樟樹莖段組培快繁

葉潤燕，童再康，張俊紅，朱玉球（浙江農(nóng)林大學(xué)亞熱帶森林培育國家重點實驗室培育基地，浙江臨安311300）

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樟樹莖段組培快繁

葉潤燕，童再康，張俊紅，朱玉球
（浙江農(nóng)林大學(xué)亞熱帶森林培育國家重點實驗室培育基地，浙江臨安311300）

摘要：以當年生樟樹Cinnamomum camphora帶芽莖段為外植體，研究6-芐基腺膘呤（6-BA）和萘乙酸（NAA）在初代培養(yǎng)和繼代培養(yǎng)過程中對樟樹莖段腋芽及叢生芽誘導(dǎo)增殖的影響。結(jié)果表明：最適腋芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS（Murashige and Skoog）＋1.00 mg·L(－1)6-BA＋（0.01～0.10 mg·L(－1)）NAA。繼代培養(yǎng)時采用正交試驗設(shè)計進行培養(yǎng)基篩選，經(jīng)極差分析和方差分析得知叢生芽發(fā)生率較高的培養(yǎng)基為MS＋1.00 mg·L(－1)6-BA＋0.10 mg·L(－1)NAA，而叢生芽增殖最佳培養(yǎng)基為MS＋（0.50～1.00）mg·L(－1)6-BA。將無菌苗轉(zhuǎn)入最適生根培養(yǎng)基1/2MS＋1.50 mg·L(－1)NAA，生根率可達90%；生根的無菌苗移栽至m（蛭石）∶m（泥炭）為1∶1的混合基質(zhì)中，經(jīng)過15~20 d練苗，95%以上無菌苗均能成活。這一結(jié)果為樟樹優(yōu)良品種的工業(yè)化育苗奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。圖2表5參13

關(guān)鍵詞：森林培育學(xué)；樟樹；叢生芽；無性快繁；組織培養(yǎng)

樟樹Cinnamomum camphora又名香樟，樹型優(yōu)美，適應(yīng)性廣，是傳統(tǒng)的綠化觀賞喬木樹種。同時，樟樹木材品質(zhì)優(yōu)異，用途獨特，屬珍貴用材樹種。然而，對天然資源的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，多數(shù)樟樹樹干分枝較低，出材率不高，只有極少數(shù)優(yōu)良單株的干形通直，分枝高，出材率高。若這些優(yōu)良單株通過有性繁殖其優(yōu)良基因型不能固定，則后代分離嚴重，且多數(shù)劣變［1-2］，因此，通過無性擴繁是固定樟樹優(yōu)良基因型的必然途徑。無性繁殖主要包括扦插和組織培養(yǎng)兩方面，但扦插繁殖受實驗材料和季節(jié)的限制，繁殖系數(shù)較低［3］。組織培養(yǎng)技術(shù)可克服扦插繁殖存在的問題，不受材料和季節(jié)的限制可獲得大量無性系。樟樹莖段組培快繁技術(shù)的研究具有重要的現(xiàn)實意義。據(jù)相關(guān)研究報道［4－7］，6-芐基腺膘呤（6-BA）和萘乙酸（NAA）的不同配比是影響樟樹腋芽誘導(dǎo)率以及叢生芽增殖系數(shù)高低的關(guān)鍵，故如何篩選出叢生芽增殖系數(shù)較高的培養(yǎng)基配比方案，提高樟樹繁殖的效率和效益，已成為樟樹優(yōu)良品種產(chǎn)業(yè)化的關(guān)鍵問題。因此，本研究采用正交試驗設(shè)計，以初代培養(yǎng)獲得的無菌苗為外植體，研究了基本培養(yǎng)基、6-BA和NAA 等3個因素對樟樹叢生芽誘導(dǎo)與增殖的影響，以期獲得樟樹叢生芽增殖最佳之方案。同時探索試管苗生根［8］、練苗與移栽［9］等環(huán)節(jié)，力求得到試管苗移栽高成活率的方法。

1　材料與方法

1.1材料

樟樹外植體莖段均來自于浙江農(nóng)林大學(xué)遺傳學(xué)科種質(zhì)資源苗圃地選育的具有優(yōu)良性狀的個體。

1.2實驗方法

1.2.1培養(yǎng)基針對叢生芽誘導(dǎo)增殖和生根的最佳培養(yǎng)基，設(shè)計了不同植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)配比，包括6-BA和NAA以及3-吲哚丁酸（IBA）的培養(yǎng)基進行篩選。所用基本培養(yǎng)基無特殊說明均為MS（Murashige and Skoog）培養(yǎng)基，添加蔗糖30.00 g·L－1，瓊脂5.50 g·L－1，pH 5.90。莖段和叢生芽數(shù)均為30個·處理－1，接3個·瓶－1，共10瓶，重復(fù)3次·處理－1。培養(yǎng)溫度（25±2）℃，光照強度1 500 lx，光照時間為12 h·d－1。

1.2.2無菌苗的獲得選取當年生半木質(zhì)化、無病蟲害、健壯的樟樹莖段為外植體。進行材料處理時，首先去掉葉片，用漂白粉漂洗10~15 min，在流動的自來水中沖洗1~2 h，拭干水分待用。在無菌室內(nèi)的超凈工作臺上用0.75 kg·L－1乙醇處理30 s，無菌蒸餾水沖洗3次后，1.00 g·L－1升汞滅菌10 min，再用無菌蒸餾水沖洗5~7次，洗去殘余升汞。將消毒后的外植體剪成1.00~1.50 cm長帶1~2個腋芽的莖段，快速接種在添加不同植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)配比的A1~A6培養(yǎng)基中培養(yǎng)1個月。

1.2.3叢生芽的誘導(dǎo)及增殖以無菌苗為外植體，將其剪成1.00~1.50 cm的莖段，接種到叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基B1~B9中培養(yǎng)，1個月后統(tǒng)計叢生芽發(fā)生情況。采用正交試驗設(shè)計，考慮基本培養(yǎng)基、6-BA和NAA等3個因素，3個水平·因素－1，選用L9（34）正交表的1，3和4列，共9種培養(yǎng)基。將樟樹叢生芽切割成3株·叢－1接種在增殖培養(yǎng)基C1~C5中，進行叢生芽增殖試驗，篩選出叢生芽增殖的最佳培養(yǎng)基。

1.2.4生根、練苗與移栽選擇具葉色翠綠、具光澤、薄革質(zhì)、完全展開葉片的高度約3 cm單芽，接種在生根培養(yǎng)基D1~D8中。15 d后統(tǒng)計其生根情況。生根培養(yǎng)時所用基本培養(yǎng)基為1/2MS。當植株的根系長度大于5 cm時，可將組培苗置于大棚內(nèi)進行練苗試驗，設(shè)定0，5，10，15，20和25 d共6個時間段，各個時間段收集20瓶苗。待設(shè)定時間結(jié)束后，將植株從瓶內(nèi)取出，用自來水清洗根部培養(yǎng)基，移栽至m（蛭石）∶m（泥炭）為1∶1的混合基質(zhì)中，統(tǒng)計其成活率。

1.2.5統(tǒng)計分析記錄與統(tǒng)計不同階段莖段產(chǎn)生的腋芽個數(shù)、叢生芽個數(shù)以及生根情況，其中正交試驗結(jié)果采用SPSS統(tǒng)計分析軟件進行極差分析和方差分析。

2　結(jié)果與分析

2.1 6-BA和NAA對樟樹腋芽誘導(dǎo)的影響

不同植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)配比對樟樹莖段的腋芽誘導(dǎo)與生長情況統(tǒng)計結(jié)果見表1。對照組A6在未添加植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)時，腋芽誘導(dǎo)率僅16.67%，外植體褐化率高達83.33%，顯著低于其他組合，表明添加NAA和6-BA對腋芽誘導(dǎo)有顯著影響；A1~A5處理的莖段隨6-BA質(zhì)量濃度和NAA質(zhì)量濃度的增加，誘導(dǎo)率均呈下降趨勢，以A2號即1.00 mg·L－16-BA + 0.01 mg·L－1NAA的誘導(dǎo)率最高，為90%；隨著NAA質(zhì)量濃度增加，畸形芽數(shù)和褐化率均有所增加，但芽的萌發(fā)個數(shù)并不完全隨著NAA的增加而減少，例如，當NAA質(zhì)量濃度為0.01~0.10 mg·L－1時，萌芽個數(shù)從63個增加到75個。綜合分析表明，樟樹腋芽誘導(dǎo)最佳培養(yǎng)基為MS＋1.00 mg·L－16-BA＋（0.01~0.10 mg·L－1）NAA。

表1　不同質(zhì)量濃度NAA和6-BA組合對樟樹腋芽誘導(dǎo)的影響Table 1 Effect of different combinations of NAA and 6-BA on inducing the axillary bud in Cinnamomum camphora

2.2樟樹叢生芽誘導(dǎo)最佳培養(yǎng)基篩選

采用正交試驗設(shè)計研究基本培養(yǎng)基、6-BA和NAA對叢生芽誘導(dǎo)率的影響。9種處理組合獲得的叢生芽誘導(dǎo)率經(jīng)極差分析（表2）后表明，6-BA對樟樹叢生芽誘導(dǎo)的影響最顯著，R值高達105.13，其次為基本培養(yǎng)基，R值為63.47，而NAA的影響明顯小于前2個因素，R值僅為19.77。方差分析（表3）表明：不同基本培養(yǎng)基和6-BA對叢生芽誘導(dǎo)存在顯著差異，其顯著性值為P＜0.01，即2個因素對叢生芽誘導(dǎo)的影響是極顯著的，而NAA對叢生芽形成存在顯著影響（P＝0.02），但未達極顯著水平。最小顯著差法（LSD）多重比較結(jié)果表明，叢生芽誘導(dǎo)的最適基本培養(yǎng)基為MS＞1/2MS＞B5，且三者間存在顯著差異；1.00 mg·L-16-BA對叢生芽誘導(dǎo)的影響最大，0.50 mg·L-16-BA影響次之，0.10 mg·L-16-BA影響最小，且三者之間存在極顯著差異；而0.10 mg·L-1NAA的影響最大，0 mg·L-1NAA影響次之，0.01 mg·L-1NAA影響最小，其中，0 mg·L－1和0.01 mg·L－1無顯著差異，而1.00 mg·L－1和其余2個質(zhì)量濃度之間存在顯著差異。綜合分析表明，樟樹叢生芽誘導(dǎo)率最佳培養(yǎng)基為MS＋1.00 mg·L－16-BA＋0.10 mg·L－1NAA。

表2　樟樹叢生芽誘導(dǎo)率極差分析Table 2 Range analysis for the induce of multiple shoots in C.camphora

表3　樟樹叢生芽誘導(dǎo)率方差分析Table 3 Variance analysis for the induce of multiple shoots in C.camphora

2.3 6-BA，NAA對樟樹叢生芽增殖的影響

不同植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的質(zhì)量濃度組合對樟樹叢生芽增殖的影響見表4。5種培養(yǎng)基都使叢生芽成活均在96%以上，但叢生芽的增殖系數(shù)差異很大。當6-BA質(zhì)量濃度在0.20~1.00 mg·L－1時，隨著6-BA質(zhì)量濃度升高，叢生芽的增殖系數(shù)顯著提高，當6-BA質(zhì)量濃度達到1.00 mg·L－1時，叢生芽增殖系數(shù)達到13.10，且芽苗生長正常。叢生芽增殖對NAA比較敏感，當NAA質(zhì)量濃度達到0.10 mg·L－1時，出現(xiàn)愈合組織和畸形芽；當質(zhì)量濃度高達0.20 mg·L－1時愈合化嚴重，影響芽苗的正常生長，且易形成畸形苗。因此，叢生芽增殖的最佳培養(yǎng)基為MS＋（0.50~ 1.00 mg·L－1）6-BA。

表4　不同質(zhì)量濃度6-BA和NAA對叢生芽增殖的影響Table 4 Effect of the different combinations of NAA and 6-BA on the proliferation of multiple shoots

2.4 NAA和IBA對試管苗生根的影響

不同植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)濃度組合對樟樹試管苗生根的影響見表5。相同質(zhì)量濃度的NAA和IBA對試管苗生根的影響不同，NAA比IBA更好地促進樟樹試管苗生根。D3組合即NAA為1.50 mg·L－1時生根率高達90%，平均根數(shù)為7.23根·株－1，達到實驗組合中最高水平；隨著NAA質(zhì)量濃度升高，平均根長變短，根變細且出現(xiàn)愈合化，D4組合即NAA質(zhì)量濃度達到2.0 mg·L－1時平均根長僅3.11 cm，根細長，不利于移栽后的成活；D3組合中根生長狀況雖不如D1和D2組合，但其根長（4.31 cm）與D2（4.59 cm）差異不大，且其生根率和平均根數(shù)都遠高于其余組合。因此，認為樟樹試管苗的最適生根培養(yǎng)基為1/2MS＋1.50 mg·L－1NAA。

表5　不同質(zhì)量濃度NAA和IBA對樟樹試管苗生根的影響Table 5 Effect of the different combinations of NAA and IBA on the rooting of test-tube plantlet

2.5練苗時間對試驗苗移栽成活率的影響

研究不同的練苗時間對樟樹無菌苗成活率的影響見圖1。發(fā)現(xiàn)隨著練苗時間的增加，無菌苗移栽成活率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。其中，無菌苗的成活率最高時的練苗時間為15 d，成活率接近99.00%，隨著練苗時間繼續(xù)增加成活率開始下降，練苗20 d時下降至97.32%，這說明最佳的練苗時間應(yīng)在15~20 d之內(nèi)。練苗0 d或5 d時，植株的成活率均很低，不足60.00%，這說明練苗時間對樟樹移栽成活率的影響較大，選擇合適的練苗時間能有效提高試驗苗移栽的成活率。

圖1　練苗時間對試管苗成活率的影響Figure 1　Effect of the time for hardening-seedlings on the survival rate of the test-tube plantlet

3　小結(jié)與討論

本研究選取了具有優(yōu)良性狀的樟樹從腋芽誘導(dǎo)、叢生芽形成及增殖、試管苗生根到練苗移栽（圖2）4個方面進行樟樹莖段組培快繁技術(shù)的研究，得到最適腋芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS＋1.00 mg·L－16-BA＋（0.01~0.10 mg·L－1）NAA。采用正交試驗設(shè)計分析得到叢生芽誘導(dǎo)最適培養(yǎng)基為MS＋1.00 mg·L－16-BA＋0.10 mg·L－1NAA而最佳增殖培養(yǎng)基則為MS＋（0.50~1.00 mg·L－1）6-BA。將無菌苗轉(zhuǎn)入最適生根培養(yǎng)基1/2MS＋1.50 mg·L－1NAA，生根率可達90%，然后將生根的無菌苗移栽至m（蛭石）∶m（泥炭）為1∶1的混合基質(zhì)中，經(jīng)過15~20 d練苗，95%以上無菌苗均能成活。

圖2　樟樹叢生芽組織培養(yǎng)快繁不同階段Figure 2 Different stages of mass propagation for multiple shoots in Cinnamomum camphora

6-BA和NAA是木本植物叢生芽快繁［10－13］中用途最廣、價格也較便宜的2種植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)。本研究即采用該2種植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)進行腋芽誘導(dǎo)、叢生芽誘導(dǎo)和增殖，力求得到樟樹叢生芽高效增殖培養(yǎng)基方案。經(jīng)試驗發(fā)現(xiàn)6-BA對樟樹不定芽誘導(dǎo)具有突出的促進作用，在一定范圍內(nèi)，產(chǎn)生的不定芽數(shù)量隨6-BA質(zhì)量濃度的增加而增加［4］，而NAA在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)可促進叢生芽誘導(dǎo)，但因其易產(chǎn)生愈合組織而影響苗生長，因此，在叢生芽誘導(dǎo)形成后可適量降低質(zhì)量濃度甚至去除NAA，更利于叢生芽增殖分化。本研究中在樟樹叢生芽增殖培養(yǎng)基中去除了NAA，其增殖系數(shù)可達到13.10，且芽苗生長狀況良好無畸形芽出現(xiàn)。因此，在不同階段合理利用NAA是木本植物提高叢生芽誘導(dǎo)率和增殖系數(shù)的關(guān)鍵因素。移栽組培苗是樟樹組培的最后一個環(huán)節(jié)，也是關(guān)系成敗的重要環(huán)節(jié)之一，直接影響組培苗的生長和成活率。研究發(fā)現(xiàn)練苗時間對樟樹組培苗移栽成活率的影響較大，未經(jīng)過練苗的成活率僅為32.81%，而經(jīng)過15~20 d則可達到97.00%以上，且移栽后的幼苗生命力旺盛，長勢良好。所以提高叢生芽增殖系數(shù)和移栽成活率，能有效提高人工快繁效率，為樟樹優(yōu)良品種的產(chǎn)業(yè)化栽培提供實驗基礎(chǔ)。

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Tissue culture and rapid propagation for stems of Cinnamomum camphora

YE Runyan,TONG Zaikang,ZHANG Junhong,ZHU Yuqiu
（The Nurturing Station for the State Key Laboratory of Subtropical Silviculture,Zhejiang A &F University,Lin’an 311300,Zhejiang,China）

Abstract:To study the effect of naphthalene-acetic acid（NAA）and 6-benzylaminopurine 6-BA on the induction and multiplication of multiple shoots for Cinnamomum camphora during the process of primary culture and subculture,stems with axillary buds which sprouted at the beginning of spring were used as explants.To select the optimum medium for subculture,an orthogonal experiment was designed,and an extreme difference analysis and variance analysis（ANOVA）was used.Results showed that the optimal medium for inducing axillary buds was Murashige and Skoog（MS）+ 1.00 mg·L(－1)6-BA +（0.01－0.10 mg·L(－1)）NAA.The orthogonal experiment and ANOVA showed that the best medium for formation of multiple shoots was MS + 1.00 mg·L(－1)6-BA + 0.10 mg·L(－1)NAA,and the optimum medium for proliferation of multiple shoots was MS + 0.50－1.00 mg·L(－1)6-BA.After the aseptic seedling was transferred to the optimum rooting medium（1/2MS + 1.50 mg·L(－1)NAA）,the rooting rate reached above 90%.After 15－20 d of hardening,seedlings were transplanted to a mixed matrix with equal vermiculite and peat where the survival rate was greater than 95%.Thus,an efficient breeding technology for C.camphora was studied laying a technical foundation for industrialization of improved varieties.［Ch,2 fig.5 tab.13 ref.］

Key words:silviculture;Cinnamomum camphora;clustered shoots;asexual rapid propagation;tissue culture

作者簡介：葉潤燕，從事竹木育種研究。E-mail：yerunyan@126.com。通信作者：朱玉球，高級實驗師，從事竹木育種研究。E-mail：yqzhu@zafu.edu.cn

基金項目：浙江省林木種苗產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新團隊資助項目（2009R50035）；浙江省竹木育種重大專項（2012C12908-7）；浙江農(nóng)林大學(xué)研究生科研創(chuàng)新基金資助項目（3122013240236）

收稿日期：2015-01-29；修回日期：2015-06-04

doi:10.11833/j.issn.2095-0756.2016.01.024

中圖分類號：S723.1；Q945.5

文獻標志碼：A

文章編號：2095-0756（2016）01-0177-06