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    RAC1通過調(diào)節(jié)緊密連接蛋白1分布影響卵巢癌細(xì)胞的遷移和侵襲

    2020-09-22 02:49:48張璐玢鄒雪琴張鰍丹高淑君劉雪潘玲麗趙楊靜梁秀婷王薈朱彥玲邵啟祥
    關(guān)鍵詞:劃痕細(xì)胞系卵巢癌

    張璐玢,鄒雪琴,張鰍丹,高淑君,劉雪,潘玲麗,趙楊靜,梁秀婷,王薈,3,朱彥玲,邵啟祥,3

    (1. 江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院,江蘇 鎮(zhèn)江 212013; 2. 江蘇大學(xué)附屬徐州醫(yī)院婦產(chǎn)科,江蘇 徐州 221005; 3. 江蘇省檢驗醫(yī)學(xué)重點實驗室,江蘇 鎮(zhèn)江 212013)

    卵巢上皮細(xì)胞癌(epithelial ovarian cancer,EOC)是高死亡率的婦科惡性腫瘤,在癌癥早期常迅速轉(zhuǎn)移至腹膜導(dǎo)致跨體腔轉(zhuǎn)移,嚴(yán)重影響女性的身心健康[1]。小GTP酶Rac1(Rac family small GTPase 1,RAC1)是Rho蛋白家族成員之一,通過在活性狀態(tài)GTP-RAC1和非活性狀態(tài)GDP-RAC1間相互轉(zhuǎn)換,在腫瘤中發(fā)揮重要的分子開關(guān)作用[2]。作為細(xì)胞骨架的調(diào)節(jié)因子,RAC1可調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架重塑、黏附、遷移、侵襲和基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控等[3]。研究發(fā)現(xiàn)[4],RAC1在EOC患者組織標(biāo)本和細(xì)胞系中高表達(dá),其表達(dá)水平與血清CA125、腫瘤病理分型和術(shù)后殘余腫瘤大小呈正相關(guān),并預(yù)示患者不良預(yù)后,還通過上調(diào)波形蛋白和下調(diào)E-鈣黏蛋白促進上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial to mesenchymal transition,EMT)。

    EMT是上皮細(xì)胞失去頂端-基底極性和細(xì)胞間黏附,發(fā)生間質(zhì)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)變的過程,常伴隨著上皮細(xì)胞間連接減弱、遷移和侵襲能力增加[5]。緊密連接蛋白1(tight junction protein 1,TJP1)是EMT過程中上皮樣細(xì)胞的標(biāo)志物,是最早被鑒定出的細(xì)胞緊密連接相關(guān)蛋白,敲除TJP1會破壞細(xì)胞間的緊密連接[6]。鑒于TJP1是參與調(diào)控細(xì)胞EMT的重要分子,與腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲密切相關(guān),本研究通過構(gòu)建穩(wěn)定敲減RAC1的卵巢癌細(xì)胞系,觀察敲減RAC1對卵巢癌細(xì)胞遷移和侵襲的影響,并探究RAC1對TJP1表達(dá)和分布的調(diào)節(jié)作用,為闡明卵巢癌轉(zhuǎn)移的分子機制奠定基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 細(xì)胞株 人卵巢癌細(xì)胞系OVCAR3和人胚胎腎細(xì)胞系HEK-293T由江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院周小明教授惠贈;人卵巢癌細(xì)胞系SKOV3由江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院盧小東教授惠贈;所有細(xì)胞均采用含10% 胎牛血清、100 U/mL 青霉素和100 U/mL鏈霉素的高糖DMEM,置5% CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)、傳代。

    1.1.2 主要試劑 DMEM和胎牛血清(美國Gibco公司);嘌呤霉素和聚凝胺(上海YEASEN公司);限制性內(nèi)切酶AgeⅠ、EcoRⅠ、NcoⅠ和T4DNA連接酶(美國NEB公司);PCR產(chǎn)物純化、膠回收和質(zhì)粒抽提試劑盒(上海生工公司);RIPA裂解液和Alexa Fluor 488標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體(上海碧云天公司);鼠抗人RAC1抗體、基質(zhì)膠和Transwell小室(美國BD公司);兔抗人TJP1抗體(美國Proteintech公司);鼠抗人GAPDH抗體(南京貝迪公司);HRP偶聯(lián)的抗小鼠/兔IgG(美國Cell Signal Technology公司)。

    1.2 方法

    1.2.1 建立穩(wěn)定敲減RAC1基因的卵巢癌細(xì)胞系

    1.2.1.1RAC1shRNA目的片段的獲得 在美國Sigma Aldrich公司網(wǎng)站(https:∥www.sigmaaldrich.com)檢索獲得一對經(jīng)過驗證的人RAC1shRNA序列,正義鏈為5′-CCGGCGCAAACAGATGTGTTCTTAACTCGAGTTAAGAACACATCTGTTTGCGTTTTTG-3′,反義鏈為5′-AATTCAAAAACGCAAACAGATGTGTTCTTAACTCGAGTTAAGAACACATCTGTTTGCG-3′,由上海生工生物工程公司合成。按照下述體系和條件退火:10×NEB 緩沖液 5 μL,正義鏈和反義鏈各5 μL,無核酸酶水35 μL,95 ℃變性4 min,70 ℃退火10 min,緩慢降至室溫。

    1.2.1.2 構(gòu)建RAC1shRNA慢病毒載體 將pLKO.1-puro慢病毒載體用AgeⅠ和EcoRⅠ酶切,酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳,切膠并回收7 kb處條帶。將目的片段與膠回收產(chǎn)物用T4DNA連接酶連接,導(dǎo)入DH5α感受態(tài)細(xì)胞擴增后,涂布于氨芐抗性的瓊脂板上,挑取單個菌落擴增并提取質(zhì)粒。

    1.2.1.3 慢病毒包裝和感染靶細(xì)胞 將RAC1shRNA慢病毒載體和輔助質(zhì)粒(psPAX2和pMD2.G)共轉(zhuǎn)染對數(shù)生長期的HEK-293T細(xì)胞,轉(zhuǎn)染后48 h和72 h收集上清液,通過0.45 μm濾菌器,-80 ℃保存?zhèn)溆?。?dāng)OVCAR3和SKOV3細(xì)胞密度達(dá)到40%時,將病毒液和培養(yǎng)基等比例混合并添加8 mg/L聚凝胺增強病毒感染力,反復(fù)感染細(xì)胞2次后利用嘌呤霉素篩選獲得穩(wěn)定敲減RAC1的卵巢癌細(xì)胞株。

    1.2.2 蛋白質(zhì)印跡檢測RAC1敲減后卵巢癌細(xì)胞的RAC1和TJP1蛋白表達(dá) 細(xì)胞用RIPA裂解后提取總蛋白,蛋白經(jīng)70 V SDS-PAGE電泳2 h、350 mA轉(zhuǎn)膜90 min和5% BSA封閉1 h后,按1 ∶1 000的比例用封閉液稀釋GAPDH、RAC1、TJP1抗體,4 ℃孵育過夜。次日洗膜后孵育對應(yīng)的二抗(TBST稀釋,1 ∶10 000),采用ECL化學(xué)發(fā)光自顯影,利用Image J軟件將目的條帶灰度數(shù)值化,并與內(nèi)參的灰度值作歸一化處理,制作直方圖。

    1.2.3 劃痕實驗觀察RAC1敲減后卵巢癌細(xì)胞的遷移能力 將對數(shù)生長期的卵巢癌細(xì)胞接種于6孔板中,細(xì)胞密度達(dá)95%時,用Tip頭垂直于6孔板劃痕,PBS輕輕洗滌2次后加入無血清DMEM繼續(xù)培養(yǎng),0 h和24 h后在倒置顯微鏡下對劃痕進行拍照。計算公式為:細(xì)胞相對遷移率=[實驗組(0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度)/對照組(0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度)]×100%。

    1.2.4 基質(zhì)膠侵襲實驗觀察RAC1敲減后卵巢癌細(xì)胞的侵襲能力 按照3 ∶100的比例混合基質(zhì)膠和DMEM,將100 μL混合液滴入小室中央,放置細(xì)胞培養(yǎng)箱中3 h。下室加入800 μL完全培養(yǎng)基,上室加入200 μL含(4~8)×104個對數(shù)生長期卵巢癌細(xì)胞的DMEM。培養(yǎng)24 h后取出小室,PBS洗滌2次,甲醇固定30 min,PBS洗滌2次。用棉球輕輕拭去小室上層細(xì)胞,結(jié)晶紫染色15 min,PBS洗滌2次,吹干后顯微鏡觀察并拍照。

    1.2.5 免疫熒光染色觀察RAC1敲減后卵巢癌細(xì)胞TJP1蛋白的分布 將對數(shù)生長期的卵巢癌細(xì)胞接種于細(xì)胞玻片,細(xì)胞密度達(dá)50%時用4%多聚甲醛固定,PBS洗3次。0.5% Triton-X破膜,PBS洗3次。5% BSA封閉1 h,TJP1抗體孵育過夜。次日,PBS洗滌后孵育熒光二抗1 h,PBS洗3次。DAPI染核5 min,PBS洗3次。取出爬片倒置于滴加抗熒光淬滅劑的載玻片上,透明甲油封片,利用共聚焦熒光顯微成像系統(tǒng)拍照。

    1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

    所有實驗均重復(fù)3次,應(yīng)用GraphPad Prism 5.0軟件進行數(shù)據(jù)分析和作圖。兩組獨立樣本間的比較,如數(shù)據(jù)服從正態(tài)分布則使用t檢驗,如不服從正態(tài)分布則使用非參數(shù)t檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 成功構(gòu)建pLKO.1-puro RAC1 shRNA載體

    構(gòu)建的RAC1shRNA載體轉(zhuǎn)化后,隨機挑取6個菌落擴增后提取質(zhì)粒進行酶切鑒定。瓊脂糖凝膠電泳顯示第1、5和6號樣本酶切產(chǎn)物條帶位置正確(約5 000 bp和2 000 bp),見圖1A。選取1號樣本測序發(fā)現(xiàn)載體中插入的序列與合成的RAC1shRNA序列一致,見圖1B,說明成功構(gòu)建pLKO.1-puroRAC1shRNA載體。

    A:RAC1 shRNA載體酶切電泳圖,M:DNA標(biāo)準(zhǔn)參照物,1~6:6個菌落分別對應(yīng)的質(zhì)粒樣本;B:RAC1 shRNA載體中插入序列測序結(jié)果

    2.2 慢病毒感染后卵巢癌細(xì)胞中RAC1蛋白表達(dá)下降

    蛋白質(zhì)印跡結(jié)果顯示,與空載對照組相比,感染RAC1shRNA慢病毒的OVCAR3和SKOV3細(xì)胞中RAC1蛋白表達(dá)水平明顯下降(t值分別為8.37和8.90,P<0.05),見圖2。證明RAC1shRNA慢病毒感染的OVCAR3和SKOV3細(xì)胞成功敲減RAC1基因。

    2.3 穩(wěn)定敲減RAC1基因后卵巢癌細(xì)胞遷移能力降低

    細(xì)胞劃痕實驗顯示,穩(wěn)定敲減RAC1的OVCAR3和SKOV3細(xì)胞遷移能力較空載對照組明顯降低(t值分別為40.17和41.76,P<0.01),見圖3。說明穩(wěn)定敲減RAC1基因能顯著抑制卵巢癌細(xì)胞的遷移能力。

    2.4 穩(wěn)定敲減RAC1基因后卵巢癌細(xì)胞侵襲能力下降

    基質(zhì)膠侵襲實驗顯示,與空載對照組相比,穩(wěn)定敲減RAC1的OVCAR3和SKOV3細(xì)胞在24 h內(nèi)穿過基質(zhì)膠的細(xì)胞數(shù)量明顯減少(t值分別為17.06和8.50,P<0.01),見圖4。說明穩(wěn)定敲減RAC1基因能抑制卵巢癌細(xì)胞的侵襲能力。

    2.5 穩(wěn)定敲減RAC1基因后卵巢癌細(xì)胞中TJP1蛋白的表達(dá)和分布

    蛋白質(zhì)印跡結(jié)果顯示,穩(wěn)定敲減RAC1的OVCAR3和SKOV3細(xì)胞中TJP1蛋白表達(dá)量較空載對照組無顯著差異(P>0.05),見圖5。說明RAC1不影響卵巢癌細(xì)胞中TJP1的表達(dá)。

    免疫熒光染色發(fā)現(xiàn),空載對照組OVCAR3和SKOV3細(xì)胞中TJP1蛋白主要分布在細(xì)胞質(zhì),而細(xì)胞間較少。穩(wěn)定敲減RAC1后細(xì)胞形態(tài)明顯變小,TJP1蛋白由胞質(zhì)遷移至胞膜附近,集中在細(xì)胞間接觸處,排列呈致密的毛刺樣,細(xì)胞間連接更加緊密,見圖6。結(jié)果表明,卵巢癌細(xì)胞中穩(wěn)定敲減RAC1并不影響TJP1蛋白的表達(dá),但可調(diào)節(jié)TJP1蛋白在細(xì)胞中的分布,使細(xì)胞間緊密連接加強。

    a:P<0.05,與對照組比較

    標(biāo)尺為200 μm;a:P<0.01,與對照組比較

    標(biāo)尺為200 μm;a:P<0.01,與對照組比較

    3 討論

    隨著手術(shù)、放化療、分子靶向藥物和腫瘤免疫治療的不斷發(fā)展,許多腫瘤患者的生存時間都得到了不同程度的延長,但卵巢癌患者5年生存率仍低于40%,主要原因之一是卵巢癌極易在腹腔中播散轉(zhuǎn)移[7],而惡性腫瘤難以治愈的根本原因就是腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移。作為小GTP結(jié)合蛋白的Ras超家族成員,RAC1能調(diào)控細(xì)胞生長、骨架重組和激活蛋白激酶。RAC1可激活WASP家族富含脯氨酸同源蛋白(WAVE)調(diào)控復(fù)合物和蛋白激酶A,加快肌動蛋白聚合和板狀偽足的形成,從而促進細(xì)胞遷移和侵襲[8-9]。Fang等[10]發(fā)現(xiàn)RAC1能激活MEK1/2和Src信號通路使卵巢癌細(xì)胞獲得間質(zhì)表型,促進細(xì)胞的遷移和侵襲特性。RAC1還可通過ROS/MAPK/AP-1和PAK/p38/MMP-2信號軸抑制卵巢癌細(xì)胞中基質(zhì)金屬蛋白酶的產(chǎn)生,促進細(xì)胞外基質(zhì)的重塑和降解,建立和維持鈣黏蛋白和連環(huán)蛋白介導(dǎo)的上皮細(xì)胞間黏附[11-12]。本研究結(jié)果表明穩(wěn)定敲減RAC1能顯著抑制卵巢癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力,說明RAC1是參與調(diào)控卵巢癌轉(zhuǎn)移的重要分子。

    圖5 蛋白質(zhì)印跡檢測RAC1敲減后卵巢癌細(xì)胞TJP1蛋白表達(dá)

    箭頭標(biāo)注為TJP1集中分布的位置,標(biāo)尺為25 μm

    TJP1作為調(diào)控細(xì)胞緊密連接的關(guān)鍵因子,具有連接細(xì)胞間屏障和調(diào)節(jié)肌動蛋白的作用。TJP1可以增強細(xì)胞間連接,抑制腫瘤細(xì)胞從原發(fā)部位解離,減少對周圍組織的侵襲和轉(zhuǎn)移[13]。乳腺癌、結(jié)直腸癌和肝細(xì)胞癌中TJP1表達(dá)下調(diào),會促進腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲[14-16]。因此,TJP1與腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲特性密切相關(guān)。此外,我們的前期研究也發(fā)現(xiàn)TJP1與卵巢癌細(xì)胞遷移侵襲的抑制密切相關(guān)[17],但其調(diào)控機制尚未闡明,因此我們試圖探討RAC1是否通過TJP1調(diào)控卵巢癌細(xì)胞的遷移和侵襲。結(jié)果發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定敲減RAC1的卵巢癌細(xì)胞中TJP1蛋白表達(dá)并未上調(diào),但是免疫熒光染色顯示TJP1的分布由胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至胞膜,在細(xì)胞間連接處顯著聚集,導(dǎo)致卵巢癌細(xì)胞與細(xì)胞間TJP1表達(dá)相對增加,并伴隨著細(xì)胞間緊密連接加強和細(xì)胞體積縮小,這些變化都會降低細(xì)胞的遷移和侵襲能力。因此,我們推測RAC1可能是通過調(diào)節(jié)卵巢癌細(xì)胞中TJP1蛋白的分布從而調(diào)控腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移潛能。一些研究報道也佐證了這一結(jié)果,Knezevic等[18]用血小板活化因子刺激HUVEC細(xì)胞后,GTP-RAC1被激活,全細(xì)胞裂解液中TJP1表達(dá)量未發(fā)生改變,但是TJP1在近胞膜處的閉合帶狀結(jié)構(gòu)出現(xiàn)斷裂甚至消失。Kleeff等[19]報道TJP1在細(xì)胞膜上的分布與細(xì)胞的遷移和侵襲能力相關(guān)。1-磷酸鞘氨醇可依賴于皮層蛋白(cortactin)將TJP1轉(zhuǎn)運至片狀偽足,調(diào)節(jié)細(xì)胞的趨化、遷移和擴散[6]。這些調(diào)控為TJP1從胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至胞膜提供了可能。

    綜上所述,本研究結(jié)果表明卵巢癌細(xì)胞中穩(wěn)定敲減RAC1可能通過影響TJP1蛋白的細(xì)胞內(nèi)分布,增強細(xì)胞間緊密連接,從而抑制細(xì)胞遷移和侵襲。這為探尋卵巢癌轉(zhuǎn)移的調(diào)控機制和尋找抑制轉(zhuǎn)移的分子靶點提供了實驗依據(jù),但RAC1調(diào)控TJP1分布的具體機制有待于進一步研究。

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