粒，于熒光顯微鏡下選取多個×10視野觀察，以已知Gankyrin蛋白陽性表達的肝癌組織作陽性對照，腫瘤細胞的細胞核(少量胞質)中表達為陽性細胞。將組織切片(細胞爬片)置于鏡下，隨機選取10個不重復視野，各計100個細胞中Gankyrin蛋白陽性細胞數(shù)，取均值后算得陽性細胞所占比例，即陽性細胞率=陽性細胞數(shù)平均值/100×100%。

1.4 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 Gankyrin蛋白在喉鱗癌組織中的表達

Gankyrin蛋白在喉鱗癌組織中的免疫組織化學結果顯示，Gankyrin蛋白主要定位于喉鱗癌組織的細胞核內，呈棕黃色顆粒，深淺不一。此外，亦有少量腫瘤細胞胞質中見Gankyrin蛋白表達。喉鱗癌組織中Gankyrin蛋白表達水平較高，相應的癌旁組織中Gankyrin蛋白的表達水平較低(圖1、圖2)。喉癌組織與癌旁組織和正常組織間的陽性細胞率差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01，表1)。

圖1 Gankyrin蛋白在喉鱗癌組織中的表達(SP法 ×200)

圖2 Gankyrin蛋白在癌旁組織中的表達(SP法 ×200)

癌組織癌旁組織正常組織P陽性細胞百分率58.5±1.6711.4±1.42*18.1±1.81*<0.01

注：*癌組織組與癌旁組織組(t=89.230，P<0.01)、癌組織組與正常組織組(t=63.310，P<0.01)比較有統(tǒng)計學意義。

2.2 Gankyrin蛋白在喉鱗癌細胞系Hep-2中的表達

Hep-2細胞中Gankyrin蛋白的陽性染色定位及陽性細胞率與其在喉鱗癌組織中的檢測結果基本相符。通過顯色，Gankyrin蛋白陽性染色除主要定位在喉鱗癌Hep-2細胞系的細胞核, 部分細胞質同時為陽性染色，陽性細胞百分率為62.4%(圖3)。

圖3 Gankyrin蛋白在喉鱗癌細胞系Hep-2中的表達(SP法 ×200)

3 討論

Gankyrin蛋白是一種在空間結構上高度保守的小分子蛋白，其通過與不同蛋白質的結合，調控細胞的增值并產生相應的細胞生命活動[2]。研究表明，Gankyrin蛋白的致瘤性與Rb密切相關，Gankyrin蛋白可競爭性抑制p16與CDK4結合，從而釋放CDK4的活性，促進Rb的磷酸化，增強細胞的增殖[3]；Gankyrin蛋白的高表達還能提高癌基因MDM2/HDM2的活性，進而促進MDM2對p53泛素化降解，促使細胞過度增殖及腫瘤細胞的形成[4];此外，與RelA直接結合后，Gankyrin蛋白可在轉錄水平通過SIRT1調控乙酰化，抑制NF-κB通路的激活，下調NF-κB的促凋亡作用[5]。MAN等[6]指出，Gankyrin蛋白能夠促進RhoA與RhoGDI(Rho-GDP的解離抑制子)結合，抑制RhoA活性，影響PI3K-AKT通路的激活。綜上所述，Gankyrin蛋白通過多種途徑使正常細胞趨向惡化，參與腫瘤的形成過程。

Gankyrin蛋白高表達最早發(fā)現(xiàn)于肝癌組織中[1]。Gankyrin蛋白的表達與腫瘤的肝內轉移與包膜侵犯密切相關，其表達程度會隨著肝癌的發(fā)展逐漸增高。此外，Gankyrin蛋白的測定具有一定的預后判斷參考價值，在Gankyrin高表達的同時，提示了肝癌術后患者的低生存率及高復發(fā)率[7]。近年，Gankyrin蛋白的高表達不僅在肝癌、食管鱗癌[8]、結腸癌[9]等消化系統(tǒng)腫瘤中發(fā)現(xiàn),而且在乳腺癌[10]、子宮內膜癌[11]等消化系統(tǒng)以外的腫瘤組織中的表達也逐漸引起國內外學者的關注，但目前尚未見Gankyrin蛋白在喉鱗癌中表達的相關研究的報道。LI等[12]的研究發(fā)現(xiàn)，在口腔鱗癌中，Gankyrin蛋白的陽性表達在早期即可出現(xiàn)。研究者通過Western-blot和免疫組化的方法，在翻譯水平檢測多種口腔鱗癌組織及細胞系中Gankyrin基因的表達情況，指出Gankyrin基因的異常表達在口腔鱗癌中普遍存在，Gankyrin基因和蛋白表達水平檢測有助于臨床判斷口腔鱗癌的分化程度及發(fā)展階段。這提示，Gankyrin蛋白在與口腔鱗癌相似且關系密切的喉鱗癌組織中也存在高表達的可能，并且具有一定的研究價值與實際臨床意義。本實驗首次運用免疫組織化學及免疫細胞化學的方法,分別對喉鱗癌組織和喉鱗癌Hep-2細胞系中Gankyrin蛋白的表達情況進行檢測，結果顯示，Gankyrin蛋白在喉鱗癌組織中主要表達于細胞核,少量表達于胞質。喉鱗癌組織中Gankyrin蛋白的陽性細胞率(58.5%)明顯高于相應癌旁組織(11.4%)及正常組織(18.1%)(均P<0.01)。喉鱗癌Hep-2細胞系中的實驗結果進一步驗證，在細胞水平上Gankyrin蛋白同樣存在很高的表達率(62.4%)，蛋白的表達與定位也與喉鱗癌組織基本相符。Gankyrin蛋白在喉鱗癌組織中的高表達，提示Gankyrin蛋白可能與喉鱗癌的發(fā)生有關，雖然具體機制有待研究，但為揭示Gankyrin蛋白表達與喉鱗癌間關系的后續(xù)研究提供了參考依據(jù)。

初期，人們通過分析肝癌組織中Gankyrin的表達情況與臨床病理參數(shù)間的關系，探索將Gankyrin的基礎研究應用于臨床工作的可能性。如今，研究者們發(fā)現(xiàn)[13]，Gankyrin蛋白的高表達與多種腫瘤細胞的發(fā)生發(fā)展、臨床表現(xiàn)以及預后情況密切相關，并有人嘗試將Gankyrin作為新的腫瘤標志物運用于臨床，Gankyrin也有望成為新的腫瘤基因治療靶點。喉鱗癌的早期發(fā)現(xiàn)與治療能明顯提高患者的生存率和治愈率，Gankyrin蛋白在喉鱗癌中的高表達提示了其可能在喉癌發(fā)生發(fā)展中扮演重要角色。通過單獨檢測Gankyrin的表達情況或與其他已知喉癌相關基因聯(lián)合檢測，或許可為喉鱗癌的早期診斷、早期干預及預后判斷提供參考。Gankyrin和喉鱗癌病理及臨床分期間的關系是我們進一步研究的方向。

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The experimental study of the expression of Gankyrin proteins in laryngeal carcinoma tissues and cell lines Hep-2

ZHAOXiaotong1,ZHANGYuan2,LIUFangzhou2,LIPeihua3.

(1.GraduateSchool,XuzhouMedicalCollege,Xuzhou221000,China; 2.DepartmentofHeadandNeckSurgery,JiangsuCancerHospital,Nanjing210009,China;3.DepartmentofOtolaryngology,HospitalAffiliatedtoXuzhouMedicalCollege，Xuzhou221000,China)

Corresponding author:LIPeihua,E-mail：Lipeihua000@126.com

Objective To investigate the expression of Gankyrin proteins in laryngeal carcinoma tissues and cell lines Hep-2. Methods The expression of Gankyrin proteins in laryngeal carcinoma tissues ，para- carcinoma tissues(n=24)and normal tissues(n=10)were assessed by immunohistochemical technique，and in cell lines Hep-2 by immunocytochemistry technique.The positive cells were counted and located under the microscope. Results The Gankyrin proteins expressed mainly in the cell nucleus. The expression of Gankyrin protein in laryngeal carcinoma(58.5%) is significantly higher than in para-cacinoma tissues(11.4%) and normal tissues(18.1%),and the difference was statistically significant(P<0.01). Conclusions Gankyrin proteins expressed both in laryngeal carcinoma tissues and Hep-2 cell lines, which give the basic function for the study of Gankyrin in laryngeal carcinoma.

Laryngeal cell carcinoma; Immunohistochemistry; Gankyrin； Tumor marker

221000 江蘇 徐州，徐州醫(yī)學院研究生學院(趙孝通)；210009 江蘇 南京，江蘇省腫瘤醫(yī)院

頭頸外科(張 園，劉方舟)；221000 江蘇 徐州，徐州醫(yī)學院附屬醫(yī)院 耳鼻喉科(李培華)

趙孝通，男，在讀碩士研究生，研究方向：喉癌的基礎與臨床研究，E-mail：sszsxkdb@sina.com

李培華，男，主任醫(yī)師，碩導，研究方向：頭頸部腫瘤的基礎與臨床研究，E-mail：Lipeihua000@126.com

10.3969/j.issn.1674-4136.2016.01.008

1674-4136(2016)01-0026-04

2015-10-13][本文編輯：文 心]